skripsi fix dini pdf

i

DERAJAT PARASITEMIA MENCIT GALUR BALB/c

YANG DIVAKSINASI KELENJAR SALIVA Anopheles sundaicus

SEBAGAI MODEL Transmission Blocking Vaccine (TBV)

MELAWAN MALARIA

SKRIPSI

Oleh

Windradini Rahvian Aridama

NIM 092010101026

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS JEMBER

2013

ii




MELAWAN MALARIA

SKRIPSI

diajukan guna melengkapi tugas akhir dan memenuhi salah satu syarat

untuk menyelesaikan Program Studi Pendidikan Dokter (S1) dan mencapai gelar Sarjana Kedokteran

Oleh


NIM 092010101026

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS JEMBER

2013

iii

PERSEMBAHAN

Skripsi ini saya persembahkan untuk:

1. Kedua orang tuaku tercinta, ayahanda Wijiono Arianto dan ibunda Anis Tri

Ubaidiati. Terima kasih atas segala doa, dukungan, perhatian, kasih sayang

dan semua pengorbanan yang telah diberikan demi meraih cita-citaku;

2. Adikku Naksa Garnida Arfie yang telah memberikan dukungan dan

semangat untuk terus maju;

3. Guru-guruku yang telah mendidik dengan penuh kesabaran dari taman

kanak-kanak hingga perguruan tinggi;

4. Almamater Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

iv

MOTTO

pemalas, pesimis, dan penunda tidak mungkin dipercaya untuk pekerjaan besar

di tempat baik dan dibayar besar.

Kualitas perilaku menentukan kualitas nasib.

(Mario Teguh)

v

PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

nama : Windradini Rahvian Aridama

NIM : 092010101026

menyatakan dengan sesungguhnya bahwa karya tulis ilmiah yang berjudul Derajat

Parasitemia Mencit Galur BALB/c yang Divaksinasi Kelenjar Saliva Anopheles

sundaicus sebagai Model Transmission Blocking Vaccine (TBV) Melawan

Malaria adalah benar-benar hasil karya sendiri, kecuali kutipan yang sudah saya

sebutkan sumbernya, belum pernah diajukan pada institusi mana pun, dan bukan

karya jiplakan. Saya bertanggung jawab atas keabsahan dan kebenaran isinya sesuai

dengan sikap ilmiah yang harus dijunjung tinggi.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya, tanpa ada tekanan

dan paksaan dari pihak mana pun serta bersedia mendapat sanksi akademik jika

ternyata dikemudian hari pernyataan ini tidak benar.

Jember, 25 February 2013

Yang menyatakan,


NIM 092010101026

vi

SKRIPSI




MELAWAN MALARIA

Oleh


NIM 092010101026

Pembimbing

Dosen Pembimbing Utama : Dr. rer. nat. Kartika Senjarini S.Si., M.Si.

Dosen Pembimbing Anggota : dr. Sugiyanta, M.Ked.

vii

PENGESAHAN

Skripsi berjudul Derajat Parasitemia Mencit Galur BALB/c yang Divaksinasi

Kelenjar Saliva Anopheles sundaicus sebagai Model Transmission Blocking

Vaccine (TBV) Melawan Malaria telah diuji dan disahkan oleh Fakultas

Kedokteran Universitas Jember pada:

hari, tanggal : Senin, 25 Februari 2013

tempat : Fakultas Kedokteran Universitas Jember

Tim Penguji

Mengesahkan

Dekan Fakultas Kedokteran

dr. Enny Suswati, M.Kes

NIP 197002141999032001

Penguji I

dr. Yudha Nurdian, M.Kes

NIP. 197110191999031001

Penguji II

dr. Diana Chusna Mufida, M.Kes

NIP 197203182003122001

Penguji III

Dr. rer. nat. Kartika Senjarini S.Si., M.Si

NIP 197509132000032001

Penguji IV

dr. Sugiyanta, M.Ked

NIP 197902072005011001

viii

RINGKASAN

Derajat Parasitemia Mencit Galur BALB/c yang Divaksinasi Kelenjar Saliva

Anopheles sundaicus sebagai Model Transmission Blocking Vaccine (TBV)

Melawan Malaria; Windradini Rahvian Aridama; 092010101026; 2013; 50

halaman; Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Malaria merupakan penyakit infeksi yang menjadi salah satu masalah

kesehatan utama di dunia. Di Asia Tenggara, sepuluh dari sebelas negara

merupakan negara endemis malaria termasuk Indonesia. Penyakit ini disebabkan

oleh Plasmodium dan ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina.

Anopheles sundaicus (An. sundaicus) merupakan salah satu vektor malaria di

Indonesia. Sampai saat ini berbagai upaya yang telah dilakukan untuk memberantas

malaria namun belum memberikan hasil yang optimal sehingga diperlukan suatu

terobosan baru untuk mengatasi penyakit tersebut. Transmission Blocking Vaccine

(TBV) berbasis kelenjar saliva vektor merupakan salah satu vaksin yang sedang

dikembangkan untuk memberantas malaria.

Protein imunomodulator dalam kelenjar saliva vektor diduga mampu

mempengaruhi respon imun serta memberi efek proteksi pada inang. Penelitian

terdahulu menyebutkan bahwa pajanan pertama dari saliva vektor menyebabkan

pergeseran respon imun dari Th1 ke Th2 yang menguntungkan vektor. Pajanan

berulang dari saliva vektor menyebabkan pergeseran respon imun yang berlawanan

dari sebelumnya yaitu dari Th2 ke Th1 yang menguntungkan hospes. Sel Th1

menghasilkan sitokin IFN- untuk mengaktivasi makrofag sehingga mampu

menghambat pertumbuhan parasit malaria. Dalam penelitian ini diamati potensi

kelenjar saliva vektor malaria An. sundaicus dalam menghambat pertumbuhan

parasit malaria yang ditunjukkan dengan derajat parasitemia hewan coba.

Hewan coba yang digunakan adalah mencit betina galur BALB/c berusia 6-

8 minggu sebanyak 45 ekor yang dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok

kontrol, kelompok perlakuan pellet dan kelompok perlakuan supernatan. Masing-

masing kelompok terdiri dari 15 ekor mencit. Kelompok kontrol divaksinasi dengan

campuran adjuvan aluminum hidroksida dan larutan PBS, kelompok perlakuan

ix

pellet divaksinasi dengan vaksin model pellet kelenjar saliva An. sundaicus, dan

kelompok perlakuan supernatan divaksinasi dengan vaksin model supernatan

kelenjar saliva An. sundaicus. Vaksinasi diberikan secara subkutan pada femur

bagian luar. Vaksinasi dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval waktu 2 minggu.

Dua minggu pasca vaksinasi terakhir, hewan coba diinjeksi Plasmodium berghei

secara intraperitonial. Empat puluh delapan jam kemudian dilakukan pembuatan

hapusan darah tepi dari ekor mencit untuk pengamatan derajat parasitemia.

Hasil penelitian menggunakan kelenjar saliva An. sundaicus menunjukkan

bahwa mencit perlakuan yang divaksinasi vaksin model kelenjar saliva An.

sundaicus memiliki derajat parasitemia yang lebih rendah dibandingkan kelompok

kontrol yang tidak divaksinasi. Kelompok perlakuan pellet memiliki derajat

parasitemia yang lebih rendah dibandingkan kelompok perlakuan supernatan

sedangkan kelompok perlakuan supernatan memiliki derajat parasitemia yang lebih

rendah dibandingkan kelompok kontrol. Hal ini dimungkinkan protein

imunomodulator lebih dominan terdapat pada fraksi insoluble pellet. Rendahnya

derajat parasitemia pada kelompok perlakuan supernatan mengindikasikan bahwa

komponen protein imunomodulator juga terdapat di bagian supernatan dan bersifat

soluble. Dengan demikian fraksi insoluble pellet dan fraksi soluble supernatan

sama-sama berperan dalam menekan pertumbuhan parasit malaria pada hewan coba

yang ditunjukkan dengan derajat parasitemia mencit kelompok perlakuan yang

cenderung lebih rendah dibandingkan dengan mencit kelompok kontrol.

x

PRAKATA

Puji Syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul Derajat Parasitemia

Mencit Galur BALB/c yang Divaksinasi Kelenjar Saliva Anopheles sundaicus

sebagai Model Transmission Blocking Vaccine (TBV) Melawan Malaria. Skripsi

ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan

strata satu (S1) pada Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Penyusunan ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu,

penulis menyampaikan terima kasih kepada:

1. dr. Enny Suswati, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas

Jember;

2. Dr. rer. nat. Kartika Senjarini S.Si., M.Si selaku Dosen Pembimbing I dan dr.

Sugiyanta, M.Ked. selaku Dosen Pembimbing II yang telah banyak membantu

dan meluangkan waktu, pikiran, dan perhatian untuk membimbing penulisan

skripsi hingga akhir;

3. dr. Yunita Armiyanti, M.Kes. yang sudah memberikan kesempatan untuk

masuk ke dalam kelompok TBV Research Group dan juga telah banyak

membantu serta meluangkan waktu, pikiran, perhatiannya untuk membimbing

penulisan skripsi ini;

4. dr. Yudha Nurdian, M.Kes dan dr. Diana Chusna Mufida, M.Kes selaku dosen

penguji atas kesediaannya untuk turut memberikan saran dan penilaian

terhadap skripsi ini;

5. Kepala Laboratorium beserta staf Laboratorium Mikrobiologi, Biologi Dasar,

dan Zoologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

(FMIPA) Universitas Jember atas bantuan dan kerjasamanya;

6. Mama dan Papa, serta Adikku yang selalu berdoa untuk kesuksesan dan

keberhasilanku;

7. Rekan kerja seperjuangan Dani, Harmas, Pak Ali, Pak Adrial, kakak-kakak

Jurusan Biologi Fakultas MIPA Mbak Esti, Mbak Dina, Mbak Riska, Mbak

xi

Ika, Mas Imam, Mas Syubanul, Mas Arif, Mbak Dewi, Mbak Mada, Mba

Azizah, Mbak Niear, Mbak Lupink, dkk. atas kebaikan dan bantuan yang

kalian berikan;

8. Kakak-kakak Fakultas Kedokteran Mbak Lina, Mbak Vinny, Mbak Ina, Mbak

Thania, dan Mbak Wiwik atas bantuan dan motivasi yang diberikan;

9. Sahabat-sahabatku Ira, Wulan, Roat, dan Aulia, yang selalu membantu dan

memberikan semangat;

10. Rekan-rekan angkatan 2009 Avicenna atas motivasi, dukungan dan bantuan

dalam pengerjaan skripsi ini;

11. Dan akhirnya kepada semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu

atas bantuannya dalam menyelesaikan peneitian ini dan telah mendoakan demi

suksesnya ujian skripsi ini.

