KEJURUTERAAN GENETIK TUMBUHAN

1.0 Pengenalan kejuruteraan genetik tumbuhan

Kejuruteraan genetik tumbuhan adalah satu proses yang melibatkan pemindahan gen

yang membawa maklumat genetik daripada satu orgamisma kepada organisma sasaran

yang lain dengan menggunakan kaedah teknologi DNA rekombinan. Proses ini

melibatkan kemasukan, pengubahsuaian atau pembuangan fragmen DNA yang

mengandungi satu atau lebih gen yang diminati ke dalam tanaman untuk mendapatkan

ciri fenotip yang diminati. Organisma yang menerima gen baru ini dikenali sebagai

organisma terubahsuai secara genetik (GMO) atau organisma transgenik.

Tempoh penghasilan tanaman transgenik mengambil masa yang lama bergantung

kepada jenis tanaman serta pengesahan biokeselamatan tanaman transgenik yang

ingin dipasarkan. Lazimnya proses penghasilan tanaman transgenik mengambil masa

10 15 tahun daripada peringkat makmal hingga ke peringkat komersial.

1.1 Langkah-langkah dalam penyelidikan kejuruteraan genetik tumbuhan

Kejuruteraan genetik tumbuhan melibatkan beberapa aktiviti berikut iaitu;

1. Mengenalpasti dan memencilkan gen yang mempunyai ciri-ciri yang

dikehendaki,

2. Pengeklonan gen yang diminati ke dalam vektor transformasi tumbuhan

yang mengandungi promoter dan terminater contohnya pCAMBIA.

3. Membangunkan sistem kultur tisu, sistem transformasi dan regenerasi yang

cekap. Sistem-sistem ini adalah penting untuk menentukan kejayaan

transformasi sesuatu tanaman.

4. Transformasi atau pemindahan gen ke dalam tisu tanaman dengan kaedah

yang sesuai seperti menggunakan kaedah Agrobakterium atau kaedah

penembakan zarah (Biolistik).

5. Proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi untuk memilih pokok-

pokok berpotensi yang mengandungi gen diminati.

6. Regenerasi tisu yang telah ditransformasi untuk mendapakan plantlet.

7. Analisis pokok-pokok transgenik dengan menggunakan teknik biologi molekul

seperti tindakbalas rantaian polimerase (PCR), pemblotan Southern,

pemblotan Northern atau Real Time PCR.

8. Pemindahan pokok-pokok transgenik positif yang berakar ke polibeg atau

pot bergantung kepada pokok yang ditransformasi.

9. Kajian tertutup, kajian lapangan terkawal diikuti kajian lapangan terbuka

pokok-pokok transgenik.

10. Kelulusan Biokeselamatan untuk pengeluaran dan pemasaran tumbuhan

transgenik.

Carta alir untuk proses yang terlibat dalam teknik kejuruteraan genetik.

Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan

1.2 Teknik kejuruteraan genetik tumbuhan

Terdapat beberapa teknik yang boleh digunakan untuk proses pemindahan gen asing

ke dalam tisu tumbuhan iaitu dengan menggunakan kaedah secara langsung ataupun

secara tidak langsung. Teknik yang paling meluas digunakan iaitu teknik secara tidak

langsung dengan berperantara Agrobakterium. Teknik kedua iaitu teknik secara

langsung seperti kaedah penembakan zarah (biolistik), protoplas dan mikroinjeksi.

Teknik-teknik tersebut dikenali sebagai teknik secara langsung kerana proses

transformasi tidak melibatkan perantara.

1.2.1 Transformasi gen dengan Agrobakterium

Agrobakterium tumefaciens merupakan bakteria gram negatif yang berbentuk rod.

Secara semulajadinya bakteria Agrobakterium ini boleh menjangkiti tanaman dan

menyebabkan satu penyakit yang dikenali sebagai nodul-nodul. Penyakit nodul-nodul

terhasil apabila Agrobakterium tadi memindahkan bahagian T-DNA dari plasmid yang

ada pada Agrobakterium tersebut ke dalam nukleus sel dan berintegrasi dengan

genom tumbuhan. Plasmid ini dikenali sebagai Tumour inducing plamid (Plasmid Ti)

yang bersaiz lebih kurang 200 kb. Nodul-nodul yang terhasil ini berkeupayaan

membekalkan sumber karbon kepada Agrobakterium. Keunikan sifat inilah yang

membolehkan plasmid Ti pada Agrobakterium digunakan sebagai satu alat

pemindahan gen iaitu dengan menyisipkan gen yang diminati ke bahagian T-DNA

Agrobakterium tersebut.

