UNIVERSITI PUTRA MALAYSIA

KAJIAN KESESUAIAN POLI(2-HIDROKSIETIL METAKRILAT-ko-METIL HETAKRILAT) SEBAGAI PENYOKONG PENYEKATGERAKAN LIPASE

NORHAIZAN BINTI MOHD. ESA

FSAS 1996 9

KAJIAN KESESUAIAN POLI(2-HIDROKSIETIL HETAKRILAT-ko-METIL

HETAKRILAT) SEBAGAI PENYOKONG PENYEKATGERAKAN LIPASE

Oleh

NORHAI ZAN BINT I MOHD . ESA

Tes i s ini dikemukakan bagi memenuhi keperluan I j azah Master Sains , di Faku l t i Sa ins dan Pengaj i an Alam Sekitar

Univer s i t i Pe rtanian Malaysia

Jun , 1996

PENGHARGAAN

Bersyukur ke hadrat A l l ah Subhanal l ahuwataala kerana dengan

l impahan rahmat, kei z i nan dan ketabahan yang diberikanNya, maka

dapat saya menyemp urnakan tesis ini bagi prog ram Mas ter s a ya .

T e r l e b i h d a hu l u se tin g g i P e nghargaan dan Terima Kas i h y ang

t idak terhingga kepada Pengerusi Jawatan Kuasa Penyel i aan saya ,

Prof . Dr . Abu Ba k a r S a l l e h a t a s b i mb i ngan, dorong a n , k a t a-kat a

perangs ang dan nas ihat d i dalam menj ayakan proj ek ini, j uga kepada

D r . M a n s o r H j . Ahmad, Pro f . Madya Dr . Wan Mohd . Z i n Wan Yunu s ,

Prof . Madya Dr . Mahi ran Basri dan Prof . Madya Dr . Che Nyonya Abdul

Razak .

Ti dak ketinggalan j uga penghargaan ini di rakamkan kepada Kak

Yati , Enci k Kamal di Jaba tan Kimia, ternan-ternan seperj u angan Yam,

Ri z a l , Kak Nab, Kak Fari d , Enc ik Guna dan Roi la yang begitu banyak

membantu dan membe rikan nasihat serta tunj u k aj ar yang amat ber­

harga te rut amanya dari segi teknika l .

Akh i r seka l i kepada Kak Nor, Dr . Kha ti j ah Yusoff yang sering

memb e r ikan gal akan, semua adik-adik di Makmal Bakteriologi 1 4 0 ,

pensya rah dan s emua kaki tangan di Jabatan Biokimia dan Mikrob iologi

yang t e r l ibat secara langsung atau t idak . Jasa kalian akan t etap

d i kenang hi ngga k e akhi r h a y a t , hanya A l l a h s ahaj a yang dap a t

memb a la snya . Buat ke l u a rga yang tersayang dan memahami, terima

kasih atas doa, dorongan dan galakan yang dibe r i .

i i i

lSI KANDUNGAN

mukasurat

PENGHARGAAN • • • • • • • • • • • • • • . • • . • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • . . • • • • • • • • • • • • • i i i

SENARAI JADUAL • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • . • . . • . . • • • • • • • • • • • • • • • • v i i

SENARAI RAJAH • • • • • • . • • • . • • • • • • • • • • • • • • . • • . • • . . • • . • • • • • • • • • . . • • • • v i i i

SENARAI SINGKATAN • • • • . . . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • . • • • • • . • • • • • . • • • • . • • • x

ABSTRAK • • . • • . • • • • . • . . • • . . . . . . . • • . . . . . • . . . . • • . • . . . . . • . • . . . . • . . . . . • . xi

ABSTRACT . • • • • • • . • . • . . . • • . . . • • • • • • . • . • • . . • • . . . . • . . . • • • • • • . . • • • . • • x i i i

BAB

1 PENGENALAN • . . • . . . . . • . • . • • . • • . . . . . . . • • . . • . . . . . . . . . . . . • . . . . . 1

2 SOROTAN LITERATUR

Sekatgerak enz im • . . . . • • • • • . • • . • . . . • . . . . . . • . • . • • • • • • . • . . . . . 6

Keba ikan proses sekatgerak . . • . . . . . . . . . . • • . . . • . . . . . . . . 6

Kaedah sekatgerak • . . . . . . . . . . • . . . • • . • . . . . • . . . • . . • . . . . . 8

Faktor-faktor pemil ihan penyokong . • . . • . • • . . • • . . . • . • . . • • • • l0

Pol imer . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . • . . . . . . . . • . . . . . • • . • • . . • 1 3

Hidrogel • • • • . . • • . . • • . . . • . • • • • • • . • . • • • . • • . . . . • • . . . • . . . • . . • 1 3

C i r i -ci r i hidrogel • • . . • • • • • • • • . • • • • • • • . • • . • • • • . • • • • • 1 4

Penggunaan hidrogel . • • . . . . . . . . . • • . . • • . • • • • • • • • • . • . . • 1 5

Sekatgerak l ipase . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • 1 7

Akt i v i t i a i r (aw ) • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 9

iv

3 BAHAN DAN KAEDAH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3

Penyedi aan polimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Pengekstrakan l ipase mentah . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