Penulis juga menerima segala kritik dan saran dari semua pihak demi

kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya penulis berharap, semoga skripsi ini dapat

bermanfaat.

Jember, Februari 2013 Penulis

xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................... ii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................. iii

HALAMAN MOTTO ............................................................................................. iv

HALAMAN PERNYATAAN ................................................................................. v

HALAMAN PEMBIMBINGAN ............................................................................. vi

HALAMAN PENGESAHAN.................................................................................. vii

RINGKASAN .......................................................................................................... viii

PRAKATA .............................................................................................................. x

DAFTAR ISI ........................................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................... xv

BAB 1. PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1. Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2. Rumusan masalah ............................................................................. 3

1.3. Tujuan penelitian ............................................................................... 3

1.3.1 Tujuan Umum ............................................................................ 3

1.3.2 Tujuan Khusus ........................................................................... 3

1.4. Manfaat Penelitian ............................................................................ 3

BAB 2. Tinjauan pustaka ....................................................................................... 5

2.1. Malaria .............................................................................................. 5

2.1.1 Definisi ...................................................................................... 5

2.1.2 Etiologi ...................................................................................... 5

2.1.3 Distribusi dan Insiden ................................................................. 6

2.1.4 Siklus Hidup Plasmodium .......................................................... 6

2.1.5 Patogenesis ................................................................................ 8

2.1.6 Manifestasi Klinis ...................................................................... 9

2.1.7 Diagnosis ................................................................................... 10

2.1.8 Penatalaksanaan ......................................................................... 12

2.2 Anopheles sundaicus sebagai Vektor Malaria .................................... 13

2.3 Peran Saliva Nyamuk dalam Transmisi Patogen ............................. 15

xiii

2.3.1 Morfologi Kelenjar Saliva Nyamuk ............................................ 15

2.3.2 Respon Imun Saliva Vektor ........................................................ 16

2.4 Perkembangan Vaksin Malaria ........................................................ 18

2.5 Transmission Blocking Vaccine sebagai Penanggulangan -

Malaria ............................................................................................. 19

2.6 Kerangka Konseptual ......................................................................... 23

2.7 Hipotesis ............................................................................................. 24

BAB 3. Metode Penelitian ....................................................................................... 25

3.1 Jenis Penelitian ................................................................................... 25

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 25

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian ......................................................... 25

3.3.1 Populasi Penelitian ..................................................................... 25

3.3.2 Sampel Penelitian ....................................................................... 25

3.4 Variabel Penelitian ............................................................................. 26

3.5 Definisi Operasional ........................................................................... 26

3.5.1 Kelenjar saliva Anopheles sundaicus ......................................... 26

3.5.2 Derajat Parasitemia .................................................................. 26

3.5.3 Vaksin Model Pellet ................................................................. 26

3.5.4 Vaksin Model Supernatan ......................................................... 27

3.6 Rancangan Penelitian ........................................................................ 27

3.7 Instrumen Penelitian .......................................................................... 28

3.7.1 Alat Penelitian ............................................................................ 28

3.7.2 Bahan Penelitian ......................................................................... 28

3.8 Prosedur Penelitian ............................................................................ 28

3.8.1 Preparasi Kelenjar Saliva .......................................................... 28

3.8.2 Preparasi Hewan Coba ............................................................. 28

3.8.3 Preparasi Vaksin Model Kelenjar Saliva An. sundaicus dan

Vaksinasi ................................................................................. 29

3.8.4 Preparasi Plasmodium berghei ................................................. 30

3.8.5 Inokulasi Plasmodium berghei pada Hewan Coba .................... 30

3.8.6 Penghitungan Derajat Parasitemia ............................................ 31

3.9 Alur Penelitian ................................................................................. 32

3.10 Penyajian Data .................................................................................. 33

xiv

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 34

4.1 HASIL PENELITIAN ...................................................................... 34

4.1.1 Isolasi Kelenjar Anopheles sundaicus ........................................ 34

4.1.2 Preparasi Vaksin dan Vaksinasi .................................................. 34

4.1.3 Derajat Parasitemia .................................................................... 35

4.2 PEMBAHASAN ................................................................................. 38

4.2.1 Kelenjar Saliva Anopheles sundaicus .......................................... 38

4.2.2 Preparasi Model Vaksin dan Vaksinasi ....................................... 39

4.2.3 Pengaruh Injeksi Model Vaksin Kelenjar Saliva

terhadap Hitungan Derajat Parasitemia Hewan Coba ................. 42

BAB 5. PENUTUP .................................................................................................. 44

5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 44

5.2 Saran ................................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 45

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Siklus hidup Plasmodium .......................................................... 7

Gambar 2.2 Anopheles sundaicus ................................................................. 14

Gambar 2.3 Kelenjar saliva nyamuk ............................................................. 15

Gambar 2.4 Peran protein saliva vektor arthropoda dalam memodulasi

respon hemostasis pada hospes................................................. 17

Gambar 2.5 Skema hipotesis mekanisme kerja TBV .................................... 20

Gambar 4.1 Hasil isolasi kelenjar saliva An. sundaicus................................ 34

Gambar 4.2 Hapusan darah mencit pasca inokulasi Plasmodium berghei ... 36

Gambar 4.3 Grafik perkembangan derajat parasitemia (%) pada populasi (n=3)

dalam kelompok ......................................................................... 36

Gambar 4.4 Grafik perkembangan derajat parasitemia (%) dengan ulangan

individu......................................................................... 37

Gambar 4.5 Kelenjar saliva Anopheles betina .................................................. 38

1BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Malaria merupakan penyakit infeksi yang masih menjadi salah satu

masalah kesehatan utama di dunia. Penyakit ini telah menyebabkan kematian

hampir sekitar satu juta penduduk dunia setiap tahunnya. Infeksi malaria tersebar

pada 100 negara di benua Afrika, Asia, Amerika (bagian selatan), daerah Oceania

dan Kepulauan Karibia (Harijanto, 2007). Di Asia Tenggara, sepuluh dari sebelas

negara merupakan negara endemis malaria, termasuk Indonesia (WHO, 2011).

Pada tahun 2009, Kejadian Luar Biasa (KLB) dilaporkan terjadi di Pulau Jawa

(Jawa tengah, Jawa Timur, dan Banten), Kalimantan (Kalimantan Selatan),

Sulawesi (Sulawesi Barat), NAD dan Sumatera (Sumatera Barat, Lampung)

dengan total jumlah penderita adalah 1.869 orang dan meninggal sebanyak 11

orang (Kemenkes, 2011).

Beberapa upaya untuk menekan angka kesakitan dan kematian telah

dilakukan melalui program pemberantasan malaria yang kegiatannya antara lain

meliputi diagnosis dini, pengobatan cepat dan tepat, surveilans, dan pengendalian

vektor yang kesemuanya ditujukan untuk memutuskan mata rantai penularan

malaria (Kemenkes, 2011). Namun saat ini telah terjadi resistensi terhadap obat

antimalaria dan resistensi nyamuk yang menjadi vektor malaria terhadap

insektisida. Maka dari itu, diperlukan suatu terobosan baru untuk mengatasi

masalah tersebut dimana salah satunya adalah pembuatan vaksin malaria

(Greenwood dan Motabingwa, 2002)

Arah pengembangan vaksin dilakukan dengan beberapa pendekatan yang

berbeda. Hal ini disebabkan siklus hidup parasit malaria yang sifatnya kompleks

(Lavazec et al., 2007). Pada prinsipnya terdapat tiga jenis vaksin yang

dikembangkan berdasarkan stadium perkembangan parasit, yaitu vaksin stadium

pre-eritrositik, vaksin stadium eritrositik (stadium aseksual) dan Transmission

Blocking Vaccine (TBV) (Sharma dan Pathak, 2008). Jenis vaksin terakhir

2merupakan salah satu jenis vaksin yang menghambat siklus hidup parasit dengan

menginduksi antibodi yang akan menghalangi parasit untuk berkembang di dalam

tubuh nyamuk sesaat setelah menghisap darah orang yang telah divaksinasi

(Ambarita, 2010). Salah satu kandidat TBV yang dikembangkan adalah berbasis

parasit dengan target diantaranya adalah gametocytes antigen yang diekspresikan

pada gametosit jantan dan betina dan ookinets antigen (Brennan et al., 2000; Titus

et al., 2006; Chattopadhyay dan Kumar, 2009; Ramirez et al., 2009). Beberapa

tahun terakhir perkembangan TBV menunjukkan konsep TBV berbasis vektor

atau vaksin stadium nyamuk (mosquitos stage vaccine) dimana salah satu target

yang digunakan adalah kelenjar saliva vektor (Chattopadhyay dan Kumar, 2009)

Saat nyamuk menghisap darah secara bersamaan saliva nyamuk masuk

dalam sirkulasi inang. Protein imunomodulator dalam saliva nyamuk merupakan

salah satu komponen yang bersifat imunosupresif. Protein ini bekerja dengan cara

mempengaruhi pergeseran respon imun inang ke arah Th2 yang menguntungkan

vektor (Titus et al., 2006). Paparan berulang dari saliva ternyata menunjukkan

pergeseran respon imun dari Th2 ke arah Th1 yang bersifat protektif pada inang.

Penelitian yang dilakukan oleh Donovan et al. (2007) menunjukkan bahwa

paparan berulang dari saliva vektor malaria Anopheles stephensi dapat membatasi

perkembangan pertumbuhan Plasmodium yoelii di dalam tubuh hewan coba

dengan cara mempengaruhi respon imun sistemik maupun lokal. Penelitian lain

yang menggunakan kelenjar saliva vektor sand flies pada Leishmaniasis juga

menunjukkan adanya hambatan pertumbuhan patogen pada hewan coba

(Kamhawi et al., 2000). Penelitian ini mendasari hipotesis bahwa kelenjar saliva

vektor malaria dapat mencegah terjadinya penyebaran parasit sehingga dapat

dijadikan sebagai salah satu kandidat untuk pengembangan TBV melawan

malaria.