Terdapat tiga komponen penting yang terlibat di dalam pemindahan gen iaitu:

1. Gen virulen kromosom (chromosomal virulence, chv) yang terdapat dalam

kromosom Agrobakterium terlibat dalam proses perlekatan Agrobakterium

dengan sel tumbuhan.

2. Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada Ti-plasmid berperanan untuk

menginduksi permindahan dan juga integrasi T-DNA.

3. Kawasan T-DNA yang merangkumi daerah LB (left border) hingga RB (right

border) pada Ti-plasmid mengandungi gen-gen penting untuk Agrobakterium

berfungsi.

Teknik Agrobakterium merupakan sistem transformasi yang paling meluas digunakan

dalam proses transformasi tumbuhan terutamanya terhadap tumbuhan dikotiledon.

Teknik ini pada awalnya dipercayai hanya boleh digunakan untuk pemindahan gen

terhadap tumbuhan dikotiledon sahaja, tetapi selepas kajian intensif dilakukan

terhadap tumbuhan monokotiledon, membuktikan teknik Agrobakterium ini boleh

juga digunakan untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Hiei et al., (1994; 1997)

ialah saintis pertama yang melaporkan bahawa teknik Agrobakterium boleh digunakan

untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Antara tanaman yang berjaya

ditransformasi dengan teknik Agrobakterium seperti padi, jagung, orkid dan asparagus

(Yu et. al., 2009; Ozawa, 2009; Shou et. al., 2004; Mishiba et. al., 2005; Liau et. al.,

2003; Limanton-Grevet and Jullien, 2004 dan Delbreil et. al., 1993).

Teknik berperantara Agrobakterium ini paling digemari dan mempunyai kelebihan

kerana ianya berkeupayaan mengintegrasi dan memindahkan T-DNA ke dalam genom

tanaman tanpa melibatkan penggunaan peralatan yang sofistikated dan canggih

berbanding teknik pemindahan gen yang lain. Selain itu, kelebihan lain teknik

berperantara Agrobakterium ini ialah jumlah salinan gen yang terintegrasi pada

genom tanaman biasanya hanya satu salinan dan ini dapat mengurangkan gangguan

terhadap fungsi gen-gen lain dalam tumbuhan tersebut.

Walau bagaimanapun keberkesanan teknik ini terbatas kepada genotip tanaman dan

teknik ini juga melibatkan banyak penggunaan antibiotik. Antibiotik diperlukan

samada untuk proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi dan juga untuk

mengawal lebihan pertumbuhan Agrobakterium.

1.2.1.1 Proses transformasi dengan Agrobakterium

i. Penyediaan kultur Agrobakterium

Strain Agrobakterium yang digunakan mestilah bersesuaian dengan pokok yang

ditransformasikan. Pemilihan strain berdasar kepada keupayaan strain tersebut

memindahkan gen yang dikehendaki ke dalam tisu tumbuhan. Kebiasaanya strain yang

mempunyai kecekapan transformasi yang tinggi dipilih. Terdapat banyak jenis strain

Agrobakterium, seperti LBA 4404, AGL1, EHA 101 dan EHA 105. Selain pemilihan

strain, vektor transformasi tumbuhan yang digunakan juga mestilah bersesuaian

berdasar kepada gen penanda pemilihan yang dimiliki oleh vektor tersebut. Strain

Agrobakterium yang super virulen bergabung dengan vektor transformasi tumbuhan

yang bersesuaian akan meningkatkan kecekapan proses transformasi.

Gen konstruk yang ditransformasikan ke dalam Agrobakterium kebiasaanya disimpan

dalam bentuk gliserol dan disimpan pada suhu -80C sebagai kultur stok. Untuk tujuan

transformasi, stok gliserol tadi dilakar ke atas media pejal Luria Bertani (LB) yang

mengandungi antibiotik untuk pemilihan Agrobakterium yang mengandungi konstruk

yang betul dan dieram selama 3 hari pada suhu 28C. Koloni yang tumbuh selepas 3

hari dikulturkan ke dalam media cecair LB yang mengandungi antibiotik yang sama

dan digoncang dalam alat pengeraman selama 3 hari pada suhu yang sama dengan

kelajuan 280 rpm.

