genetik tumbuhan

KEJURUTERAAN GENETIK TUMBUHAN

1.0 Pengenalan kejuruteraan genetik tumbuhan

Kejuruteraan genetik tumbuhan adalah satu proses yang melibatkan pemindahan gen

yang membawa maklumat genetik daripada satu orgamisma kepada organisma sasaran

yang lain dengan menggunakan kaedah teknologi DNA rekombinan. Proses ini

melibatkan kemasukan, pengubahsuaian atau pembuangan fragmen DNA yang

mengandungi satu atau lebih gen yang diminati ke dalam tanaman untuk mendapatkan

ciri fenotip yang diminati. Organisma yang menerima gen baru ini dikenali sebagai

organisma terubahsuai secara genetik (GMO) atau organisma transgenik.

Tempoh penghasilan tanaman transgenik mengambil masa yang lama bergantung

kepada jenis tanaman serta pengesahan biokeselamatan tanaman transgenik yang

ingin dipasarkan. Lazimnya proses penghasilan tanaman transgenik mengambil masa

10 15 tahun daripada peringkat makmal hingga ke peringkat komersial.

1.1 Langkah-langkah dalam penyelidikan kejuruteraan genetik tumbuhan

Kejuruteraan genetik tumbuhan melibatkan beberapa aktiviti berikut iaitu;

1. Mengenalpasti dan memencilkan gen yang mempunyai ciri-ciri yang

dikehendaki,

2. Pengeklonan gen yang diminati ke dalam vektor transformasi tumbuhan

yang mengandungi promoter dan terminater contohnya pCAMBIA.

3. Membangunkan sistem kultur tisu, sistem transformasi dan regenerasi yang

cekap. Sistem-sistem ini adalah penting untuk menentukan kejayaan

transformasi sesuatu tanaman.

4. Transformasi atau pemindahan gen ke dalam tisu tanaman dengan kaedah

yang sesuai seperti menggunakan kaedah Agrobakterium atau kaedah

penembakan zarah (Biolistik).

5. Proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi untuk memilih pokok-

pokok berpotensi yang mengandungi gen diminati.

6. Regenerasi tisu yang telah ditransformasi untuk mendapakan plantlet.

7. Analisis pokok-pokok transgenik dengan menggunakan teknik biologi molekul

seperti tindakbalas rantaian polimerase (PCR), pemblotan Southern,

pemblotan Northern atau Real Time PCR.

8. Pemindahan pokok-pokok transgenik positif yang berakar ke polibeg atau

pot bergantung kepada pokok yang ditransformasi.

9. Kajian tertutup, kajian lapangan terkawal diikuti kajian lapangan terbuka

pokok-pokok transgenik.

10. Kelulusan Biokeselamatan untuk pengeluaran dan pemasaran tumbuhan

transgenik.

Carta alir untuk proses yang terlibat dalam teknik kejuruteraan genetik.

Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan

1.2 Teknik kejuruteraan genetik tumbuhan

Terdapat beberapa teknik yang boleh digunakan untuk proses pemindahan gen asing

ke dalam tisu tumbuhan iaitu dengan menggunakan kaedah secara langsung ataupun

secara tidak langsung. Teknik yang paling meluas digunakan iaitu teknik secara tidak

langsung dengan berperantara Agrobakterium. Teknik kedua iaitu teknik secara

langsung seperti kaedah penembakan zarah (biolistik), protoplas dan mikroinjeksi.

Teknik-teknik tersebut dikenali sebagai teknik secara langsung kerana proses

transformasi tidak melibatkan perantara.

1.2.1 Transformasi gen dengan Agrobakterium

Agrobakterium tumefaciens merupakan bakteria gram negatif yang berbentuk rod.

Secara semulajadinya bakteria Agrobakterium ini boleh menjangkiti tanaman dan

menyebabkan satu penyakit yang dikenali sebagai nodul-nodul. Penyakit nodul-nodul

terhasil apabila Agrobakterium tadi memindahkan bahagian T-DNA dari plasmid yang

ada pada Agrobakterium tersebut ke dalam nukleus sel dan berintegrasi dengan

genom tumbuhan. Plasmid ini dikenali sebagai Tumour inducing plamid (Plasmid Ti)

yang bersaiz lebih kurang 200 kb. Nodul-nodul yang terhasil ini berkeupayaan

membekalkan sumber karbon kepada Agrobakterium. Keunikan sifat inilah yang

membolehkan plasmid Ti pada Agrobakterium digunakan sebagai satu alat

pemindahan gen iaitu dengan menyisipkan gen yang diminati ke bahagian T-DNA

Agrobakterium tersebut.

Terdapat tiga komponen penting yang terlibat di dalam pemindahan gen iaitu:

1. Gen virulen kromosom (chromosomal virulence, chv) yang terdapat dalam

kromosom Agrobakterium terlibat dalam proses perlekatan Agrobakterium

dengan sel tumbuhan.

2. Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada Ti-plasmid berperanan untuk

menginduksi permindahan dan juga integrasi T-DNA.

3. Kawasan T-DNA yang merangkumi daerah LB (left border) hingga RB (right

border) pada Ti-plasmid mengandungi gen-gen penting untuk Agrobakterium

berfungsi.

Teknik Agrobakterium merupakan sistem transformasi yang paling meluas digunakan

dalam proses transformasi tumbuhan terutamanya terhadap tumbuhan dikotiledon.