Proses s ekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8

Penentuan protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . . . 2 9

Penentuan akt i v i t i l ipase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9

Akti v i t i hidrol i s i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9

Akti v i t i pengeste ran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 0

Penentuan peratus kandungan a i r keseimbangan ( %KAK ) . . . . . . . 3 1

Penentuan kesan ak t i v i t i a i r ( aw ) ke atas peratu s

pengha s i l an e s t e r oleh l i pase Candida cyl indracea . . . . . . . . . 3 1

4 KEPUTUSAN DAN PERB INCANGAN

Penyedi aan polimer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 3

Penc i r i an polirner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4

Kesan s a i z penyokong te rhadap aktiviti

l ipase sekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 5

Ke san kandungan a i r pol imer t erhadap proses

sekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Penentuan peratus kandungan air keseimbangan ( %KAK ) . . . . . . . 3 8

Kesan pra-ol ah polimer dengan e tanol terhadap

akt i v i t i l ipase s ekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 3

Kesan kompos i s i monomer-monome r te rhadap akt i v i t i

hidrol i s i s dan pengesteran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8

v

Kesan j enis dan kepekatan agen rangkai s i l ang

terhadap akt i v i t i hidrol i s i s dan penges t e ran . . . . . . . . . . . . . . 56

Pe rbandingan akt i v i t i l ipase sekatgerak pada

poli (HEMA-ko-MMA ) dengan polimer sinte s i s yang lain . . . . . . . 59

Akt i v i t i a i r (aw ) dan kesannya terhadap

kadar tindak balas penges teran . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

5 KES IMPULAN DAN CADANGAN

Kes i mpulan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 6

Cadangan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

BIBLIOGRAFI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

LAMP I RAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

V ITA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

SENARA I PENERBITAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 5

v i

Jadual

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

1 1

1 2

1 3

SENARAI JADUAL

mukasurat

Kompos i s i monomer-monome r dan peratu s agen rangkai s i l ang dalam penyedi aan polimer . . . . . . . . . . . . . 26

Kesan s a i z penyokong terhadap aktiviti hidrol i s i s l ipase sekatge rak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Kes an sai z penyokong terhadap akt i v i t i pengesteran l ipase sekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Kesan kandungan a i r di dalam polimer ke atas akt i vi ti hidroli s i s l ipase sekatge rak . . . . . . . . . . . . . . . 39

Kesan kandungan air di dalam polimer ke atas akt i v i t i penge ste ran lipase sekatgerak . . . . . . . . . . . . . . 40

Peratus kandungan air ke seimbangan pol imer-pol imer ( %KAK ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 2

Kesan penambahan etanol te rhadap akt i v i t i hidrol i s i s l ipase sekatgerak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

Kesan p ra-olah pol imer dengan etanol ke atas akt iviti hidrol i s i s lipase sekatge rak . . . . . . . 46

Kesan p ra-olah polimer dengan etanol ke atas akt iviti penges te ran lip ase sekatgerak . . . . . . 4 7

Perbandingan akt i v i t i hidrol i s i s l ipase sekatgerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) berlainan ni sbah monomer , peratus dan j enis agen rangka i s i l ang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1

Perbandingan akt i v i t i pengeste ran l ipase sekatgerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) berlainan ni sbah monomer , peratus dan j eni s agen rangka i s i l ang . . . . . . . . . . : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2

Perbandingan akt i v i t i hidrol i s i s l ipase sekatgerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) dengan pol imer-pol imer s intes i s l ain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Pe rband ingan akti v i t i pengesteran l ipase s ekat-gerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) dengan pol imer-pol imer sintesis la in . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1

v i i

Raj ah

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 0

SENARAI RAJAH

mukasurat

I lustrasi yang dieadangkan bagaimana akt i v i t i a i r (aw ) menj adi pe rantara penseimbangan a i r di antara berbagai keadaan dan f a s a . . . . • . . . . . . . . . . . . 2 1

Struktur k i m i a monomer-monomer yang di gunakan . . . . . . . 50

Pe rbandingan akt i v i t i hi drol i s i s l ipase yang terj e rap pada pol i (HEMA-ko-MMA ) berlainan ni sbah monome r , peratus dan j enis agen rangkai s i lang . . . . . . 5 3

Pe rbandingan akt i v i t i pengesteran l ipase yang terj e rap pada pol i (HEMA-ko-MMA ) berl ainan ni sbah monomer , peratus dan j enis agen rangka i s i l ang . . . . . . 54

S t ruktur kimia agen rangka i s i l ang yang di gunakan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Mekani sma penj e rapan a l kohol pada pol i (me ti l met a k r i l a t } (PMMA ) sema s a p roses perakaan . . . . . . . . . . . 63

Kesan akti v i t i air (aw ) ke atas peratus pengha s i lan ester , lipase Candida cyl indracea yang di sekatgerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) nisbah 1 : 2 , dengan agen rangkai s i l ang (a ) 1% DVB (b ) 2% DVB (e) 5% DVB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 6