Vektor yang berperan dalam penyebaran malaria adalah nyamuk

Anopheles betina. Jumlah spesies Anopheles di Indonesia mencapai 80 species, 24

diantaranya merupakan vektor malaria. Salah satu dari vektor malaria tersebut

adalah Anopheles sundaicus (Dale, 2005). Anopheles sundaicus merupakan salah

satu vektor utama penyebaran malaria di Pulau Sumatera, Jawa, Sulawesi dan

3Nusa Tenggara (Natadisastra, 2009). Berdasarkan uraian di atas diperlukan adanya

penelitian untuk mengetahui potensi kelenjar saliva vektor malaria Anopheles

sundaicus sebagai salah satu model Transmission Blocking Vaccine (TBV)

melawan malaria.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari penelitian ini adalah bagaimanakah derajat

parasitemia mencit galur BALB/c yang divaksinasi dengan vaksin model kelenjar

saliva (fraksi pellet dan supernatan) Anopheles sundaicus?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini diuraikan menjadi tujuan umum dan tujuan khusus:

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengetahui potensi kelenjar saliva Anopheles sundaicus sebagai

salah satu kandidat target dalam pengembangan Transmission Blocking

Vaccine (TBV) berbasis kelenjar saliva vektor melawan malaria.

1.3.2 Tujuan Khusus

1. Membandingkan derajat parasitemia mencit BALB/c yang divaksinasi

dengan vaksin model kelenjar saliva Anopheles sundaicus dengan

kelompok kontrol yang tidak divaksinasi.

2. Membandingkan derajat parasitemia mencit BALB/c pada kelompok

perlakuan pellet dengan kelompok perlakuan supernatan.

1.4 Manfaat Penelitian

a. Penelitian ini akan memberikan informasi baru mengenai potensi kelenjar

saliva Anopheles sundaicus sebagai salah satu kandidat target dalam

pengembangan Transmission Blocking Vaccine (TBV) berbasis kelenjar

saliva vektor melawan malaria.

b. Hasil penelitian ini dapat memberikan harapan baru bagi penanggulangan

malaria di Indonesia.

4c. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai salah satu acuan untuk

penelitian lebih lanjut tentang TBV berbasis kelenjar saliva vektor malaria

Anopheles sundaicus.

5

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Malaria

2.1.1 Definisi

Malaria adalah penyakit infeksi parasit yang disebabkan oleh Plasmodium

yang menyerang eritrosit dan ditandai dengan ditemukannya bentuk aseksual di

dalam darah. Demam intermitten, splenomegali dan anemia merupakan

manifestasi klinis dari penyakit ini yang dikenal dengan trias malaria (Harijanto,

2007).

2.1.2 Etiologi

Malaria yang menyerang manusia diakibatkan oleh protozoa dengan genus

Plasmodium, famili Plasmodiiae, ordo Cocidiidaae, subordo Haemosporodiidae,

kelas Aconoidasida dan filum Apicomplexa (Leids Universitair Medisch Centrum,

2008). Plasmodium tidak hanya menginfeksi manusia, tetapi juga menginfeksi

binatang seperti burung, reptil, dan mamalia (Gandahusada, 2006). Empat dari

seratus spesies Plasmodium bersifat infeksius pada manusia yaitu Plasmodium

falciparum (P. falciparum), Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium ovale

(P.ovale) dan Plasmodium malariae (P. malariae) (Suh et al., 2005). Dalam

beberapa tahun terakhir, kasus malaria pada manusia juga disebabkan oleh

Plasmodium knowlesi. Jenis Plasmodium ini awalnya menyerang beberapa spesies

kera yang terdapat di kawasan hutan tertentu di Asia Tenggara (Malaysia,

Vietnam, Indonesia) (WHO, 2012).

Plasmodium malaria yang sering dijumpai adalah P. falciparum yang

menyebabkan malaria tropika (malignant malaria) dan P. vivax yang

menyebabkan malaria tertiana (benign malaria). Untuk P. ovale dan P. malariae

kasusnya sangat jarang ditemukan di Indonesia (Harijanto, 2007). 86,4 %

penyebab kasus malaria di Indonesia adalah P. falciparum dan 6,9 % disebabkan

oleh P. vivax (Kemenkes, 2010). Plasmodium menginfeksi eritrosit (sel darah

6

merah) yang selanjutnya mengalami pembiakan aseksual di jaringan hati dan di

eritrosit. Pembiakan seksual terjadi dalam tubuh nyamuk Anopheles betina yang

berperan sebagai vektor utama malaria (Harijanto, 2007).

2.1.3 Distribusi dan Insiden

Malaria ditemukan pada 60o Lintang Utara sampai 32

o Lintang Selatan,

dari ketinggian 2.666 m sampai 433 m di bawah permukaan laut. Daerah yang

sejak semula bebas malaria adalah kawasan Pasifik tengah dan Selatan (Hawaii

dan Selandia Baru) karena di kawasan tersebut tidak terdapat vektor malaria.

Penyakit malaria dikatakan endemi jika secara konstan angka kejadian penyakit

dapat diketahui serta penularan secara alami berlangsung sepanjang tahun.

Dikatakan epidemi jika angka kejadian kasus malaria pada suatu daerah naik

degan cepat di atas level biasa atau jika penyakit secara tiba-tiba terjadi pada suatu

daerah yang sebelumnya bebas malaria. Jika suatu epidemi tersebar pada daerah

luas di luar daerah yang biasa disebut pandemi (Natadisastra, 2009)

Infeksi malaria tersebar pada lebih dari 100 negara di benua Afrika, Asia,

Amerika, daerah Oceania, dan kepulauan Caribia. Lebih dari 1, 6 triliun manusia

terpapar oleh malaria dengan dugaan morbiditas 200 300 juta dan mortalitas

lebih dari 1 juta pertahun. P. falcifarum dan P. malariae di jumpai pada semua

negara dengan malaria; di Afrika, Haiti, dan Papua Nugini. P. falcifarum dan P.

vivax banyak terdapat di Amerika Latin. Di Amerika selatan, Asia Tenggara,

daerah Oceania, dan India umumnya P. falcifarum dan P. vivax. P. ovale biasanya

hanya terdapat di Afrika. Di Indonesia kawasan timur mulai dari Kalimantan,

Sulawesi Tengah sampai ke Utara, Maluku, Irian Jaya, dan dari Lombok sampai

NTT serta Timor Timur merupakan daerah endemis malaria dengan P. falcifarum

dan P. vivax (Harijanto, 2007)

2.1.4 Siklus Hidup Plasmodium

Infeksi parasit malaria pada manusia dimulai ketika nyamuk Anopheles

betina menggigit manusia dan melepaskan sporozoit ke dalam pembuluh darah.

Empat puluh lima menit kemudian sebagian besar sporozoit menuju hati dan

7

sebagian kecil sisanya mati. Di dalam sel parenkim hati inilah dimulai

perkembangan aseksual (intrahepatic schizogony atau pre-erithrocytes

schizogony). Perkembangan ini memerlukan waktu 5 hari untuk P. falciparum dan

15 hari untuk P. malariae.

Gambar 2.1 Siklus hidup plasmodium (Sumber : CDC)

Sporozoit dalam sel parenkim hati selanjutnya berkembang menjadi

skizon. Apabila skizon pecah maka merozoit-merozoit dikeluarkan ke sirkulasi.

Setelah berada dalam sirkulasi darah merozoit akan masuk ke dalam eritrosit

melalui reseptor pada permukaan sel eritrosit. Dalam waktu kurang dari 2 jam

parasit berubah menjadi bentuk ring (cincin). Di dalam eritrosit parasit tumbuh

dengan cara memakan hemoglobin dan dalam metabolismenya membentuk

pigmen yang disebut hemozoit serta dapat dilihat secara mikroskopik. Eritrosit

berparasit menjadi lebih elastik dan dindingnya berubah menjadi lonjong. Setelah

36 jam invasi ke dalam eritrosit, parasit berubah menjadi sizon yang apabila pecah

akan mengeluarkan 6-36 merozoit dan siap untuk menginfeksieritrosit yang lain.

8

Siklus aseksual pada P. falciparum, P. vivax dan P.ovale adalah 48 jam dan pada

P. malariae adalah 72 jam (Harijanto, 2007).

Di dalam darah, sebagian parasit akan membentuk gamet jantan dan

betina. Apabila nyamuk menghisap darah orang yang sakit maka dimulailah siklus

seksual dalam tubuh nyamuk. Setelah terjadi perkawinan maka akan terbentuk

zygote lalu menjadi ookinet yang menembus dinding perut nyamuk kemudian

menjadi bentuk ookist. Ookist yang masak mengeluarkan sporozoit yang

bermigrasi ke kelenjar saliva nyamuk dan siap untuk menginfeksi manusia

(Harijanto, 2007).

2.1.5 Patogenesis

Infeksi penyakit malaria dimulai saat nyamuk Anopheles menghisap darah

dan secara bersamaan nyamuk mengeluarkan saliva yang mengandung sporozoit

Plasmodium. Sporozoit masuk ke pembuluh darah akan ikut bersama aliran darah

dan menuju hati. Di hati, sporozoit kemudian membentuk skizon dan jika pecah

akan melepaskan merozoit ke aliran darah. Merozoit yang lepas siap menginfeksi

eritrosit dan membentuk skizon. Skizon yang matang berisi merozoit-merozoit

yang terlepas ke sirkulasi dan siap menginfeksi eritrosit lain. Demam timbul

karena skizon yang pecah mengeluarkan berbagai macam antigen untuk

merangsang sel makrofag, monosit atau limfosit untuk mengeluarkan TNF yang

selanjutnya merangsang hipotalamus sebagai pusat pengatur suhu tubuh untuk

menaikkan suhu tubuh dan terjadilah demam. Selanjutnya merozoit masuk ke

limpa (lien), mengalami infiltrasi dan fagositosis, peningkatan dari kerja lien

menyebabkan terjadinya splenomegali yang merupakan gejala khas pada malaria

kronis (Gandahusada, 2006). Perusakan eritrosit oleh parasit, retikulosit

terhambat, hemolisis akibat kompleks imun, dan eritrofagositosis akan

menyebabkan jumlah eritrosit menurun drastis, dan menimbulkan gejala klinis

anemia (Harijanto, 2007). Parasit dalam eritrosit (EP) mengalami 2 stadium, yaitu

stadium cincin pada 24 jam pertama dan stadium matur pada 24 jam selanjutnya.