Kultur bakteria yang terhasil akan dimendakkan dengan alat pengempar pada kelajuan

6000 rpm selama 15 minit. Pellet yang terbentuk dilarutkan semula ke dalam media

cecair dan digoncang pada suhu dan kelajuan yang sama sehingga mencapai fasa aktif

pertumbuhan atau fasa logaritma dengan ketumpatan optik (OD) 0.2- 0.5. Pemilihan

Ketumpatan optik (OD) yang digunakan bergantung kepada kecekapan sistem

transformasi sesuatu tumbuhan. Kebiasannya ketumpatan optik yang digunakan antara

0.2-0.5. Walau bagaimanapun sesetengah tumbuhan menggunakan ketumpatan optik

yang lebih tinggi iaitu 1.0.

Media cecair juga biasanya mempunyai nilai pH yang rendah antara 5.2-5.3 dan

ditambah dengan bahan kimia asetosiringone. Asetosiringone berperanan memberi

isyarat kepada gen-gen virulen yang terlibat dalam mekanisma pemindahan gen.

Adakalanya, tanpa penambahan asetosiringone, proses transformasi gen tidak akan

berlaku di dalam sesetengah tumbuhan. Kepekatan asetosiringone yang lazim

digunakan dalam transformasi Agrobakterium ialah 100 - 200 M.

ii. Transformasi tisu tumbuhan

Tisu yang hendak ditransformasi direndam dalam larutan Agrobakterium selama 30-40

minit. Kemudian diletakkan di atas kerta turas selama 15-30 minit untuk

mengeringkan lebihan Agrobakterium sebelum dikulturkan ke media ko-kultivasi.

Media ko-kultivasi juga mempunyai nilai pH yang rendah untuk meningkatkan

kecekapan pengekpresan gen vir.

Jangkamasa ko-kultivasi yang optimum adalah penting untuk penyerapan

Agrobakterium ke dalam sel tisu tumbuhan. Masa ko-kultivasi yang terlalu singkat

boleh menjejaskan kecekapan transformasi. Tetapi sekiranya masa ko-kultivasi terlalu

lama, ianya boleh menyebabkan pertumbuhan Agrobakterium tidak dapat dikawal

walaupun selepas dipindahkan ke atas media yang mengandungi antibiotik.

Ketidakkeberkesanan menghapuskan pertumbuhan Agrobakterium yang berlebihan

merupakan masalah utama transformasi dengan Agrobakterium kerana ia boleh

menjejas dan memusnahkan pokok-pokok yang berpotensi. Oleh itu, penggunaan jenis

dan kepekatan antibioitik yang sesuai adalah penting untuk mengawal pertumbuhan

Agrobakterium semasa proses transformasi. Antibiotik yang biasanya digunakan untuk

mengawal pertumbuhan Agrobakterium seperti cefotaxime, vancomycin dan

carbenicillin yang boleh menghalang pembentukan dinding sel bakteria. Jenis dan

kepekatan yang digunakan hendaklah mampu menghalang pertumbuhan

Agrobakterium dan juga tidak mempengaruhi pertumbuhan sel tumbuhan.

iii. Penyaringan tisu yang ditransformasi

Proses penyaringan dilakukan di atas media yang mengandungi antibiotik yang sesuai

untuk pemilihan tisu-tisu yang berjaya ditransformasi. Semasa proses penyaringan

tersebut, hanya sel yang mengandungi gen penanda pemilihan sahaja yang akan hidup

dan sel yang tidak mengandungi gen penanda pemilihan akan mati. Oleh itu, putatif

transforman dapat dikenalpasti. Proses penyaringan peringkat awal ini membantu

mengurangkan jumlah sampel yang perlu dianalisis secara biologi molekul kelak.

Kepekatan antibiotik yang digunakan semasa proses penyaringan mestilah

bersesuaian. Kepekatan antibioitk terlalu rendah akan menyebabkan banyak pokok

terlepas semasa proses penyaringan dan sebaliknya kepekatan yang terlalu tinggi

boleh merencat tumbesaran sel tumbuhan.

Antibiotik yang digunakan semasa proses penyaringan bergantung kepada gen penanda

pemilihan (selectable marker gen) yang digunakan dalam penyediaan konstruk.