Ke san akt i v i ti air (aw ) ke atas peratus penghas i lan e s te r , l ipase Can dida cy lindracea yang d i s ekatgerak pada pol i (HEMA-ko-MMA ) ni sbah 1 : 2 , dengan agen rangkai s i l ang (a ) 1% EGDMA (b ) 2% EGDMA (e) 5% EGDMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Kesan aktiv i t i a i r (aw ) ke atas peratus pengha s i l an ester , l ipase Candida cyl indracea yang d i sekatgerak pada , pol i (HEMA-ko-MMA ) nisbah 1: 1, dengan agen rangkai s i l ang (a ) 1% DVB (b ) 2% D VB (e) 5% DVB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

Kesan akt i v i t i a i r (aw ) ke atas peratus pengha s i lan e s t e r , l ipase Candi da cylindracea yang di sekatgerak pada poli (HEMA-ko-MMA ) ni sbah 1 : 1 , dengan agen rangkai s i lang (a ) 1% EGDMA (b ) 2% EGDMA (e ) 5% EGDMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

vi i i

1 1

1 2

Kesan akt i v i t i a i r ( aw ) k e atas peratus pengha s i l an e s te r , l ipase Candida cylindracea yang d i s ekatgerak pada pol i ( HEMA-ko-MMA ) ni sbah 2 ;1 , dengan agen rangkai s i l ang ( a ) 1% DVB ( b ) 2% DVB (e) 5% DVB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

Kesan akt i v i t i a i r ( aw ) ke atas peratus pengha s i 1 an e s t e r , l ipase Candida cylindracea yang d i s ekatgerak pad a poli (HEMA-ko-MMA ) ni sbah 2 : 1 , dengan a gen rangkai s i l ang 5% EGDMA . . . . . . . . . . . . 7 1

ix

HEMA

MMA

MA

DVB

EGDMA

PMMA

mg

ml

%KAK

mmol

pmol

nm

pI

uv

v/v

w/w

SENARAI SINGKATAN

2-Hidroksi et i l metakri lat

Metil metakri l a t

Met i l akri l a t

Divini l benzena

E t i lena g l ikol d i metak r i lat

Poli ( me t i l metakr i l a t )

miligram

m i li liter

peratus kandungan a i r keseimbangan

m i limo l

mikromol

nanometer

mikro l iter

u l t ra l embayung

is ipadu/i s ipadu

berat/berat

akt iviti air

berat pol imer ker ing ( xe rogel )

berat pol imer kembung

x

Ab s t r a k t e s i s y a n g d i k e m u k a k a n k e p a da S e n a t Uni v e r s i t i Pertanian Malaysia untuk memenuhi keper l uan I j azah Master Sa ins

KAJIAN KESESUAIAN POLI (2-HIDROKSIETIL HETAKRILAT-ko-HETIL HETIL HETAKRILAT) SEBAGAI PENYOKONG PENYEKATGERAKAN LIPASE

Oleh

NORHAIZAN DINTI HOHD. ESA

Jun , 1996

P engerus i Profesor Abu Bakar Sal l eh , Ph . D .

Faku l t i Sa ins dan Pengaj ian Alam Sekitar

Lipase (Trias i l g l i serol ester hidrolase , E . C . 3 . 1 . 1 . 3 ) dari

Candida cyl indracea di sekatgerak secara penj erapan pada penyokong

p ol ime r . Pol imer ini di s inte s i s secara pempol i meran ampaian dua

monome r , 2 -h i droks i e t i l metak r i l a t ( HEMA ) dan me t i l meta kri l a t

( MMA ) pada kompo s i s i yang b e r b e z a ( l : 2 , 1 : 1 , 2 : 1 , mol/mo l > .

E t i l ena gl iko l dimetakri l at ( EGDMA ) dan divini l benzena (DVD) pada

peratusan yang berbeza ( w/w ) di gunakan sebagai agen rangkai s i l ang .

Kesan kandungan awal a i r dan saiz zarah-zarah pol imer «18 0 ,

180- 3 50 , 350-500pm ) te rhadap keberke s anan proses sekatgerak dikaj i

b e r d a s a rkan kepada t i ndak b a l a s h i d ro l i s i s dan peng e s t e r an .

Pol i ( HEMA-ko-MMA ) pada s a i z 1 80-3 50pm menunj ukkan aktiviti pal ing

t inggi bagi kedua-dua aktiviti hidrol i s i s dan pengesteran .

xi

Penambahan s e d i k i t e t ano l p a d a p o l i m e r s e b e l um d i campur dengan

l ipase didapati akan meningkatkan akt i v i t i l ipase .

Kesan kompos i s i monomer , j eni s dan p e ratus a gen rangkai s i l ang

turut d i kaj i . Keputusan menunj ukkan penj e rapan p rotein meningkat

dengan meningkatnya c i r i hid r o f i l ik po l im e r t e t a p i me r e nd a hkan

akt i v i t i hi drol i s i s manaka l a s eb a l iknya bagi aktiviti pengeste ran .

