genetik tumbuhan

Click here to load reader

Post on 24-Nov-2015

122 views

Category:

Documents

7 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

oum

TRANSCRIPT

  • KEJURUTERAAN GENETIK TUMBUHAN

    1.0 Pengenalan kejuruteraan genetik tumbuhan

    Kejuruteraan genetik tumbuhan adalah satu proses yang melibatkan pemindahan gen

    yang membawa maklumat genetik daripada satu orgamisma kepada organisma sasaran

    yang lain dengan menggunakan kaedah teknologi DNA rekombinan. Proses ini

    melibatkan kemasukan, pengubahsuaian atau pembuangan fragmen DNA yang

    mengandungi satu atau lebih gen yang diminati ke dalam tanaman untuk mendapatkan

    ciri fenotip yang diminati. Organisma yang menerima gen baru ini dikenali sebagai

    organisma terubahsuai secara genetik (GMO) atau organisma transgenik.

    Tempoh penghasilan tanaman transgenik mengambil masa yang lama bergantung

    kepada jenis tanaman serta pengesahan biokeselamatan tanaman transgenik yang

    ingin dipasarkan. Lazimnya proses penghasilan tanaman transgenik mengambil masa

    10 15 tahun daripada peringkat makmal hingga ke peringkat komersial.

    1.1 Langkah-langkah dalam penyelidikan kejuruteraan genetik tumbuhan

    Kejuruteraan genetik tumbuhan melibatkan beberapa aktiviti berikut iaitu;

    1. Mengenalpasti dan memencilkan gen yang mempunyai ciri-ciri yang

    dikehendaki,

    2. Pengeklonan gen yang diminati ke dalam vektor transformasi tumbuhan

    yang mengandungi promoter dan terminater contohnya pCAMBIA.

    3. Membangunkan sistem kultur tisu, sistem transformasi dan regenerasi yang

    cekap. Sistem-sistem ini adalah penting untuk menentukan kejayaan

    transformasi sesuatu tanaman.

    4. Transformasi atau pemindahan gen ke dalam tisu tanaman dengan kaedah

    yang sesuai seperti menggunakan kaedah Agrobakterium atau kaedah

    penembakan zarah (Biolistik).

    5. Proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi untuk memilih pokok-

    pokok berpotensi yang mengandungi gen diminati.

    6. Regenerasi tisu yang telah ditransformasi untuk mendapakan plantlet.

  • 7. Analisis pokok-pokok transgenik dengan menggunakan teknik biologi molekul

    seperti tindakbalas rantaian polimerase (PCR), pemblotan Southern,

    pemblotan Northern atau Real Time PCR.

    8. Pemindahan pokok-pokok transgenik positif yang berakar ke polibeg atau

    pot bergantung kepada pokok yang ditransformasi.

    9. Kajian tertutup, kajian lapangan terkawal diikuti kajian lapangan terbuka

    pokok-pokok transgenik.

    10. Kelulusan Biokeselamatan untuk pengeluaran dan pemasaran tumbuhan

    transgenik.

    Carta alir untuk proses yang terlibat dalam teknik kejuruteraan genetik.

    Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan

  • 1.2 Teknik kejuruteraan genetik tumbuhan

    Terdapat beberapa teknik yang boleh digunakan untuk proses pemindahan gen asing

    ke dalam tisu tumbuhan iaitu dengan menggunakan kaedah secara langsung ataupun

    secara tidak langsung. Teknik yang paling meluas digunakan iaitu teknik secara tidak

    langsung dengan berperantara Agrobakterium. Teknik kedua iaitu teknik secara

    langsung seperti kaedah penembakan zarah (biolistik), protoplas dan mikroinjeksi.

    Teknik-teknik tersebut dikenali sebagai teknik secara langsung kerana proses

    transformasi tidak melibatkan perantara.

    1.2.1 Transformasi gen dengan Agrobakterium

    Agrobakterium tumefaciens merupakan bakteria gram negatif yang berbentuk rod.

    Secara semulajadinya bakteria Agrobakterium ini boleh menjangkiti tanaman dan

    menyebabkan satu penyakit yang dikenali sebagai nodul-nodul. Penyakit nodul-nodul

    terhasil apabila Agrobakterium tadi memindahkan bahagian T-DNA dari plasmid yang

    ada pada Agrobakterium tersebut ke dalam nukleus sel dan berintegrasi dengan

    genom tumbuhan. Plasmid ini dikenali sebagai Tumour inducing plamid (Plasmid Ti)

    yang bersaiz lebih kurang 200 kb. Nodul-nodul yang terhasil ini berkeupayaan

    membekalkan sumber karbon kepada Agrobakterium. Keunikan sifat inilah yang

    membolehkan plasmid Ti pada Agrobakterium digunakan sebagai satu alat

    pemindahan gen iaitu dengan menyisipkan gen yang diminati ke bahagian T-DNA

    Agrobakterium tersebut.

    Terdapat tiga komponen penting yang terlibat di dalam pemindahan gen iaitu:

    1. Gen virulen kromosom (chromosomal virulence, chv) yang terdapat dalam

    kromosom Agrobakterium terlibat dalam proses perlekatan Agrobakterium

    dengan sel tumbuhan.

    2. Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada Ti-plasmid berperanan untuk

    menginduksi permindahan dan juga integrasi T-DNA.

    3. Kawasan T-DNA yang merangkumi daerah LB (left border) hingga RB (right

    border) pada Ti-plasmid mengandungi gen-gen penting untuk Agrobakterium

    berfungsi.

  • Teknik Agrobakterium merupakan sistem transformasi yang paling meluas digunakan

    dalam proses transformasi tumbuhan terutamanya terhadap tumbuhan dikotiledon.