Sebagai contoh, jika gen penanda pemilihan yang digunakan adalah gen nptII yang

memberi kerintangan terhadap kanamycin, jadi antibiotik kanamycin digunakan

semasa proses penyaringan tisu transformasi. Dengan itu hanya sel tisu yang

mengandungi gen nptII sahaja akan rintang dan hidup dalam media tersebut.

Kebiasaanya proses penyaringan dilakukan selama 4 bulan.

iv. Regenerasi sel transformasi

Selepas proses penyaringan, sel yang berjaya hidup akan dipindahkan ke atas media

regenerasi untuk mendapatkan plantlet. Kecekapan sistem transformasi banyak

bergantung kepada kecekapan sistem regenerasi kerana sistem regenerasi yang cekap

membolehkan tisu tumbuh dengan cepat dan banyak.

v. Pengakaran pokok transformasi

Selepas platlet mencapai ketinggian lebih kurang 2 cm ianya dipindahkan ke media

pengakaran. Biasanya proses pengakaran dilakukan di dalam media yang mengandungi

hormon auksin seperti IBA, IAA atau NAA bergantung kepada kesesuaian pokok yang

ditransformasikan. Pokok yang berakar dipindahkan pula ke polibeg atau ke pot.

Gambahrajah berperingkat regenerasi tisu tumbuhan yang ditransformasi. (a) Tisu tumbuhan (kalus) yang digunakan untuk transformasi. (b) Proses penyaringan untuk pemilihan tisu-tisu yang berjaya ditransformasi atas media antibiotik. (c) Tisu yang berjaya hidup dalam media antibiotik dipindahkan ke media regenerasi untuk mendapatkan plantlet. (d) Pembentukan plantlet atas media regenerasi. (d) Pengakaran pokok transformasi dalam media pengakaran.

a b

c d e

1.2.2 Teknik penembakan zarah (Biolistik)

Teknik transformasi tumbuhan kedua ialah teknik penembakan zarah yang juga

dikenali sebagai teknik tembakan mikropeluru. Teknik ini merupakan satu alternatif

untuk transformasi tumbuhan terutamanya tumbuhan monokotiledon kerana kejayaan

transformasi gen menggunakan kaedah Agrobakterium terbatas kepada tumbuhan

dikotiledon dan spesis monokotiledon tertentu.

Teknik transformasi penembakan zarah menggunakan satu alat khas yang dikenali

sebagai biolistik. Melalui teknik ini, zarah tungsten atau emas yang disalut dengan

DNA ditembak ke dalam sel tumbuhan dengan menggunakan gas tekanan tinggi. Saiz

diameter zarah tungsten atau emas yang digunakan antara 0.5 hingga 5 mikron.

Teknik penembakan zarah juga melibatkan proses penyaringan sama seperti teknik

Agrobakterium kerana tidak semua sel tumbuhan yang ditembak akan menerima gen

tersebut. Proses penyaringan ini dilakukan dengan meletakkan sel tumbuhan yang

ditembak ke atas media yang mengandungi antibiotik. Hanya sel yang mengandungi

gen penanda pemilihan sahaja yang akan rintang dan hidup dalam media yang

mengandungi antibiotik.

Seperti proses transformasi dengan menggunakan teknik Agrobakterium, sel yang

berjaya hidup akan dipindahkan ke media regenerasi untuk proses tumbesaran

mendapatkan plantlet diikuti dengan proses pengakaran dan pemindahan ke polibeg

atau ke pot.

Alat biolistik yang digunakan untuk transformasi tumbuhan.

Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan

Gas helium

Zarah emas/tungsten disalut DNA

Tisu tumbuhan

1.3 Analisis biologi molekul pokok transgenik

Pokok transgenik yang diregenerasi dan berakar dalam in-vitro boleh dianalisis secara

biologi molekul untuk memastikan integrasi gen dan fungsi gen yang ditransformasi

dalam genom DNA tumbuhan sebelum ia dipindah dan ditanam. Proses ini amat

penting untuk mengenalpasti pokok-pokok transgenik dengan gen yang berfungsi untuk

memudahkan kerja-kerja analisis selanjutnya dan secara tidak langsung akan

menjimatkan kos dan masa proses transformasi. Teknik-teknik yang digunakan untuk

analisis biologi molekul, seperti Tindakbalas Rantaian Polimerase (PCR), Pemblotan

Southern (Southern Blot) dan Pemblotan Northern (Northern Blot).