Akti v i t i spes i f ik tertinggi bagi tindak balas hi d ro l i s i s diperolehi

oleh l ip a s e sekatgerak pada pol i ( HEMA-ko-MMA ) dengan nisbah ( 1 : 2 )

dan 5% DVB. Bagi tindak balas pengesteran pul a aktiviti tertinggi

diperol ehi oleh l ipase sekatgerak pada pol i ( HEMA-ko-MMA ) dengan

nisbah ( 2 : 1 ) dan 5% EGDMA .

Kesan akti viti air ( a'II,) terhadap tindak balas pengesteran

turut dika j i . Di dapati p roses s ekatgerak pada poli ( HEMA-ko-MMA )

telah menganj ak kedudukan aktiv i t i a i r ( aw ) optimum l ipase Candi da

cylindracea ke a rah yang leb i h rendah. Walau baga imanapun ti ada

p e rub a han yang k e t a r a bentuk p ro f i l %pengha s i l an e s ter/aw b a g i

setiap s i ri polimer .

L i p a s e y a n g d i s e k a t g e r a k p a d a p o l i ( H E M A - k o -MMA ) j u g a

menunj ukkan aktiviti hi drol i s i s dan pengeste ran yang l ebih tinggi

berbanding pol imer-polimer lain yang diuj i me l ainkan Amber l i t XAD-

7 .

xi i

A b s t r ac t o f t he s i s subm i t t e d to t he S ena t e o f Unive r s i t i Pertanian Mal ays i a i n ful f i lment o f the requi rements f o r the degree of Mas t e r of Science

STUDIES ON THE SUITABILITY OF POLY ( 2-HYDROXYETHYL METHACRYLATE-co-METHYL METHACRYLATE ) AS A MATRIX FOR THE

IMMOBILIZATION OF LIPASE

By

NORHAIZAN BINTI MOHD. ESA

June , 1996

Cha i rman Professor Abu Bakar S a l l e h , P h . D .

Faculty Science and Envi ronmental Stud i e s

Lipase ( Tr i acylglycerol e s t e r hyd rol a s e , E . C . 3 . 1 . 1 . 3 ) f rom

Candida cyl indracea was immob i l i s e d by adsorpt ion on the surface of

p o l y m e r s u p p o r t s . P o l y m e r s w e r e p r e p a r e d b y s u s p e n s i o n

polyme r i za t ion of two monomers 2-hydroxyethy l methacryl ate (HEMA )

and methy l methacryl ate (NMA ) in d i f f e rent compos i t ions 0 : 2 , 1 : 1 ,

2 : 1 , mol e/mole ) . D i f fe rent percentages ( w/ w ) of ethylene g lycol

d i me t ha c r y l a te ( EGDMA ) and d i v i ny l benzene ( DVB ) w e r e u s e d a s

c ros s-linking agents .

The influence of ini t i a l water content and particle s i z e of

t he p o l y m e r «1 8 0 , 1 8 0 - 3 5 0 , 3 5 0 - 5 0 0 11m ) on t he d e g r e e o f

i mmob i l i z a t i on w a s d e t e r m i n e s b y mon i to r i ng t he hydro l y s i s and

ester i f i cation reactions . Poly ( HEMA-co-MMA)

xi i i

with l 8 0-35011m

p a r t i c l e s s i z e g a v e t h e h i ghe s t s p e c i f i c a c t i v i ty f o r b o t h

hydrol y s i s and ester i f i cation . P rewetting the polymer support w i th

sma l l amount of ethanol before coupl ing w i th l ipase inc reased the

l ipase act iv i ty .

The e f fect of the compos ition of monomers , type and percent of

c r o s s - l i nk i n g a g e n t s w a s i n v e s t i g a t e d on t h e d e g r e e o f

immob i l i za ti on . Results showed that protein adsorption inc reased

when hyd roph i l i ci t y incr e a s e d and wa s d e cr e a s e d the hydrol y s i s

a c t i v i t y , whe r e a s i t w a s the r e v e r s e f o r the e s t e r i f i ca t i on

a c t i v i ty . The h i gh e s t s p e ci f i c a ct i v i ty f o r hydrol y s i s was

achieved by immob i l i s ed l ipase on pol y ( HEMA-co-MHA ) with the ratio

( 1 : 2 ) and 5% DVB . For the este r i f i cation reaction , the highest

activi ty was produced by pol y ( HEMA-co-MHA ) with ratio ( 2 : 1 ) , and 5%

EGDMA .

The e f f ect of water activi ty ( aw ) on este r i f i cation reaction

was a l so stud i ed . I t was found that the immob i l i zation promoted a

shi f t in the opt i mu m water act ivity ( aw ) of Candida cyl indracea

l i pa s e to a l ow e r v a l u e . I t was a l s o found that t h e p a t t e rn

p r o f i l e o f %conv e r s i on/aw was s i m i l a r w i th a l l the s e r i e s of

polyme r .