Permukaan EP stadium cincin akan menampilkan antigen RESA (Ring

Erytrhrocyte surgace antigen) yang menghilang setelah parasit masuk stadium

9

matur. Permukaan membran EP akan mengalami penonjolan dan membentuk

knob dengan Histidin Rich-protein-1 (HRP-1) sebagai komponen utamanya.

Selanjutnya bila EP mengalami merogoni, akan dilepaskan toksin malaria berupa

GPI yaitu glikosilfosfatidilinositol yang merangsang pelepasan TNF- dan IL-1

dari makrofag, perlekatan EP stadium matur ke endotel pembuluh darah disebut

sitoadherensi dan membuat penggumpalan atau pengelompokan EP matur yang

diselubungi 10 atau lebih eritrosit yang non-parasit disebut rosetting membuat

obstruksi (penyumbatan) dalam pembuluh kapiler yang menyebabkan terjadinya

iskemi jaringan (Harijanto, 2007; Departemen Kesehatan RI, 2008).

2.1.6 Manifestasi Klinik

Manifestasi klinik pada penyakit malaria tergantung dari jenis Plasmodium

yang menginfeksi. Pada umumnya manifestasi klinis yang disebabkan P.

falciparum lebih berat dan lebih akut dibandingkan dengan jenis Plasmodium

yang lain, sedangkan gejala yang disebabkan oleh P. malariae dan P. ovale adalah

yang paling ringan. Penyakit malaria diawali dengan gejala prodromal yang tidak

spesifik, diantaranya lesu, sakit kepala, anoreksia, nausea, dan vomitus.

Gejala khas yang terjadi pada malaria dikenal dengan Trias Malaria

yang meliputi demam intermitten, anemia, dan splenomegali. Demam pada

malaria terjadi karena hancurnya eritrosit pada pembuluh darah dan menghasilkan

pirogen-pirogen. Pirogen-pirogen ini ketika memasuki otak akan merubah set poin

suhu tubuh. Perubahan ini menyebabkan suhu tubuh penderita menjadi berubah-

ubah sesuai tipe malarianya (Fauci et al., 2008). Pada malaria vivax, falciparum,

dan ovale tipe demamnya adalah demam paroksismal tertiana yaitu demam yang

berulang tiap 48 jam atau tiap hari ketiga, terjadi. Sedangkan demam pada malaria

malariae tipe demam yang terjadi adalah demam paroksismal kuartana yaitu

demam yang berulang tiap 72 jam atau tiap hari keempat. Menurut puncak

demamnya jenis demam pada dibedakan menjadi demam intermitten dan demam

remitten. Demam intermitten terjadi jika di antara serangan demam terdapat

periode suhu normal sedangkan demam remitten merupakan demam berulang

tanpa ditemukan periode suhu normal. Serangan demam malaria terjadi selama 2-

10

12 jam. Stadium demam terdiri dari 3 stadium yaitu stadium menggigil, stadium

puncak demam, dan stadium sudoris. Pada stadium menggigil, penderita

menggigil kedinginan dan berlangsung selama 15-60 menit. Stadium puncak

demam ditandai dengan suhu tubuh yang tinggi bisa mencapai 41oC dan

berlangsung selama 2-6 jam. Sedangkan pada stadium sudoris, suhu mulai turun

disertai banyak berkeringat. Suhu tubuh berangsur-angsur kembali normal dan

berlangsung selam 2-4 jam. Dua atau tiga hari kemudian terulang stadium

kembali stadium demam dengan stadium seperti di atas. Lamanya demam untuk

spesies Plasmodium tidak sama. Anemia yang terjadi pada malaria disebabkan

karena perusakan eritrosit oleh parasit, hambatan eritropoiesis sementara,

hemolisis oleh karena proses complement mediated immune complex,

eritrofagositosis, penghambatan pengeluaran retikulosit dan pengaruh sitokin.

Anemia pada malaria memiliki tipe hemolitik, normokrom, normositer. Pada

penderita malaria, sebagian besar eritrosit mengandung parasit. Eritrosit berparasit

ini memiliki bentuk yang berbeda normalnya, sehingga ketika melewati limpa

akan dihancurkan. Splenomegali terjadi karena kongesti aliran darah serta

hipertrofi dan hiperplasi sistem retikuloendotelial yang disebabkan peningkatan

penghancuran eritrosit (Natadisastra, 2009).

2.1.7 Diagnosis

Diagnosis malaria ditegakkan berdasarkan anamnesis, pemeriksaan fisik,

dan pemeriksaan laboratorium. Diagnosis pasti malaria harus ditegakkan dengan

pemeriksaan sediaan darah secara mikroskopik atau menggunakan Rapid

Diagnostic Test (RDT) yang juga disebut tes diagnostik cepat.

Pemeriksaan darah secara mikroskopik bertujuan untuk menentukan ada

tidaknya parasit malaria, spesies dan stadium Plasmodium serta kepadatan parasit

secara semi kuantitatif dan kuantitatif pada preparat yang dibuat. Beberapa

pemeriksaan darah secara mikroskopik yang dapat dilakukan untuk menegakkan

diagnosis adalah sebagai berikut:

11

a. Tetesan preparat darah tebal.

Pembuatan preparat darah tebal merupakan cara terbaik untuk menemukan

parasit malaria karena tetesan darah cukup banyak dibandingkan preparat darah

tipis. Sediaan mudah dibuat khususnya untuk studi di lapangan. Ketebalan dalam

membuat sediaan perlu untuk memudahkan identifikasi parasit. Pemeriksaan

parasit dilakukan selama 5 menit (diperkirakan 100 lapang pandangan dengan

perbesaran kuat). Preparat dinyatakan negatif bila setelah diperiksa 200 lapang

pandangan dengan perbesaran kuat 700-1000 kali tidak ditemukan parasit. Hitung

parasit dapat dilakukan pada tetes tebal dengan menghitung jumlah parasit per 200

leukosit. Bila leukosit 10.000/ul maka hitung parasitnya ialah jumlah parasit

dikalikan 50 merupakan jumlah parasit per mikro-liter darah.

b. Tetesan darah tipis.

Digunakan untuk identifikasi jenis dan stadium plasmodium, bila dengan

preparat darah tebal sulit ditentukan. Kepadatan parasit dinyatakan sebagai hitung

parasit (parasite count), dapat dilakukan berdasar jumlah eritrosit yang

mengandung parasit per 1000 sel darah merah. Bila jumlah prasit > 100.000/ul

darah menandakan infeksi yang berat. Hitung parasit penting untuk menentukan

prognosa penderita malaria, walaupun komplikasi juga dapat timbul dengan

jumlah parasit normal. Pengecatan dilakukan dengan cat Giemsa, atau Leshmans,

atau Fields dan juga Romanowsky. Pengecatan Giemsa yang umum dipakai pada

beberapa laboratorium dan merupakan pengecatan yang mudah dengan hasil yang

cukup baik.

Pemeriksaan dengan tes diagnostic cepat (Rapid Diagnostic Test)

dilakukan berdasarkan deteksi antigen parasit malaria dengan menggunakan

metode imunokromatografi, dalam bentuk dipstick. Tes ini sangat bermanfaat

pada unit gawat darurat, saat terjadi KLB, dan di daerah terpencil yang tidak

tersedia fasilitas laboratorium (Depkes RI, 2008).

12

2.1.8 Penatalaksanaan

Secara global WHO telah menetapkan dipakainya pengobatan malaria

dengan memakai obat ACT (Artemicyn base Combination Therapy). Golongan

Artemisin telah dipilih sebagai obat utama karena efektif dalam mengatasi

Plasmodium yang resisten dengan pengobatan lain seperti Klorokuin,

Sulfadoksin-Pirimetamin (SP), Kina Sulfat, Primakuin, dll. (Harijanto, 2007).

Selain itu hal-hal lain yang menyebabkan Artemisin dipilih sebagai basis terapi

kombinasi pada malaria adalah:

- Kemampuan menurunkan parasitemia lebih cepat 10 kali daripada obat-

obat antimalaria lainnya.

- Mempunyai efek samping yang minimal.

- 2 juta kasus dilaporkan telah diobati dengan basis artemisin tanpa adanya

efek toksik.

- Artemisin diabsorbsi cepat melalui oral.

- Dapat diberi melalui intravena maupun intramuskuler, dengan pemberian 1

kali sehari.

- Belum ada laporan resistensi terhadap artemisin, walaupun sudah lama

digunakan di China (Zein, 2005)

Penggunaan Artemisin secara monoterapi akan mengakibatkan terjadinya

rekrudensi. Maka dari itu WHO memberikan petunjuk untuk mengkombinasikan

Artemisin dengan obat antimalaria yang lain. Kombinasi obat ini dapat berupa

kombinasi dosis tetap (fixed dose combination) atau kombinasi tidak tetap (non-

fixed dose) (Harijanto, 2007). Pada wilayah Indonesia kombinasi obat yang

dianjurkan terdapat pada tabel 2.2

Tabel 2.2. Kombinasi obat malaria

Plasmodium falciparum P. vivax

Tanpa Komplikasi Terapi

Gagal

Malaria

Berat

Hamil Terapi

Tidak Lab-

13

terkonfirmasi Konfirmasi

CQ+PQ AS+AQ+P

Q

QN+D+PQ QN/AM QN;

(AS+A

Q-

2nd

+3rd

Trimer

ster)

CQ+PQ

(14d)

AQ: Amodiaquin; AL: Artemehter-Lumefantrin; AS: Artesunat; CQ: Chloroquin; D:

Doksisiklin; PQ: Primaquin; QN: Quinin.

Sumber: WHO (2006)

2.2 Anopheles sundaicus sebagai Vektor Malaria

Vektor penyakit infeksi malaria adalah nyamuk dari genus Anopheles.