1.3.1 Tindakbalas Rantaian Polimerase (PCR)

Genom DNA pokok transgenik perlu diekstrak untuk dijadikan templat semasa analisis

PCR dan kebiasaanya daun muda dipilih untuk tujuan pengekstrakan DNA tersebut.

Pengekstrakan genom DNA juga boleh dilakukan dengan menggunakan bahagian yang

berlainan pada pokok transgenik yang sama untuk memastikan yang pokok transgenik

tersebut tidak kimerik.

Analisis PCR dijalankan dengan menggunakan primer yang direka spesifik untuk

mengenalpasti gen-gen yang ditransformasi. Analisis PCR boleh dijalankan ke atas gen

pelapor, gen penanda pemilihan atau lebih tepat ke atas gen tertentu yang telah

ditransformasikan. Jalur tunggal dengan berat molekul tertentu akan didapati setelah

produk PCR dianalisis dengan gel elektroforesis.

1.3.2 Pemblotan Southern (Southern Blot)

Pemblotan Southern digunakan untuk menganalisis kehadiran jujukan DNA spesifik,

lokasi dan menentukan jumlah salinan gen yang terintegrasi dalam genom DNA

tumbuhan. Analisis biologi molekul secara Pemblotan Southern memerlukan amaun

genom DNA yang lebih banyak berbanding dengan analisis PCR dan genom DNA ini

perlu dicernakan dengan enzim pembatas tertentu sebelum gel elektroforesis

dijalankan.

Tiga proses utama yang terlibat dalam Pemblotan Southern iaitu pemblotan DNA ke

atas membran nilon, hibridisasi membran dengan prob dan pencerapan prob.

Pemblotan DNA ke atas membran nilon boleh dilakukan secara manual kapilari atau

dengan menggunakan mesin yang digelar Bloter. Prob yang biasa digunakan untuk

hibridisasi adalah gen yang ditransformasi yang dilabelkan dengan radioaktif atau

bukan radioaktif. Kaedah untuk pencerapan signal positif bergantung kepada cara

perlabelan prob yang digunakan. Kaedah-kaedah yang boleh diguna seperti

penggunaan filem X-ray, kaedah pencerapan Colourimetric atau pencerapan

Chemiluminescent. Semasa proses pencerapan, prob berlebihan akan dibilas keluar

dan prob yang berjaya berhibridisasi dengan genom DNA akan menghasil signal positif.

1.3.3 Pemblotan Northern atau Real Time PCR

Teknik Pemblotan Northern digunakan untuk menganalisis pengekspresan gen yang

terintegrasi ke dalam genom tumbuhan. Asid ribonukleik (RNA) yang diekstrak akan

dipisahkan dengan elektroforesis dan diblot ke atas membran. Seterusnya, membran

ini akan dihibridisasi dengan prob yang spesifik yang telah dilabelkan. Real Time PCR

ialah teknik terkini yang digunakan untuk mengalisis pengekspresan gen yang boleh

menggantikan pemblotan Northern.

1.4 Penanaman tumbuhan transgenik

Pokok transgenik positif yang dikenalpasti secara analisis biologi molekul tidak boleh

ditanam terus di kawasan lapang seperti pokok biasa. Penanaman tumbuhan

transgenik perlu dilakukan mengikut prosedur-prosedur tertentu untuk mengelakkan

pendedahan Organisma Terubahsuai Secara Genetik (GMO) ke persekitaran semulajadi

supaya sumber alam semulajadi tidak terganggu dan biokeselamatan persekitaran

terjamin. Terdapat tiga peringkat penanaman tumbuhan transgenik iaitu penanaman

tertutup (contained trial), penanaman kajian lapangan terkawal (confined field trial)

dan penanaman lapangan terbuka (open field trial).

Penanaman peringkat awal perlu dijalankan dalam struktur tertutup dengan

persekitaran terkawal. Struktur-struktur tertutup yang biasa digunakan seperti Rumah

Kaca Transgenik, rumah teduh, Growth Chamber dan Incubators. Tujuan utama

penanaman tertutup dijalankan untuk mengumpulkan data-data kajian dan meneliti

kesan kemasukan gen ke atas pertumbuhan pokok transgenik sebelum ia dikeluarkan

dan ditanam di persekitaran terbuka. Pada peringkat ini juga, kajian pengurusan

risiko (risk managment) dijalankan untuk mengelakkan gangguan terhadap

persekitaran ekosistem semulajadi atau kewujudan eskosistem yang baru.