Lipase i mmobi l i se d onto pol y ( HEMA-co-MMA ) gave a higher yield

for both hydrolysis and esteri f i cation activ i ty compared the other

polyme rs s tudied except Amber l i t XAD-7 .

xiv

BAB 1

PENGENALAN

Enz im adalah pemangkin biologi yang terdiri dari p rotein atau

g l ikoprotein . I a dihas i lkan dar i berbagai-bagai j enis tumbuhan ,

haiwan dan mikrob dan t e r l ibat dalam banyak tindak balas kimia yang

b e r laku di dalam hidupan . Penggunaan enz im di dalam industri telah

b e rmu l a s e j ak z aman dahu l u l a g i , contohnya s e b a g a i agen yang

t erl ibat dalam proses t e rmentasi , wal au pun ketika i tu si tat-s i tat

s emula j adi dan tungsinya b elum d i f ahami dengan menda l am ( Kennedy

dan Cab ral , 1 9 8 3 ) .

Berj eni s-j enis enz im telah dikenal pasti tetapi seb i l angan

s aha j a yang dihasilkan secara besar-besa ran dan di gunakan dalam

i n d u s t r i t e r u t a m a n y a e n z i m h i d r o l i t i k e k s t r a s e l y a n g

mendegrada s i kan pol imer sepe r t i p rote in, l emak , karbohidrat dan

s e lulosa ( P rave et al . , 1 987 ) .

Peningkatan pengetahuan dalam memahami si tat-sitat semulaj adi

enz im dan potens i pemangkinannya , disamping penemuan sumbe r-sumber

enzim yang baru dan penggunaan kaedah kej uruteraan genetik dalam

meningka tkan pengha s i l a nnya menj a d i k a n p engguna annya s emakin

m e l u a s . Contohnya d i da l am indus t r i p embu a t a n minuman k e r a s ,

pengha s i l an makanan , industri teks t i l dan perubatan . 1

Be r b e z a d a r i pemangk i n k i mi a , e n z i m mempuny a i kebo l ehan

memangkinkan t indak b a l a s d a l am keadaan b i a s a i a i tu d i d a l a m

l arutan berakueus yang neutral pada suhu dan tekanan normal . lni

dapat menj imatkan kos dan kemusnahan substra t , has i l tindak balas

yang sensi t i f te rhadap suhu yang tinggi dapat dielakkan . Ciri-c i r i

spes i f i s i t i yang t inggi t erhadap substrat j uga membol ehkan has i l ­

has i l sampingan yang t idak dikehendaki dapat di kurangkan .

Sa lah satu enz im yang begitu penting di dalam indus tri i a lah

l ipase . Wal au bagaimana pun kepent ingan ekonominya agak terhad

b e rband i ng dengan enz im ut ama yang l a i n s e p e r t i p r o t e a s e dan

k a r b o h i d r a s e d i m a n a t i d a k l e b i h d a r i 3% d a r i p a d a j u m l a h

k e s e 1 u r u h a n p e n g g u n a a n enz i m d i s e 1 u r uh dun i a ( G o d f r e y d a n

R e i che l t , 1 9 8 3 ) . Penggunaan l i p a s e d a l am mengh i d ro l i s i s l e m a k

adalah sebagai gantian kepada kaedah kimia ( Col gate-Eme ry) yang

melibatkan penggunaan tenaga yang tinggi dengan menghasi lkan a s i d

l emak yang bermutu rendah dan 1arutan g l i serol yang c a i r ( 1 2% v /v )

( Vi rto et al . , 1994 ) .

P enemuan-penemuan b a ru d a l am penggunaan l i p a s e , menj a d i k a n

kepentingannya s emakin meningkat bukan saha j a di dalam industri

makanan bahkan dalam bidang-bidang lai n seperti industri pembuatan

kertas , tekst i l , pengubahsuaian lemak dan minyak sebagai bahan zat

makanan da n di da l a m proses kimia organik seperti sinte s i s ester

( Bj orkl ing e t a i . , 199 1 ) .

W a l a u p u n e n z i m m e m b e r i k a n b e r b a g a i - b a g a i k e b a i k a n ,

p enggunaannya di dalam industri ada lah terhad ke rana kebanyakan

2

3

enzim t i dak s tabi 1 . lni adalah kerana hampi r kese1uruhan enz im di

da1am keadaan semu1aj adinya di tempa tkan di da1am se1 hidup . Di

dalam sel hidup , i anya dibahagi -bahagikan l agi kepada s i s tem-s i stem

s e k a t g e r a k yang 1 eb i h k e ci 1 d i d a 1 am o rgane 1 -organel i n t r a s e 1

seperti di da1am mi tokondria atau s i s t em membran intrasel . Apab i l a

enz i m i n i d i s a r i ng , i a d ip i s ahkan d a r i f a s a pepe j a 1 ke d a 1 am

l arutan i a i tu fasa ceca i r . Dalam keadaan ini enzim t i dak berada di

d a 1 am keadaan s emu1 a j a d i dan b i a s anya mudah d i nyaha kt i f ( Fa 1 b ,

1 9 7 2 ) . Di s amping ketidakstab i 1 an enz i m , kos penu1enan enz i m j uga

a d a 1 a h t i n g g i t e ru t am anya e n z i m i n t r a s e l dan t e k n i k u n t u k

memperolehi kemb a 1 i enzi m dari campuran tindak b a l a s se lepas proses

se1esai adalah sukar dan mahal. Wa lau pun dewa sa ini teknologi

kej uruteraan gene ti k s emakin berkembang dalam pembentukan bakteria

dengan keupayaan penghas i lan enzim yang ti ngg i , masalah masa yang

panj ang dan kos yang t inggi menghadkan penggunaannya .