Terdapat 80 macam spesies nyamuk Anopheles yang ditemukan di Indonesia, 24

diantaranya berpotensi sebagai vektor dalam penyebaran penyakit malaria. Salah

satu nyamuk Anopheles yang menjadi vektor malaria di Indonesia adalah

Anopheles sundaicus (An.sundaicus) (Dale et al., 2005). Sebaran geografik dari

vektor malaria An. sundaicus di Indonesia adalah di kawasan Sumatera, Jawa,

Sulawesi, dan Nusa Tenggara (Natadisastra, 2009).

An. sundaicus pertama kali ditemukan oleh Rodenwelt pada tahun 1925.

Nyamuk ini umumnya lebih sering menghisap darah manusia daripada darah

binatang. Nyamuk ini aktif menggigit sepanjang malam tetapi paling sering antara

pukul 22.00 01.00 dini hari. Pada waktu malam hari nyamuk masuk ke dalam

rumah untuk mencari darah, hinggap di dinding baik sebelum maupun setelah

menghisap darah (Hiswani, 2004). Ciri morfologi dari nyamuk ini adalah adanya

bercak pada bagian tibia dan femur nyamuk (speck-led), sisik hitam yang terdapat

pada sayap serta persambungan tarsus dan tibia tanpa ada warna putih panjang

seperti pita yang terlihat seperti pada gambar 2.2 (Natadisastra, 2009).

14

Gambar 2.2: Anopheles sundaicus (Sumber: boldsystems.org)

Perilaku istirahat nyamuk ini sangat berbeda antara lokasi satu dengan

lokasi yang lainnya. Di pantai selatan pulau Jawa dan pantai Timur Sumatera

Utara, pada pagi hari sedangkan di daerah Cilacap dan lapangan dijumpai mulai

pagi hingga siang hari. Jarak terbang An. sundaicus betina cukup jauh. Pada

musim densitas tinggi masih dijumpai nyamuk betina dalam jumlah cukup banyak

di suatu tempat yang berjarak kurang lebih 3 km dari tempat perindukan nyamuk

tersebut (Hiswani, 2004)

Vektor An. sundaicus umumnya berkembangbiak di air payau yaitu

campuran antara air tawar dan air asin, dengan kadar garam optimum antara 12%-

18%. Penyebaran jentik di tempat perindukan tidak merata di permukaan air,

tetapi terkumpul di tempat-tempat tertutup seperti diantara tanaman air yang

mengapung, sampah dan rumput-rumput di pinggir sungai atau parit (Hiswani,

2004)

Tidak hanya di Indonesia, An. sundaicus merupakan salah satu vektor

utama malaria di kawasan Asia Tenggara dan Selatan, diantaranya adalah di India,

Indonesia, Malaysia, Vietnam, Kamboja, Mnyanmar, dan Thailand. Nyamuk ini

berperan dalam beberapa kasus malaria di Orissa, India (1930-1940), Vietnam

(1965-1985) dan di Indonesia pada tahun 1985. Nyamuk ini juga berperan dalam

transmisi malaria pada spesies kera di kawasan Kepulauan Andaman (Dusfour et

al., 2004).

15

Penelitian mengenai vektor dan kontrol malaria di kawasan Asia tenggara

cenderung difokuskan pada tiga spesies utama vektor malaria, yaitu An. dirus, An.

minimus, dan An. sundaicus. Banyak penelitian telah dilakukan pada spesies An.

dirus dan An. minimus disebabkan nyamuk tersebut tersebar luas di kawasan Asia

tenggara sedangkan belum banyak penelitian untuk spesies An. sundaicus karena

sebagian besar spesies nyamuk ini ditemukan di kawasan pantai (coastal areas)

(Dusfour et al., 2004).

2.3 Peran Saliva Nyamuk dalam Transmisi Patogen

2.3.1 Morfologi Kelenjar Saliva Nyamuk

Saliva nyamuk disekresikan oleh sepasang kelenjar saliva nyamuk yang

terletak di bagian thorax mengapit bagian esofagus nyamuk. Masing-masing

kelenjar terdiri dari 3 lobus, dua lobus terletak di bagian lateral dan satu lobus

terletak di bagian medial.

Gambar 2.3:Kelenjar saliva nyamuk. a. posisi kelenjar saliva nyamuk dari saluran cerna

b. Kelenjar saliva nyamuk Anopheles stephensi dewasa. (A) Tampak seluruh bagian dari kelenjar saliva nyamuk dan (B-F) merupakan regio yang tampak

dari berbagai macam bentuk diseksi (Clements, 2000; Dhar dan Kumar,

2003)

16

Pada nyamuk betina lobus lateral dibagi menjadi regio proximal, intermediet dan

distal. Lobus medial nyamuk terdiri dari regio distal dan bagian pendek dari leher

nyamuk. Bagian depan (anterior) dari masing-masing kelenjar telah dipersarafi

dan terletak pada persambungan fore-gut dan midgut. Masing-masing lobus

memiliki central ductus yang disusun oleh satu lapis sel epitel yang melekat

dengan lamina basal externa. Bagian apikal dari regio posterior kelenjar saliva

nyamuk betina berperan penting dalam proses sekresi saliva. Pada nyamuk jantan

kelenjar saliva berukuran lebih kecil daripada nyamuk betina (Dhar dan Kumar,

2003)

2.3.2 Respon Imun Saliva Vektor

Infeksi malaria dimulai ketika nyamuk Anopheles betina menghisap darah

dan disaat yang sama saliva nyamuk juga ikut masuk bersama sporozoit ke dalam

tubuh inang (Brennan et al., 2000). Saliva nyamuk mengandung komponen

protein imunomodulator dan vasomodulator yang berguna untuk memperlancar

transmisi patogen dari vektor ke tubuh hospes selama proses blood feeding (Dhar

dan Kumar, 2003).

Kerusakan pembuluh darah saat nyamuk menghisap darah menyebabkan

terjadinya respon hemostasis yang terdiri dari vasokonstriksi, agregrasi platelet,

dan serangkaian proses kaskade koagolasi seperti yang terlihat pada gambar 2.4

(Andrade et al., 2005). Serangkaian reaksi tersebut dapat dihambat oleh adanya

komponen vasomodulator yang terdapat dalam saliva nyamuk. Komponen

vasomodulator dalam saliva diantaranya adalah peroksidase, anophelin, dan

hamdarin. Faktor peroksidase menghambat vasokonstriksi, faktor anopheline

berfungsi sebagai alpha thrombin inhibitor yang menghambat agregasi platelet,

dan faktor hamdarin berfungsi dalam menghambat kaskade koagulasi (Fontaine

et al., 2011). Selain menimbulkan respon hemostasis, kerusakan pembuluh darah

juga mampu membangkitkan respon imun hospes berupa aktivasi respon imun

nonspesifik (innate immunity) untuk perbaikan jaringan dan mengeliminasi

patogen dan respon imun spesifik (adaptive immunity) menghasilkan antibodi

melawan patogen spesifik (Andrade et al., 2005).

17

Gambar 2.4 Peran protein saliva vektor arthropoda dalam memodulasi respon hemostasis pada hospes (Sumber: Fontaine et al., 2011)

Pengaruh protein imunomodulator dalam saliva nyamuk terhadap respon

imun inang adalah menyebabkan pergeseran respon imun selular dari Th1 ke arah

Th2 yang lebih menguntungkan vektor (Titus et al., 2006). Paparan berulang

saliva nyamuk menyebabkan perubahan respon imun inang dengan adanya

peningkatan respon imun dari Th2 ke arah Th1 yang lebih menguntungkan inang

dan memberikan respon protektif pada inang (Donovan et al., 2007). Sel Th1

menghasilkan sitokin IFN- dan IL-2 yang akan menstimulasi sel sitotoksik dan

makrofag dalam imunitas seluler. Sebaliknya sel Th 2 menghasilkan sitokin IL-4,

IL-10 dan sitokin lain (IL-3, IL-5, IL-13) yang menstimulasi sel B untuk

menghasilkan imunoglobulin. Hubungan sitokin yang dihasilkan sel Th 1 dan sel

Th 2 ini bersifat timbal balik, IFN- menghambat perkembangan sel Th 2 sedang

IL-4 menghambat perkembangan dan aktivitas sel Th 1 (Baratawidjaja dan

Rengganis, 2009).

18

2.4 Perkembangan Vaksin Malaria

Salah satu upaya strategis pengendalian malaria yang saat ini sedang

intensif dikembangkan adalah pengembangan vaksin malaria. Tantangan utama

dalam pengembangn vaksin malaria yang efektif adalah kemampuan memberikan

perlindungan terhadap berbagai macam bentuk parasit malaria. Oleh karena

parasit malaria bersifat sangat kompleks, maka arah pengembangan vaksin

dilakukan dengan beberapa pendekatan yang berbeda (Ambarita, 2010).

Pada awal pengembangan vaksin, upaya yang dilakukan pada fase pra-

eritrosit, yaitu periode parasit dalam bentuk sporozoit yang masuk ke dalam

pembuluh darah dan masuk ke dalam organ hati, yang selanjutnya mengalami

perkembangan hingga matang dan memulai proses multiplikasi. Saat ini,

dikembangkan tiga jenis kandidat vaksin untuk malaria, yaitu;

a. Vaksin pre-eritrositik (pre-erytrhocytic vaccine)

Kandidat vaksin pra-eritrositik ditujukan untuk melindungi terjadinya

infeksi awal malaria, yaitu masa dimana parasit masuk atau berkembang dalam

sel-sel hati penderita. Vaksin ini akan merangsang respon imun yang tidak hanya

mencegah terjadinya infeksi namun juga mampu menyerang sel hati yang

terinfeksi jika memang telah terjadi penularan. Kandidat vaksin ini mencakup:

- Rekombinan ataupun protein hasil rekayasa genetika ataupun antigen

yang berasal dari permukaan parasit ataupun yang berasal dari sel hati

yang terinfeksi

- DNA vaksin yang mengandung informasi genetik untuk memproduksi

antigen di dalam resipien vaksin

- Vaksin berupa parasit hidup yang telah dilemahkan dalam bentuk

sporozoit dan merupakan komponen utama vaksin (Ambarita, 2010).

b. Vaksin fase darah (blood stage vaccine)

Kandidat vaksin fase-darah ditujukan pada parasit malaria dalam bentuk

yang paling destruktif, yaitu masa terjadinya replikasi parasit dalam eritrosit.