Selepas kajian peringkat tertutup, tanaman transgenik yang berpotensi akan

dipindahkan keluar untuk penanaman kajian lapangan terkawal (confined field trial)

dan penanaman lapangan terbuka (open field trial). Aktiviti-aktiviti penanaman

tertutup selalunya perlu dilakukan menurut peraturan-peraturan dan garis panduan

yang telah disedia dan dikuatkuasakan oleh Jawatankuasa Biokeselamatan Institut

(IBC).

Struktur tertutup untuk penanaman tumbuhan transgenik.

1.4.1 Prosedur penanaman tumbuhan transgenik

1. Tumbuhan transgenik mesti dilabel dengan jelas dan dibezakan dengan pokok

kawalan.

2. Setiap kelompok tumbuhan transgenik yang berlainan perlu dilabel untuk

mengenalpasti jenis pokok dan modifikasi genetik yang dilakukan. (Contohnya,

Betik ditransformasi gen rintang kepada PRSV).

3. Tumbuhan yang ditanam dalam struktur tertutup akan dianggap dan dilayan

sebagai tumbuhan transgenik. Kajian yang tidak melibatkan GMO dalam struktur

tertutup tidak digalakkan.

4. Tumbuhan atau tisu tumbuhan transgenik perlu dibawa dalam bekas tertutup

untuk mengelak berlaku kehilangan atau pendedahan ke persekitaran semasa

pemindahan masuk atau keluar dari struktur tertutup.

5. Tumbuhan transgenik yang berlainan perlu disimpan dalam bekas tertutup secara

berasingan dan dilabel semasa proses pemindahan.

6. Pemantauan berterusan adalah penting untuk memastikan tiada pertumbuhan

artropod, mites atau afid ke atas tumbuhan transgenik.

7. Alat-alat penanaman yang telah digunakan perlu dinyahkuman dengan cara

autoklaf atau direndam dengan bahan nyahkuman seperti klorox untuk

menghapuskan artropod yang mungkin terlekat pada peralatan tersebut. Tanah

yang diguna juga perlu diautoklaf.

8. Selepas selesai kajian semua tumbuhan yang digunakan perlu diautoklaf sebelum

dibuang.

9. Tangan hendaklah dibasuh dengan sabun selepas kerja-kerja penanaman tumbuhan

transgenik selesai.

Rujukan

Delbreil B., Guerche P. and Jullien M. (1993). Agrobacterium-mediated

transformation of Asparagus officinalis L. Long term embryogenic callus and

regeneration of transgenic plants. Plant Cell Report 12: 129-132.

Hiei Y., Komari T. and Kubo T. (1997). Transformation of rice mediated by

Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology 35: 205218.

Hiei Y., Ohta S., Komari T. and Kumashiro T. (1994). Efficient transformation of rice

[Oryza sativa L.] mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries

of the T-DNA. Plant Journal 6: 271282.

Liau C.H., You S.J., Prasad V., Hsiao H.H., Lu J.C., Yang N.S. and Chan M.T. (2003).

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an Oncidium orchid. Plant

Cell Report 21:993-998.

Limanton-Grevet A. and Jullien M. (2004). Agrobacterium-mediated transformation of

Asparagus officinalis L.: molecular and genetic analysis of transgenic plants.

Molecular Breeding 7(2): 141-150.

Mishiba K., Chin D.P. and Mii M. (2005). Agrobacterium-mediated transformation of

Phalaenopsis by targeting protocorms at an early stage after germination. Plant Cell

Report 24: 297-303.

Ozawa K. (2009). Establishment of a high efficiency Agrobacterium-mediated

transformation system of rice (Oryza sativa L.). Plant Science 176: 522-527.

Shou H., Frame B.R., Whitham S.A., and Wang K. (2004). Assessment of transgenic

maize events produced by particle bombardment or Agrobacterium-mediated

transformation. Molecular Breeding 13(2): 201-208.

Yu H., Yao Q., Wang L., Zhao Z., Gong Z., Tang S., Liu Q., and Gu M. (2009).

Generation of selectable marker-free transgenic rice resistant to chewing insects

using two co-transformation systems. Natural Science 19: 1485-1492.

Penulis : Dr Wee Chien Yeong

Pn Rogayah Sekeli

Dr Khairun Hisam Nasir