Oleh i tu kaj i an diperingkat awa l dil akukan untuk memungkinkan

enz im di gunakan berulang-kal i dan boleh j uga digunakan di dalam

t i ndak b a l a s s e l anj a r ( Kennedy dan Cab r a l , 1 9 8 3 ) . K e dua-dua

obj ek t i f ini bol eh dicap a i dengan mel akukan pros es sekatge rak enzim

pada pe rmukaan pej a l dan ini telah mendapat perhat i an oleh para

penyel i dik pada awal tahun 1960-an ( Buchho l z , 1979; Mosbach, 1976 ;

Chibata , 197 8 ) .

Me1 alui proses sekat gerak , masalah ketidakstab i l an di dalam

l a ru t a n i ni dap a t d i a t a s i kerana i a menye d i akan enz i m dengan

perseki taran yang menyer upai perseki taran semu1 aj adi yang asal dan

membol ehkan enz im berfungs i dengan lebih berkesan . Di s amping i tu ,

4

proses sekatgerak enzim kepada penyokong seperti gentian , membran

dan mikrokapsul yang d i s intes is ini j uga membolehkan ciri-ci r i

k e l akuan semu l a j a di enz im int r a s e l d a n enz i m y ang t e r i k a t p a d a

membran yang semulaj adi dikaj i i a i tu berlainan dari aktiviti di

dalam l a rutan bebas ( Falb , 1 97 2 ) .

Wa l au baga imana pun t e r d a p a t t i g a ma s a l ah utama penggunaan

enzim sekatgerak di dalam industri i a i tu :

1) Kekur angan e nzim s t ab i l yang s e s u a i untuk di l akukan p ro s e s

sekatgerak .

2 ) C i r i - c i r i p e n y o k o n g t i d a k s e s u a i u n t u k d i g u n a k a n d a l a m

industri . Za rah-za rah penyokong biasanya l embut, mempunyai

b entuk ya n g ti dak t e r atur dan t i d ak s tab i l d a l am p ro s e s

a l i ran.

3 ) Keadaan yang diperlukan untuk p roses sekatgerak pada ska l a yang

besar melib atkan kos yang tinggi dan penggunaan reagen-reagen

yang merbahaya .

01eh itu obj ekt i f p roj ek ini ada1ah :

1 ) Menyediakan penyokong yang mempunyai struktur yang sesuai untuk

s e k a t g e r a k e n z i m d a r i m o n o m e r - m on o m e r 2 - h i d r o k s i e t i l

m e t a k r i l a t ( H E M A ) d a n m e t i 1 m e t a k r i 1 a t ( M MA ) d e n g a n

mempelbagai kan :

i ) Ni sbah monomer-monome r

i i ) Jenis agen rangkai s i l ang

5

i i i ) Peratus agen rangkai s i l ang

2 ) Mengkaj i kesesua ian hi drogel pol i ( HEMA-ko-MMA ) yang di s intes i s

sebagai penyokong bagi sekatgerak l ipase Candi da cylindracea

i a i tu melalui kaedah sekatgerak yang mudah dan murah .

3 ) Mengkaj i kesan proses sekatgerak pada hidrogel pol i ( HEMA-ko­

MMA ) t e r h a d a p a k t i v i t i a i r ( aw ) op t i m um l i p a s e Can di d a

cyl indracea .

BAB 2

SOROTAN LITERATUR

Sekatgerak enzim

Proses sekatge rak adalah satu proses di mana molekul enzim

d i l e k a t k a n k e p a d a p e r m u k a a n y an g p e j a l t a n p a m e n g h i l a n g k a n

a k t i v i t i nya . Contohnya s e ca ra i k a tan kov a l en atau p enj e r apan

kepada pol imer-polimer yang tidak larut di dalam pelarut organik

a t au t a k orga ni k , dan p emerangkap an di d a l am ma t r i ks g e l a t au

m ikrokap sul yang bersi fat separuh telap . lni termasuklah pe lekatan

secara kimi a atau f i z ikal kepada berbagai komponen-komponen sel

yang t i dak l a rut a i r s e p e r t i memb ran nUk l eus , m i tokondria dan

membran s e l ( Ch i bata , 1982).

Kebaikan prose s s e katgerak

Dengan me lakukan p roses sekatgerak , di mana enzim dilekatkan

k e p a d a p e r m u k a a n y a n g p e j a I , b e r b a g a i k e b a i k a n d i p e ro l e h i .

Int e ra k s i f i z i ka l d i ant ara p enyokong dan enz i m b o l eh mengubah

c i r i-ciri kimia dan f i zikal enzim kepada ci ri-ciri yang lebih baik

seperti meningkatkan aktiviti biologi dan kestab i l an enz i m .