Vaksin ini tidak ditujukan untuk mencegah terjadinya infeksi namun diharapkan

dapat menurunkan jumlah parasit dalam darah sehingga bisa mengurangi tingkat

19

keparahan penyakit. Bukti-bukti sebelumnya mengindikasikan bahwa seseorang

yang sering terkena malaria maka dalam tubuhnya akan terbentuk imunitas alami

dalam kurun waktu tertentu. Target vaksin yang mengandung antigen ataupun

protein yang berasal dari permukaan parasit (fase darah/merozoit) adalah

merangsang tubuh untuk membentuk imunitas alami sehingga meminimalisir

resiko terkena sakit (Ambarita, 2010).

c. Vaksin penghambat penularan Transmission Blocking Vaccine (TBV).

Vaksin penghambat penularan mencegah transmisi malaria dengan

menginduksi antibodi dari antigen stadium seksual parasit, yang berkembang

dalam midgut nyamuk. Antibodi yang dihasilkan akan menghambat pertumbuhan

parasit dalam tubuh nyamuk (Carter et al., 2000). Vaksin ini tidak dapat

mencegah seseorang untuk tertular malaria serta tidak juga mengurangi gejala

penyakit. Peran krusialnya adalah membatasi penyebaran infeksi oleh nyamuk

terhadap orang yang sehat (Ambarita, 2010). Beberapa tahun terakhir

perkembangan TBV menunjukkan berkembangnya konsep TBV berbasis vektor

atau vaksin stadium nyamuk (mosquitos stage vaccine) dengan target midgut atau

kelenjar saliva nyamuk yang mampu menghasilkan antibodi dan membatasi

pertumbuhan parasit pada host (Chattopadhyay dan Kumar, 2009).

2.5 Transmission Blocking Vaccine sebagai Penanggulangan Malaria

Transmission Blocking Vaccine (TBV) merupakan satu strategi dalam

penanggulangan penyakit malaria karena dapat digunakan sebagai pembangkit

antibodi host guna melawan vektor yang terlibat dalam pengembangan patogen

(Kubler-Kielb et al.,2007). TBV berbasis parasit mampu menghambat transmisi

malaria dari manusia ke vektor malaria melalui pencegahan pertumbuhan parasit

dalam midgut nyamuk. Antibodi yang terbentuk dalam tubuh host sebagai hasil

dari pengaruh vaksinasi diduga kuat mampu membunuh gametosit dalam tubuh

host atau membuhuh saat gametosit dan antibodi tertelan masuk ke midgut

nyamuk. Tidak seperti jenis vaksin lainnya, antibodi yang ditimbulkan oleh TBV

membunuh parasit di luar tubuh orang yang divaksinasi (Gambar 2.3). Oleh

20

karena itu vaksin ini tidak dibuat untuk melindungi individu yang telah

divaksinasi akan tetapi melindungi individu yang belum terinfeksi oleh malaria

(Sharma dan Pathak, 2008)

Gambar 2.5 Skema hipotesis mekanisme kerja TBV. I: Individu sehat (biru) dan

terinfeksi (merah) diimunisasi antigen TBV; II: vektor menghisap darah

yang terinfeksi yang mengandung ikatan spesifik antigen-antibodi TBV; III: Antibodi spesifik diproduksi untuk melawan pathogen dalam tubuh;

IV: Pencegahan transmisi ke inang yang belum terinfeksi (Sumber:

Coutinho-Abreu dan Ramalho-Ortigao, 2010)

Salah satu kandidat TBV yang dikembangkan adalah berbasis parasit

dengan target diantaranya adalah gametocytes antigen yang diekspresikan pada

gametosit jantan dan betina dan ookinets antigen (Brennan et al., 2000; Titus et

al., 2006; Chattopadhyay dan Kumar, 2009; Ramirez et al., 2009). Gametocytes

antigen atau prefertilization antigens yang telah ditemukan antara lain protein

antigen Psf48/45 dan Psf230. Antigen ini terletak pada permukaan gametosit

jantan dan gametosit betina. Ookinets antigens atau postfertilization antigens

merupakan protein-protein yang diekspresikan pada permukaan zygot dan ookinet

parasit. Psf25 dan Psf28 merupakan beberapa protein ookinet yang sudah berhasil

diklon dari spesies Plasmodium. Protein-protein tersebut berpotensial sebagai

21

kandidat TBV yang menghasilkan antibodi untuk menghambat pertumbuhan

ookist dalam midgut nyamuk (Saxena et al., 2007).

Strategi baru yang potensial dikembangkan adalah pengembangan TBV

berbasis vektor atau vaksin stadium nyamuk (mosquito vaccine stadium) dengan

target midgut atau kelenjar saliva nyamuk. Kandidat untuk vaksin ini merupakan

protein yang diekspresikan oleh midgut maupun enzim midut yang berperan

dalam mencerna darah dan reseptor parasit yang diekspresikan oleh sel epitel

midgut atau kelenjar saliva (Coutinho-abreau dan Ramalho-ortigao, 2010).

Contoh protein midgut atau kelenjar saliva yang digunakan sebagai kandidat TBV

antara lain tripsin, CPBAg1, N1(AgAPN1), saglin, dan lain-lain (Chattopadhyay

dan Kumar, 2009). Perkembangan TBV berbasis vektor tidak hanya mengarah

pada menghambat pertumbuhan parasit dalam tubuh nyamuk tetapi juga

mengurangi morbiditas dan mortalitas individu yang terpapar. Sebuah penelitian

yang dilakukan oleh Donovan et al. (2007) menunjukkan bahwa paparan berulang

dari saliva nyamuk Anopheles stephensi ternyata dapat membatasi perkembangan

parasit P.yoelli di dalam tubuh hewan coba dengan cara mempengaruhi respon

imun sistemik maupun lokal. Respon tubuh berupa peningkatan aktivitas Th1

yang ditunjukkan dengan adanya peningkatan IFN-, IL-12 dan iNOS dan

penurunan kadar IL-4. Adanya pergeseran respon imun ke arah Th-1 lebih efektif

untuk melawan malaria (Donovan et al., 2007). Pada penelitian lain, paparan

saliva vektor sand flies pada Leishmaniasis juga menunjukkan adanya hambatan

pertumbuhan patogen pada hewan coba (Kamhawi et al., 2000). Hal ini

menimbulkan hipotesa bahwa saliva nyamuk mampu memberikan efek proteksi

pada hewan coba dengan mempengaruhi respon imun inang.

Jenis molekul yang berperan dalam kandidat TBV sebagai vaksin

malaria yang efektif harus memiliki beberapa sifat-sifat yang penting untuk

diperhatikan. Molekul antigen pada vaksin mampu untuk menginduksi kenaikan

antibodi host sebagai respon terhadap patogen yang masuk dalam tubuh (Kubler-

Kielb et al., 2007). Di samping itu, vaksin yang terdiri dari kombinasi antigen dan

adjuvan harus cukup aman digunakan sehingga terhindar dari efek samping yang

terjadi sesaat setelah imunisasi (Saul et al., 2007). Molekul antigen untuk kandidat

22

vaksin TBV juga harus memiliki sifat polimorfisme yang rendah. Vaksin TBV

yang efektif juga bisa dibuat dari kombinasi antigen berbeda karena respon

antibodi terhadap antigen kombinasi tersebut diduga dapat menghasilkan respon

yang lebih baik (Coutinho-Abreu dan Ramalho-Ortigao, 2010).

23

2.6 Kerangka Konseptual

Keterangan :

Diteliti :

Tidak diteliti :

Malaria adalah penyakit infeksi parasit yang disebabkan oleh Plasmodium.

Siklus hidup Plasmodium memerlukan Anopheles sebagai vektornya. Anopheles

sundaicus (An. sundaicus) merupakan satu diantara banyaknya spesies Anopheles

Plasmodium

Vektor Malaria

An. sundaicus

Terinfeksi Tidak terinfeksi

Kelenjar saliva

An. sundaicus

Protein imunomodulator Vasomodulator

Vaksin: TBV

Derajat Parasitemia host

malaria

24

yang berperan sebagai vektor malaria. Salah satu target potensial TBV berasal

dari kelenjar saliva nyamuk An. sundaicus yaitu protein imunomodulator dan

vasomodulator. Diharapkan paparan berulang ekstrak kelenjar saliva nyamuk An.

sundaicus sebagai model vaksin TBV dapat membangkitkan respon imun pada

hewan coba sehingga mampu menghambat pertumbuhan parasit malaria.

Perbedaan ini dapat ditunjukkan dengan membandingkan derajat parasitemia

kelompok perlakuan yang divaksinasi ekstrak kelenjar saliva An. sundaicus

dengan kelompok kontrol yang tidak divaksinasi.

2.7 Hipotesis

Hipotesis penelitian ini adalah adanya perbedaan derajat parasitemia

mencit galur BALB/c yang divaksinasi dengan vaksin model kelenjar saliva An.

sundaicus pada kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol

yang tidak divaksinasi.

BAB 3. METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris. Penelitian

eksperimental merupakan kegiatan percobaan (experiment) yang bertujuan untuk

mengetahui suatu pengaruh yang timbul akibat perlakuan tertentu (Notoatmodjo,

2002)

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Dasar, Laboratorium

Mikrobiologi, dan Laboratorium Zoologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Jember. Waktu penelitian

dilakukan selama bulan Oktober Desember 2012.

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian

3.3.1 Populasi Penelitian

Populasi dari penelitian ini adalah mencit betina galur BALB/c berusia 6-8

minggu.

3.3.2 Sampel Penelitian

Besar sampel penelitian ditentukan berdasarkan rumus Federer: (t-1)(n-1)

15, dimana t adalah banyaknya kelompok perlakuan, dan n adalah jumlah

sampel per kelompok perlakuan. Jumlah perlakuan yang digunakan sebanyak tiga

kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok pellet, dan kelompok supernatan.

Dari rumus tersebut didapatkan jumlah minimal mencit yang digunakan sebanyak

9 ekor mencit. Untuk menghindari adanya mencit ulangan yang mati, maka

digunakan 15 ekor untuk masing-masing kelompok sehingga jumlah total sampel

adalah 45 ekor mencit. Kelompok Kontrol (K): diinjeksi Phosphate Buffer Saline

(PBS) yang dicampur dengan adjuvan aluminum hidroksida. Kelompok Pellet (P):

divaksinasi dengan vaksin model pellet kelenjar saliva An. sundaicus yang

26

dicampur dengan adjuvan aluminum hidroksida. Kelompok Supernatan (S):

divaksinasi dengan vaksin model supernatan kelenjar saliva An. sundaicus yang

dicampur dengan adjuvan aluminum hidroksida.