    Teknik ini pada awalnya dipercayai hanya boleh digunakan untuk pemindahan gen

    terhadap tumbuhan dikotiledon sahaja, tetapi selepas kajian intensif dilakukan

    terhadap tumbuhan monokotiledon, membuktikan teknik Agrobakterium ini boleh

    juga digunakan untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Hiei et al., (1994; 1997)

    ialah saintis pertama yang melaporkan bahawa teknik Agrobakterium boleh digunakan

    untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Antara tanaman yang berjaya

    ditransformasi dengan teknik Agrobakterium seperti padi, jagung, orkid dan asparagus

    (Yu et. al., 2009; Ozawa, 2009; Shou et. al., 2004; Mishiba et. al., 2005; Liau et. al.,

    2003; Limanton-Grevet and Jullien, 2004 dan Delbreil et. al., 1993).

    Teknik berperantara Agrobakterium ini paling digemari dan mempunyai kelebihan

    kerana ianya berkeupayaan mengintegrasi dan memindahkan T-DNA ke dalam genom

    tanaman tanpa melibatkan penggunaan peralatan yang sofistikated dan canggih

    berbanding teknik pemindahan gen yang lain. Selain itu, kelebihan lain teknik

    berperantara Agrobakterium ini ialah jumlah salinan gen yang terintegrasi pada

    genom tanaman biasanya hanya satu salinan dan ini dapat mengurangkan gangguan

    terhadap fungsi gen-gen lain dalam tumbuhan tersebut.

    Walau bagaimanapun keberkesanan teknik ini terbatas kepada genotip tanaman dan

    teknik ini juga melibatkan banyak penggunaan antibiotik. Antibiotik diperlukan

    samada untuk proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi dan juga untuk

    mengawal lebihan pertumbuhan Agrobakterium.

    1.2.1.1 Proses transformasi dengan Agrobakterium

    i. Penyediaan kultur Agrobakterium

    Strain Agrobakterium yang digunakan mestilah bersesuaian dengan pokok yang

    ditransformasikan. Pemilihan strain berdasar kepada keupayaan strain tersebut

    memindahkan gen yang dikehendaki ke dalam tisu tumbuhan. Kebiasaanya strain yang

    mempunyai kecekapan transformasi yang tinggi dipilih. Terdapat banyak jenis strain

  • Agrobakterium, seperti LBA 4404, AGL1, EHA 101 dan EHA 105. Selain pemilihan

    strain, vektor transformasi tumbuhan yang digunakan juga mestilah bersesuaian

    berdasar kepada gen penanda pemilihan yang dimiliki oleh vektor tersebut. Strain

    Agrobakterium yang super virulen bergabung dengan vektor transformasi tumbuhan

    yang bersesuaian akan meningkatkan kecekapan proses transformasi.

    Gen konstruk yang ditransformasikan ke dalam Agrobakterium kebiasaanya disimpan

    dalam bentuk gliserol dan disimpan pada suhu -80C sebagai kultur stok. Untuk tujuan

    transformasi, stok gliserol tadi dilakar ke atas media pejal Luria Bertani (LB) yang

    mengandungi antibiotik untuk pemilihan Agrobakterium yang mengandungi konstruk

    yang betul dan dieram selama 3 hari pada suhu 28C. Koloni yang tumbuh selepas 3

    hari dikulturkan ke dalam media cecair LB yang mengandungi antibiotik yang sama

    dan digoncang dalam alat pengeraman selama 3 hari pada suhu yang sama dengan

    kelajuan 280 rpm.

    Kultur bakteria yang terhasil akan dimendakkan dengan alat pengempar pada kelajuan

    6000 rpm selama 15 minit. Pellet yang terbentuk dilarutkan semula ke dalam media

    cecair dan digoncang pada suhu dan kelajuan yang sama sehingga mencapai fasa aktif

    pertumbuhan atau fasa logaritma dengan ketumpatan optik (OD) 0.2- 0.5. Pemilihan

    Ketumpatan optik (OD) yang digunakan bergantung kepada kecekapan sistem

    transformasi sesuatu tumbuhan. Kebiasannya ketumpatan optik yang digunakan antara

    0.2-0.5. Walau bagaimanapun sesetengah tumbuhan menggunakan ketumpatan optik

    yang lebih tinggi iaitu 1.0.

    Media cecair juga biasanya mempunyai nilai pH yang rendah antara 5.2-5.3 dan

    ditambah dengan bahan kimia asetosiringone. Asetosiringone berperanan memberi

    isyarat kepada gen-gen virulen yang terlibat dalam mekanisma pemindahan gen.

    Adakalanya, tanpa penambahan asetosiringone, proses transformasi gen tidak akan

    berlaku di dalam sesetengah tumbuhan. Kepekatan asetosiringone yang lazim

    digunakan dalam transformasi Agrobakterium ialah 100 - 200 M.

  • ii. Transformasi tisu tumbuhan

    Tisu yang hendak ditransformasi direndam dalam larutan Agrobakterium selama 30-40

    minit. Kemudian diletakkan di atas kerta turas selama 15-30 minit untuk

    mengeringkan lebihan Agrobakterium sebelum dikulturkan ke media ko-kultivasi.

    Media ko-kultivasi juga mempunyai nilai pH yang rendah untuk meningkatkan

    kecekapan pengekpresan gen vir.

    Jangkamasa ko-kultivasi yang optimum adalah penting untuk penyerapan

    Agrobakterium ke dalam sel tisu tumbuhan. Masa ko-kultivasi yang terlalu singkat

    boleh menjejaskan kecekapan transformasi. Tetapi sekiranya masa ko-kultivasi terlalu