6

7

P r o s e s s e k a t g e r a k j u g a d a p a t m e n g h a l an g e n z i m d a r i p a da

b e r a g g r e g a t d i ant a r a s a tu s ama l a i n yang b o l e h meng a k i b a tkan

taburan enz i m menj a d i tak homogen t e rutamanya apab i l a i anya

digunakan di dalam pelarut organik . I a j uga menyebarkan enzi m

k e p a d a p e rmukaan yang l eb i h l u a s i a i tu enz i m d i d edahkan kepada

kepekatan sub strat yang lebih homogen dan pemindahan j i si m menj adi

lebih mudah . Enzim yang t i dak l a rut ini boleh diperolehi semula

dari campuran t indak balas melalui pengemparan atau penurasan untuk

d i gunakan s e mu l a ( Woodwa r d , 1 9 8 5 ) . l n i me rup akan s a l a h s a tu

f aktor u t ama yang dap a t menj i ma tkan ko s o Tambahan pu l a t indak

balas mudah dikawal dan boleh d i j a l ankan berterusan serta dapat

menj imatkan masa ke rana tidak meme rlukan langkah penul enan untuk

mengelua rkan enz im dari a l i ran has i l an ( Jiang dan Zhang , 1993 ) .

Ha s i l tindak balas yang diperolehi mempunyai ketulenan yang

t inggi dan dianggap sebagai semulaj adi berdasarkan kepada keperluan

FDA ( Food and Drug Association) , Amerika Syarikat dengan nilai

ekonomi yang t inggi ( We l sh dan Wi l li am , 1 990 ; Chulalaksananukul e t

al . , 19 92 ) . P roses s ekatgerak j uga didapat i t i dak mempengaruhi

keenanti om i l ihan ( Be rglund e t al . , 1 9 94 ) .

Enzim yang di gunakan untuk proses sekatgerak ini t i dak perlu

di tulenkan kerana kaj ian ( Bovara e t al . , ( 1993 ) dan Wehtj e et al . ,

( 1 9 9 3 » menunj ukkan l i p a s e yang di tul enkan t e r l eb i h dahulu ,

berkemungkinan akan ternyahakt i f apab i l a disekatgerak me lainkan

j ika enz im i tu dimuatkan dalam kuanti t i yang banyak .

menj imatkan masa dan tenaga .

lni dapat

8

D i antara faktor-faktor yang amat mempengaruhi c i ri-c i r i dan

kestab i l an enz im yang d i s ekatgerak adalah i ) kaedah s ekatgerak ,

ii) ciri-ciri b a ha n p e n y ok on g , t e r u t a m a n y a ciri

hi d r o f i l i k/hi drofob i k , i i i ) tapak enz i m untuk d i l akukan p ro s e s

s ekatgerak d a n i v ) kedudukan antara muka enzi m .

Kaedah sekatgerak

Se j ak beberapa t a hun kebe 1 akangan i n i keb anyakan d a r i pa d a

k a j i an sekatgerak tertumpu kepada kaedah sekatgerak dan penemuan

bahan-bahan penyokong yang baru (Ji ang dan Zhang , 199 3 ) .

Menurut Bickers taff (1 987 ) , kaedah sekatgerak pada dasarnya

terbahagi kepada 4 j eni s :

1 . Penj e rapan

P e l e ka tan enz i m kepada penyokong ada 1 ah s e c a r a i k a t an bukan

kovalen seperti interaksi ionik , interaks i hi drofobik dan ikatan

hidrogen . 1a ada1ah kaedah yang pal ing awal di gunakan , murah dan

r i ngkas . T i a d a s e ba rang l angkah penga k t i f an untuk mengubah

kumpulan berfungs i pada penyokong diperlukan . Oleh itu enzi m yang

d i s e k a t g e r a k h a n y a m e n g a l am i s e d i k i t a t a u t i a d a p e r u b a h a n

konforma s i d an da pa t mengekalkan akt i v i t inya (Za r b o r s k y , 1 97 3 ;

Kennedy dan Cabral , 1987 ) . Walau bagaimana pun enz i m yang terjerap

m u d a h t e r b e b a s d a r i p e ny o kong t e r u t a ma n y a a p ab i l a k e a da an

persekitaran seperti pH , suhu dan kekuatan ionik be rubah ( Demain

dan S ol oman , 1 9 8 6 ) . Contoh p enyokong yang te 1 ah d i gunakan

9

t e rm a s u k l a h d i a m i noe t i l ( DEAE ) - s e l u l o s a , ka rboks i me t i l ( CM ) ­

selulos a , bentonit , alumina dan kaca b e r l i ang .

2 . Pengi katan kova len

K a ed a h i n i me l ib a tkan pembentukan i k a t an kova l e n d i ant a r a

enz i m dan penyokong . Ikatan biasanya terbentuk d i antara kumpul an

b e r f ung s i yang h a d i r d i pe rmukaan p enyokong dengan kump u l an

berf ungsi p ada salah satu asid amino yang wujud di permukaan enz im .

Walau bagaimana pun perlu dipastikan supaya asid amino penting yang

diperlukan untuk akti v i t i pemangkinan enz im tidak terl ibat dalam

pembentukan i katan kovalen kepada penyokong .