3.4 Variabel Penelitian

Variabel-variabel dari penelitian ini adalah :

1. Variabel bebas yaitu kelenjar saliva nyamuk An. sundaicus.

2. Variabel kontrol yaitu jenis kelamin, galur, usia, perlakuan, lama waktu

pemeliharaan hewan coba dan Plasmodium berghei.

3. Variabel terikat yaitu derajat parasitemia mencit galur BALB/c yang

diamati dengan menggunakan mikroskop perbesaran objektif 100x.

3.5 Definisi Operasional

3.5.1 Kelenjar saliva An. sundaicus merupakan salah satu organ tubuh nyamuk

yang berfungsi untuk menghasilkan saliva. Kelenjar saliva ini juga

berperan dalam transmisi parasit dan merupakan perantara penting bagi

nyamuk selama proses blood feeding. Isolasi kelenjar saliva untuk

preparasi vaksin dilakukan dengan metode microdissection.

3.5.2 Derajat parasitemia adalah jumlah kuantitatif parasit Plasmodium berghei

dalam darah mencit yang dihitung dari ratio jumlah eritrosit terinfeksi tiap

seribu eritrosit dan dinyatakan dalam persen (%). Derajat parasitemia

dilihat dari hapusan darah berasal dari ekor mencit yang diwarnai dengan

pengecatan Giemsa. Penghitungan derajat parasitemia dilakukan di bawah

mikroskop Olympus dengan perbesaran objektif 100x menggunakan

minyak emersi.

3.5.3 Vaksin model pellet adalah vaksin yang didapatkan dari isolat kelenjar

saliva An. sundaicus yang diproses dengan metode freez and thaw,

homogenisasi, water sonication, dan sentrifugasi. Endapan hasil dari

sentrifugasi dicampur dengan adjuvan alumunium hidroksida dan

digunakan sebagai vaksin model pellet. Pembuatan vaksin ini dilakukan di

ruangan steril (laminar)

27

3.5.4 Vaksin model supernatan adalah vaksin yang didapatkan dari isolat

kelenjar saliva An. sundaicus yang diproses dengan metode freez and

thaw, homogenisasi, water sonication, dan sentrifugasi. supernatan hasil

dari sentrifugasi dicampur adjuvan aluminum hidroksida dan digunakan

sebagai vaksin model supernatan. Pembuatan vaksin ini dilakukan di

ruangan steril (laminar).

3.6 Rancangan Penelitian

Keterangan:

S : Sampel

K : Kelompok Kontrol

PP : Kelompok Perlakuan Pellet

PS : Kelompok Perlakuan Supernatan

IM 1 : Imunisasi I

IM 2 : Imunisasi II

IM 3 : Imunisasi III

IN : Inokulasi Plasmodium berghei

DP 2 : Derajat Parasitemia pada hari ke-2

DP 3 : Derajat parasitemia pada hari ke-3

DP 4 : Derajat Parasitemia pada hari ke-4



S

K

Pp IM 1 IM 2 IM 3 IN

DP 2

DP 3

DP 4

DP 5

DP 6

DP 7

PS

28


3.7 Instrumen Penelitian

3.7.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang mencit,

tempat untuk pembedahan mencit, gunting bedah, pinset, jarum pentul, disposible

syringe 1 cc, tabung eppendorf, pipet, mikropistil, satu set mikropipet, Yellow tip,

Blue tip, White tip, vacutainer heparin, ice bag, ice pack, lemari es, autoclave,

vortex, laminar air flow, api bunsen, tabung valcon, pH meter, magnetic stirrer,

hemositometer, mikroskop cahaya, stereoscopic microscope, object glass, cover

glass, label, beaker glass, alumunium foil, toples tertutup, steroform, tissue, kapas,

masker, hand scone.

3.7.2 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah salivary gland

Anopheles sundaicus, isolat Plasmodium berghei, darah intrakardial mencit donor

terinfeksi Plasmodium berghei, Phosphate Buffer Saline (PBS), adjuvan

aluminum hidroksida, freezing solution, medium plus, medium complete,

chloroform, alkohol 70%, cat Giemsa, Buffer Giemsa, methanol, aquades, dan

minyak emersi.

3.8 Prosedur Penelitian

3.8.1 Preparasi Kelenjar Saliva

Pengambilan kelenjar saliva dari nyamuk betina Anopheles sundaicus

dilakukan dengan metode microdissection di bawah mikroskop. Jumlah kelenjar

saliva sebanyak 1.500 pasang kelenjar saliva dalam larutan Phosphate Buffer

Saline (PBS) disimpan pada suhu -20oC.

3.8.2 Preparasi Hewan Coba

Empat puluh lima mencit galur BALB/c berusia 6-8 minggu dibagi

menjadi tiga kelompok. Sebelumnya mencit tersebut diaklimatisasi dahulu selama

29

1 minggu di kandang mencit Laboratoratorium Zoologi Fakultas MIPA

Universitas Jember. Masing-masing kelompok berisi 15 ekor mencit. Kelompok

pertama berperan sebagai kelompok kontrol dan divaksinasi dengan Phosphate

Buffer Saline (PBS) dicampur dengan adjuvan aluminum hidroksida. Kelompok

kedua merupakan kelompok perlakuan pellet yang divaksinasi dengan vaksin

model pelet kelenjar saliva An. sundaicus dicampur dengan adjuvan aluminum

hidroksida. Kelompok ketiga merupakan kelompok perlakuan supernatan yang

divaksinasi dengan vaksin model supernatan kelenjar saliva An. sundaicus

dicampur dengan adjuvan aluminum hidroksida.

3.8.3 Preparasi Vaksin Model Kelenjar Saliva An. sundaicus dan Vaksinasi

Isolat kelenjar saliva nyamuk An. sundaicus dalam larutan PBS yang

sebelumnya disimpan pada suhu -20oC. Melalui proses freez and thaw, isolat

beku tersebut dicairkan dengan cara dimasukkan ke dalam air mendidih selama 3

menit. Setelah melalui proses freez and thaw sampel dihomogenisasi dengan

menggunakan mikropistil sampai homogen. Sampel dikatakan telah homogen

apabila sudah tampak jernih saat dilihat di bawah mikroskop. Sampel kemudian

dihomogenisasi untuk kedua kalinya dengan water sonication selama 30 menit.

Sampel selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 14.000 rpm

pada suhu 4oC untuk memisahkan bagian pellet dan supernatan kelenjar saliva An.

sundaicus. Pellet dan supernatan hasil sentrifugasi kemudian diambil dengan

mikropipet dan dimasukkan dalam tabung falcon yang berbeda kemudian

disimpan pada suhu -20oC. Sebelum vaksinasi masing-masing pellet dan

supernatan ditambah dengan adjuvan aluminum hidroksida

Vaksinasi pada mencit dilakukan 3 kali, yaitu Imunisasi I, II, dan III dengan

interval 2 minggu. Setiap kali vaksinasi, mencit diinjeksi 100 l vaksin dengan

menggunakan disposible syringe 1 cc secara subkutan di femur bagian luar tepat

di bawah lapisan kutaneus mencit.

30

3.8.4 Preparasi Plasmodium berghei

Isolat Plasmodium berghei (P. berghei) diperoleh dari mencit donor

melalui proses pasase. Mencit donor ini sebelumnya telah diukur derajat

parasitemianya hingga mencapai 15 %. Darah dari mencit donor diambil melalui

proses pembedahan dibagian thorax dilanjutkan dengan pengambilan darah secara

intrakardial. Pengambilan darah dilakukan dengan menggunakan disposible

syringe 1 cc yang ditusukkan di jantung. Darah yang diambil kemudian

dimasukkan dalam vacutainer heparin supaya darah tidak membeku. Darah yang

diperoleh dicampur dengan larutan PBS sampai diperoleh pengenceran 104.

Larutan tersebut lalu dimasukkan dalam hemositometer kemudian dihitung jumlah

eritrositnya (n) di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 40x.

Karena terdapat pengenceran, maka didapatkan hasil perhitungan jumlah

eritrosit (a) = n x 104 x 10

4 . Setelah diperoleh jumlah eritrosit, dihitung

pengencerannya dengan rumus sebagai berikut:

Selanjutnya dihitung jumlah darah yang akan diambil dengan rumus:

Darah yang diperoleh kemudian ditambah dengan medium plus. Campuran

tersebut tersebut dimasukkan dalam disposable syringe 1 cc dan siap untuk

diinjeksikan.

3.8.5 Inokulasi Plasmodium berghei pada Hewan Coba

Inokulasi (infeksi) P. berghei pada masing-masing kelompok mencit

donor dilakukan 2 minggu pasca Imunisasi III. Setiap mencit diinjeksi isolat P.

berghei yang telah diencerkan sebanyak 200 l secara intraperitonial.

Jumlah Pengenceran =

Jumlah darah yang diambil =

31

3.8.6 Penghitungan Derajat Parasitemia

Penghitungan derajat parasitemia pada mencit BALB/c yang telah

diinfeksi P. berghei dilakukan 48 jam pasca infeksi yang dilanjutkan dengan

penghitungan pada hari ke-2 sampai hari ke-7. Sebelum penghitungan, dilakukan

pembuatan preparat hapusan darah tepi yang berasal dari ekor mencit dengan

pewarnaan Giemsa. Hapusan darah yang sudah kering kemudian diamati di bawah

mikroskop Olympus dengan perbesaran objektif 100x menggunakan minyak

emersi. Derajat parasitemia diukur dengan menghitung jumlah eritrosit terinfeksi

P. berghei setiap 1000 eritrosit. Adapun rumusnya adalah sebagai berikut:

Derajat Parasitemia= x 100 %

32

3.9 Alur Penelitian

Preparasi Vaksin

Imunisasi I

Imunisasi II

Interval 2 minggu

Imunisasi III

Inokulasi P. berghei

Pengamatan Derajat Parasitemi

(Hari 2-7)

Data

Interval 2 minggu

Interval 48 jam

Isolasi kelenjar saliva Anopheles sundaicus

Interval 2 minggu

Adjuvan aluminum

hidroksida + PBS Vaksin Model

Supernatan Kelenjar

Saliva An. sundaicus

Vaksin Model Pellet

Kelenjar Saliva An.

sundaicus

Kelompok

Kontrol

Kelompok

Pellet

Kelompok

Supernatan

33

3.10 Penyajian Data

Data yang diperoleh dari hasil penelitian dicatat dalam buku catatan (log

book) dan disimpan dalam komputer. Data ditampilkan dalam bentuk diagram

kemudian dijelaskan secara diskriptif.