Teknik ini pada awalnya dipercayai hanya boleh digunakan untuk pemindahan gen

terhadap tumbuhan dikotiledon sahaja, tetapi selepas kajian intensif dilakukan

terhadap tumbuhan monokotiledon, membuktikan teknik Agrobakterium ini boleh

juga digunakan untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Hiei et al., (1994; 1997)

ialah saintis pertama yang melaporkan bahawa teknik Agrobakterium boleh digunakan

untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Antara tanaman yang berjaya

ditransformasi dengan teknik Agrobakterium seperti padi, jagung, orkid dan asparagus

(Yu et. al., 2009; Ozawa, 2009; Shou et. al., 2004; Mishiba et. al., 2005; Liau et. al.,

2003; Limanton-Grevet and Jullien, 2004 dan Delbreil et. al., 1993).

Teknik berperantara Agrobakterium ini paling digemari dan mempunyai kelebihan

kerana ianya berkeupayaan mengintegrasi dan memindahkan T-DNA ke dalam genom

tanaman tanpa melibatkan penggunaan peralatan yang sofistikated dan canggih

berbanding teknik pemindahan gen yang lain. Selain itu, kelebihan lain teknik

berperantara Agrobakterium ini ialah jumlah salinan gen yang terintegrasi pada

genom tanaman biasanya hanya satu salinan dan ini dapat mengurangkan gangguan

terhadap fungsi gen-gen lain dalam tumbuhan tersebut.

Walau bagaimanapun keberkesanan teknik ini terbatas kepada genotip tanaman dan

teknik ini juga melibatkan banyak penggunaan antibiotik. Antibiotik diperlukan

samada untuk proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi dan juga untuk

mengawal lebihan pertumbuhan Agrobakterium.

1.2.1.1 Proses transformasi dengan Agrobakterium

i. Penyediaan kultur Agrobakterium

Strain Agrobakterium yang digunakan mestilah bersesuaian dengan pokok yang

ditransformasikan. Pemilihan strain berdasar kepada keupayaan strain tersebut

memindahkan gen yang dikehendaki ke dalam tisu tumbuhan. Kebiasaanya strain yang

mempunyai kecekapan transformasi yang tinggi dipilih. Terdapat banyak jenis strain

Agrobakterium, seperti LBA 4404, AGL1, EHA 101 dan EHA 105. Selain pemilihan

strain, vektor transformasi tumbuhan yang digunakan juga mestilah bersesuaian

berdasar kepada gen penanda pemilihan yang dimiliki oleh vektor tersebut. Strain

Agrobakterium yang super virulen bergabung dengan vektor transformasi tumbuhan

yang bersesuaian akan meningkatkan kecekapan proses transformasi.

Gen konstruk yang ditransformasikan ke dalam Agrobakterium kebiasaanya disimpan

dalam bentuk gliserol dan disimpan pada suhu -80C sebagai kultur stok. Untuk tujuan

transformasi, stok gliserol tadi dilakar ke atas media pejal Luria Bertani (LB) yang

mengandungi antibiotik untuk pemilihan Agrobakterium yang mengandungi konstruk

yang betul dan dieram selama 3 hari pada suhu 28C. Koloni yang tumbuh selepas 3

hari dikulturkan ke dalam media cecair LB yang mengandungi antibiotik yang sama

dan digoncang dalam alat pengeraman selama 3 hari pada suhu yang sama dengan

kelajuan 280 rpm.

Kultur bakteria yang terhasil akan dimendakkan dengan alat pengempar pada kelajuan

6000 rpm selama 15 minit. Pellet yang terbentuk dilarutkan semula ke dalam media

cecair dan digoncang pada suhu dan kelajuan yang sama sehingga mencapai fasa aktif

pertumbuhan atau fasa logaritma dengan ketumpatan optik (OD) 0.2- 0.5. Pemilihan

Ketumpatan optik (OD) yang digunakan bergantung kepada kecekapan sistem

transformasi sesuatu tumbuhan. Kebiasannya ketumpatan optik yang digunakan antara

0.2-0.5. Walau bagaimanapun sesetengah tumbuhan menggunakan ketumpatan optik

yang lebih tinggi iaitu 1.0.

Media cecair juga biasanya mempunyai nilai pH yang rendah antara 5.2-5.3 dan

ditambah dengan bahan kimia asetosiringone. Asetosiringone berperanan memberi

isyarat kepada gen-gen virulen yang terlibat dalam mekanisma pemindahan gen.

Adakalanya, tanpa penambahan asetosiringone, proses transformasi gen tidak akan

berlaku di dalam sesetengah tumbuhan. Kepekatan asetosiringone yang lazim

digunakan dalam transformasi Agrobakterium ialah 100 - 200 M.

ii. Transformasi tisu tumbuhan

Tisu yang hendak ditransformasi direndam dalam larutan Agrobakterium selama 30-40

minit. Kemudian diletakkan di atas kerta turas selama 15-30 minit untuk

mengeringkan lebihan Agrobakterium sebelum dikulturkan ke media ko-kultivasi.

Media ko-kultivasi juga mempunyai nilai pH yang rendah untuk meningkatkan

kecekapan pengekpresan gen vir.

Jangkamasa ko-kultivasi yang optimum adalah penting untuk penyerapan

Agrobakterium ke dalam sel tisu tumbuhan. Masa ko-kultivasi yang terlalu singkat

boleh menjejaskan kecekapan transformasi. Tetapi sekiranya masa ko-kultivasi terlalu