Menerusi kaedah ini , enz im b i asanya terikat dengan kua t dan

s ta bi l dan menghal angnya daripada terbebas ke da lam l a rutan tindak

balas . Wal au bagaimana pun aktiv i t i yang di tunjukkan mungkin l ebih

rend ah k e r ana enz i m d i d e dahkan kepada keadaan dan r e a gen yang

toks i k . Tindak balas yang berlaku l ebih suka r , kompleks dan mahal

( Be rnath dan Venkatasubr amaniam , 1 9 86 ) .

3. Pemerangkapan dan pengkapsulan

K a e dah i n i b e r b e z a d a r i kaedah-kaedah yang l a in . Enz i m

d i h a l ang p e r g e r ak annya m e l a l u i s t ruktur kek i s i g e l dan memb ran

separuh telap . Peme rangkapan di l akukan dengan mencampurkan enz i m

kepada monome r dan kemudian di rangkai s i l ang dengan pol imer untuk

membentuk 5 t ruktur k e k i s i yang meme rangkap enz i m . Contohnya

pol i akr i l amida dan kals ium al ginat .

1 0

Pengkap sula n pu l a d ip e rol e hi dengan menye lubung i enz im d i

d a l am b e r b a g a i bentuk memb ran s ep a ru h t e l ap sepe r t i l iposom ,

mikrokapsul dan nilon .

Dal am kedua-dua kaedah ini, adalah perlu dipastikan kedua-dua

substrat dan has il an boleh membaur melalui l iang- l iang pada memb ran

kapsul yang te rbentuk untuk mengurangkan kerintangan pemindahan

j i s im . Begitu j uga j ika biomolekul yang dipe rangkap adalah s e l ,

membran pol imer ini mestilah tidak mengurangkan pembauran molekul­

molekul yang diper lukan begitu j uga has i l an akhi r yang toks ik dari

m e t a b o l isma s e l supaya akti v i ti f is io l o g i yang norma l d a p a t

di kekalkan ( P rave et ai., 1 987 ) .

Wal a u ba ga i mana p un p r o s e s s e k a t g e r a k j uga b o l eh d i l akukan

dengan pe rgabungan bebe rapa p r o s e s s e p e r t i penj e r a pan d engan

peme rangkapan atau penj e rapan dengan ikat an kova len .

Faktor-f aktor pemi l ihan penyokong

Dalam usaha mencari kaedah sekatgerak yang sesuai dan berkesan

untuk mempe r o l e hi ha s il yang maks 'ima , ia j uga membawa kepada

penggunaan berbagai -bagai j enis penyokong . Pemi l ihan penyokong

untuk proses sekatgerak enz im ini amat penting kerana j umlah enz im

yang terj e rap adalah b e rgantung kepada luas pe rmukaan , saiz dan

t abu ran l iang untuk membeb ankan enz im yang d ip il ih b a g i p ro s e s

sekatgerak . Faktor-f aktor lain yang perlu diambil kira termasuklah

parameter seperti kesel uruhan t indak balas dan keberkes anan enz im

11

yang telah d isekatgerak, terutamanya j ika penyokong yang diperlukan

adalah banyak seperti yang d i gunakan di dalam indus tri . Di samping

i tu a d a l ah p en t i n g untuk mema s t i kan enz i m t i dak d i nyaha kt i f kan

melalui tindak balas dengan a s i d amino pada tapak akt i f (Kennedy

dan Cabral , 1987) .

Pemi l i han penyokong j uga terhad kepada kebolehan substrat dan

has i l tindak balas untuk bergerak menerusi l i ang- l i ang penyokong

seperti membran atau enzim yang terperangkap (j aringan pol ime r a tau

mikrokapsu l ) d i s amp i ng dapat mengurangkan has i l perencatan . Di

dalam kes enzim yang terikat seperti penj erapan , penyokong yang

mempunya i banyak l i ang di p i l i h kerana lebih banyak pe rmukaan untuk

penj erapan (Prave et al., 1987).

Beg i tu j uga ci ri-c i r i lain sepert i penggunaan semu l a , kos yang

d i p e r l ukan d a l am k a e d a h seka tgerak yang d i p i l i h dan ketoks i k an

r e a gen untuk s e k a t g e r a k t e r u t amanya yang berk a i t rapat dengan

pengha s i l an makanan m a nus i a dan ha iwan perlu d i amb i l p e r ha t i an

(Ba i ley dan Oll i s , 1986; Vi rto e t al., 1994).

Penyokong yang di gunakan mes t i lah mempunya i kekuatan mekanikal

yang cukup kuat dan t i dak terdegradasi oleh mikroorgani sma dan di

bawah keadaan uj ikaj i , s epert i pe rubahan kimia dan suhu yang t inggi

(Broun et al., 1978). I a j uga mes tilah boleh bertindak sebagai

bahan tindak balas yang t i dak 1 a rut di da l am air yang mempunyai

kespes i f ikan yang t inggi dan mudah dipisahkan dari campuran t indak

balas . Cir i hi dro f i l ik i ai tu kebo lehan a i r untuk meresap d i dalam