34

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil penelitian

4.1.1 Isolasi Kelenjar Saliva Anopheles sundaicus

Seribu lima ratus pasang kelenjar saliva diisolasi dari nyamuk An.

sundaicus betina yang didapatkan dari kawasan pantai Kenagarian Sungai Pinang,

Kabupaten Pesisir Selatan, Sumatera Barat. Isolasi dilakukan dengan metode

microdissection menggunakan entomological needles. Setiap 50 pasang kelenjar

saliva dalam larutan PBS dimasukkan dalam tabung eppendorf kemudian

disimpan pada suhu -20oC. An. sundaicus memiliki sepasang kelenjar saliva yang

terletak di bagian depan thorax dimana masing-masing kelenjar saliva terdiri atas

tiga lobus dengan duktus yang bermuara pada salivary pump seperti pada gambar

4.1. Masing-masing kelenjar saliva terdiri dari 2 lobus lateral dan 1 lobus medial.

Lobus lateral terdiri dari bagian proksimal dan distal sedangkan lobus medial

hanya terdiri dari satu bagian.

Gambar 4.1 Hasil isolasi kelenjar saliva An. sundaicus. PL: proksimal lateral lobe , DL: distal lateral lobe, ML: medial lobe. Mikroskop: KYOWA No.701113

(perbesaran 100x)

4.1.2 Preparasi Vaksin dan Vaksinasi

Isolat kelenjar saliva beku dalam larutan PBS dicairkan dengan cara freez

and thaw, dihomogenisasi dengan mikropistil dan selanjutnya disonikasi

Lobus

Lateral

Lobus

Lateral

Lobus

Medial

35

menggunakan water sonication. Sampel selanjutnya disentrifugasi sehingga

bagian pellet dan supernatan terpisah. Volume pellet hasil sentrifugasi yang

didapatkan sebanyak 3000 l. Volume supernatan yang didapatkan sebanyak 23,5

ml. Jumlah supernatan tersebut kemudian disentrifugasi lagi sehingga didapatkan

volume akhir supernatan sebanyak 3000 l. Sebelum vaksinasi, pellet dan

supernatan masing-masing ditambah adjuvan aluminum hidroksida dengan

perbandingan volume 1:1. Vaksin model pellet terdiri dari 800l pellet kelenjar

saliva ditambah dengan 800l adjuvan aluminum hidroksida untuk setiap kali

vaksinasi dan selanjutnya diinjeksi pada mencit kelompok perlakuan pellet.

Vaksin model supernatan terdiri dari 800l supernatan kelenjar saliva ditambah

dengan 800l adjuvan aluminum hidroksida untuk setiap kali vaksinasi. dan

selanjutnya diinjeksi pada mencit kelompok perlakuan supernatan. Kelompok

kontrol diberikan campuran larutan PBS dengan adjuvan aluminum hidroksida.

Campuran terdiri 800l larutan PBS ditambah dengan 800l adjuvan aluminum

hidroksida. Proses pembuatan vaksin dilakukan di ruangan steril (laminar).

Vaksinasi dilakukan sebanyak 3 kali dengan interval waktu untuk setiap

kali vaksinasi adalah 2 minggu. Vaksin diinjeksi secara subkutan di femur bagian

luar mencit. Masing-masing volume vaksin model untuk tiap mencit adalah 100l.

4.1.3 Derajat Parasitemia

Derajat parasitemia ditentukan dengan cara menghitung jumlah eritrosit

terinfeksi setiap 1000 eritrosit dan dinyatakan dalam persen (%). Eritrosit

terinfeksi mengandung satu atau lebih ringform, memiliki dinding yang lebih

elastis serta ukuran sel yang lebih besar daripada eritrosit normal (Gambar 4.2).

Penghitungan derajat parasitemia dilakukan 2 kali yaitu dengan ulangan populasi

dan ulangan individu. Hasil penghitungan persentase derajat parasitemia tiap

populasi dan tiap individu ditampilkan dalam gambar 4.4 dan 4.5.

36

Gambar 4.2 Hapusan darah mencit pasca inokulasi Plasmodium berghei. Anak panah

menunjukkan eritrosit yang terinfeksi parasit.

Gambar 4.3 Grafik perkembangan derajat parasitemia (%) pada populasi (n=3) dalam

kelompok. K: Kelompok kontrol; P: Kelompok perlakuan pellet; S: Kelompok perlakuan supernatan.

-2.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

2 3 4 5 6

Der

aja

t P

ara

site

mia

(%

)

Hari ke-

K

P

S

37

Gambar 4.4 Grafik perkembangan derajat parasitemia (%) dengan ulangan individu. K: individu pada kelompok kontrol; P: individu pada kelompok perlakuan

pellet; S: individu pada kelompok perlakuan supernatan.

Berdasarkan kedua grafik di atas semakin hari derajat parasitemia semakin

meningkat. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa pada hari ke-6 kelompok

perlakuan pellet memiliki kecenderungan derajat parasitemia yang lebih rendah

dibandingkan dengan kelompok perlakuan supernatan dan kelompok kontrol.

Sedangkan kelompok perlakuan supernatan mengalami kecenderungan lebih

rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Besarnya persentase derajat parasitemia kedua grafik diatas cenderung

tidak sama. Hal ini karena pada grafik ulangan individu data diperoleh dari

perkembangan derajat parasitemia 1 mencit dari tiap kelompok. Preparat hapusan

darah dari 1 sampel tersebut dihitung sebanyak 3 kali kemudian dihitung nilai

rata-ratanya. Penghitungan ulang sebanyak 3 kali pada tiap sampel (individu)

dilakukan untuk mengoreksi distribusi parasit pada sediaan hapusan darah yang

cenderung tidak merata. Nilai derajat parasitemia pada ulangan populasi

merupakan akumulasi dari nilai rata-rata pada 3 individu pada satu kelompok.

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

20.0

2 3 4 5 6

Der

aja

t P

ara

site

mia

(%

)

Hari ke-

K

P

S

38

Grafik ulangan populasi juga menampilkan nilai standar deviasi yang

menunjukkan ukuran penyebaran data antar sampel tiap kelompok.

4.2 Pembahasan

4.2.1 Kelenjar saliva Anopheles sundaicus.

Isolasi kelenjar saliva dilakukan dengan metode microdissection

menggunakan entomological needles dibawah mikroskop stereo (Jariyapan et al.,

2008). Kelenjar saliva yang diisolasi disimpan dalam tabung eppendorf yang

berisi larutan Phosphat Buffer Saline (PBS). Penggunaan buffer pada

penyimpanan isolat kelenjar saliva ini berfungsi untuk menjaga agar sel-sel

kelenjar saliva tidak mengalami destrukturisasi sehingga komponen yang terdapat

didalamnya tidak mengalami malfungsi dan larut (Desmarais et al., 2002;

Ghalanbor et al., 2008).

Anopheles betina mempunyai sepasang kelenjar saliva dan masing-masing

mempunyai 3 lobus yaitu 2 lobus lateral dan satu lobus medial (Gambar 4.5)

(Jariyapan et al., 2007).

Gambar 4.5 Kelenjar saliva Anopheles betina. A: Hasil isolasi kelenjar saliva Anopheles

sundaicus, B: Hasil isolasi kelenjar saliva Anopheles dirus. PL: proksimal lateral lobe , DL: distal lateral lobe, ML: medial lobe (Sumber: Jariyapan et

al., 2007)

Lobus lateral dibagi lagi menjadi regio proksimal dan distal. Setiap lobus

memiliki duktus di bagian tengah yang dindingnya dilapisi oleh selapis sel epitel

dan bagian luarnya merupakan lapisan lamina basalis. Duktus dari masing-masing

B A

Lobus

Lateral

Lobus

Medial

Lobus

Lateral

39

lobus menyatu dan bermuara di hipofaring. Bagian anterior dari tiap lobus

diinervasi oleh ganglia ingluvial yang terletak di pertemuan foregut dan midgut

yang mengatur pengeluaran saliva (Dhar dan Kumar, 2003).

Saliva Anopheles betina mengandung dua enzim, apyrase dan alfa-

glocosidase. Enzim ini terakumulasi pada regio distal dan proksimal dari lobus

lateral. Regio distal dari lobus lateral dibutuhkan nyamuk untuk blood feeding.

Enzim Apyrase disintesis dan diakumulasi pada regio spesifik tersebut, dari

kelenjar saliva nyamuk Anopheles betina dan dikaitkan dengan penghambatan

agregasi platelet yang memfasilitasi blood feeding nyamuk. Enzim ini disekresi

oleh kelenjar saliva hanya pada saat blood feeding. Sedangkan untuk alfa-

glucosidase disekresikan hanya pada saat sugar feeding sebagai sugar stablization

(Jariyapan et al., 2007; James, 2003).

4.2.2 Vaksin Model Vaksin dan Vaksinasi

Preparasi model vaksin diawali dengan proses freez and thaw. Freeze and

Thaw merupakan suatu metode untuk melisiskan sel dengan adanya perubahan

suhu secara mendadak sehingga membran sel bengkak (swelling) dan kemudian

pecah menyebabkan protein keluar dari sel (Termo Scientific, 2009). Dalam

penelitian ini, isolat kelenjar saliva beku dalam suhu -20oC dicairkan dengan cara

dimasukkan dalam air mendidih selama 3 menit (Hajipirloo et al., 2005). Untuk

memaksimalkan sel yang lisis guna pengeluaran protein dilakukan homogenisasi.

Mikropistil merupakan hemogenisator mekanik dimana gerakan memutar pistil

secara manual menghasilkan gaya mekanik untuk memecah sel-sel tersebut

sehingga unsur di dalamnya keluar (Murray, 2003). Proses selanjutnya adalah

sonikasi dengan water sonication. