elektroforesis gel agarosa
TRANSCRIPT
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
Oleh:
Nama : Ariani Sukma DewiNIM : B1J010224Kelompok : 6Rombongan : IIIAsisten : Nur Cahyati
LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO
2012
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk
hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk
dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis
gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar
teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-
metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau
immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis
dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel.
Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel
dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran
listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran
besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat
melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis
selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti Ethidium
yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum elektroforesis agarosa ini adalah dapat melakukan
elektroforesis gel agarosa.
II. MATERI DAN METODE
A. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu gelas ukur, labu erlenmeyer,
tabung mikrosentifuge, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya,
kertas parafilm, seperangkat alat elektrifororesis, UV trasiluminator, dan kamera
digital .
Bahan yang digunakan yaitu sampel DNA kromosom buah dan bakteri,
agarosa, larutan buffer TAE 50x, akuades, loading dye 6x, dan larutan Etidium
Bromid (EtBr).
B. Metode
1. Dibuat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara dicampurkan 5 ml TAE
50x ke dalam 245 ml akuades.
2. Dibuat gel agarosa 1% dengan cara ditimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan
ke dalam buffer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan
hingga larut sempurna.
3. Disiapkan baki gel agarosa, dilekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa.
4. Dipasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosadengan
posisi hamper menyentuh dasar baki.
5. Diperiksa suhu larutan agarosa sampai hangat-hangat kuku, ditambahkan 1µl
etidium bromid.
6. Dihomogenkan larutan agarosa, kemudian dituangkan ke dalam baki gel
agarosa. Dibiarkan hingga padat.
7. Diambil sisir dengan hati-hati dan dilepaskan selotip dari ujung baki.
8. Dimasukkan baki yang berisi agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang
telah diisi larutan buffer TAE 1x.
9. Dimasukkan 12 µl sampel DNA buah dan bakteri ditambahkan loading dye
6x dengan perbandingan 2: 8 untuk bakteri dan 4 : 8 untuk buah ke dalam
sumuran gel agarosa yang sebelumnya telah dihomogenkan antara loading
dye dan smapel DNA.
10. Dihubungkan tangki elektroforesis dengan power supply sesuai kutub yang
ada dalam tangki dan diatur waktu running untuk V=100V, mA= 400 mA,
dan waktu 30 menit.
11. Setelah waktu running selesai, gel diambil dan direndam dalam larutan EtBr
selama 30 menit.
12. Diamati dalam UV transiluminator.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Gambar hasil pengamatan gel agarosa
Gambar gel agarosa setelah divisualisasi
B. Pembahasan
Praktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa
kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik,
serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak
dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna
biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna
orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi
elektroforesis gel agarosa menunjukkan pergerakan ke arah positif. Hal ini sesuai
dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya
berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH netral
dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis
dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke
kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan
gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat
memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat
dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan
membentuk gelatin yang padat (Ripani, 2010).
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada
pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik
dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut
akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula
pada bentuk molekulnya. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan
molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda
dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada
kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga
pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai
(Sumitro et al., 1996).
Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan
elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari
kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas
zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai
fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel
dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel
berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media
(Fatchiyah, 2006).
Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul
bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan
listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid.
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan
elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara
vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan
urutan DNA (sekuensing) (Sumitro, 1996).
Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur
yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus
listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak
ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik
dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan
bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan
fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka
ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen
pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV.
Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita
DNA standar (Sambbrook, 1989).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan
etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di
dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet
(Fatchiyah, 2006).
Elektroforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi
dan mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis
dan pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat
sensitif dan tidak memerlukan radioisotop atau ultrasentrifugasi. Selanjutnya,
untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarosa
digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah,
seperti intercalating agent etidium bromide (EtBr). Setelah elektroforesis, gel
diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit (Gautom, 1997). Hanya
sedikit DNA dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada
media UV-transilluminator (Sambrook et al, 1989).
Menurut Ripani (2010) fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam
praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :
Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam
larutan sebagai penghantar listrik.
Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.
Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela
basa nukleotida.
UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel
agarosa.
Aquades sebagai pelarut
Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa
TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH
Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram
EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA
Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa
Tangki elektroforesis untuk running DNA
Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan
loading dye
Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading
dye
Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat
merusak DNA
Menurut Atang (2007) hubungan antara berat molekul DNA dengan
kerapatan agarosa terhadap laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk
kerangka-kerangka atau lubang-lubang yang kompleks untuk di lewati molekul
DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju
migrasinya, sebaliknya makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju
migrasinya. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat
dipisahkan. Jika sumuran gel agarosa menyentuh dasar baki tempat pembuatan gel
agarosa maka DNA tidak dapat melakukan migrasi.
DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan
sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari
pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen
ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik
diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan
berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda
melalui gel (Der Lee, 2011).
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa :
1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
2. Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
3. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA tidak terfragmentasi secara
sempurna. Hal ini disebabkan oleh berbagai faktor diantaranya kemungkinan
DNA mengalami kerusakan, penyimpanan DNA hasil PCR yang terlampau
lama, maupun pemotongan yang kurang sempurna pada saat melakukan PCR,
hingga kesalahan pada saat memasukkan DNA ke dalam sumuran.
B. Saran
Saran yang dapat diberikan pada praktikum ini adalah pada saat
memasukkan sampel DNA kedalam sumuran harus secara hati-hati agar tidak
menyebar keluar sumuran.
DAFTAR REFERENSI
Atang. 2007. Pengenalan Agarose Gel Electrophoresis. Universitas Negeri Lampung, Bandar Lampung.
Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, 523-528
Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang
Gautom, Romesh K. 1997. Rapid Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Typing of Escherichia coli O157:H7 and Other Gram-Negative Organisms in 1 Day. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 11: 2977–2980
Ripani, M.. 2010. Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan (TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. KursusTeknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPAUniversitas Brawijaya. Malang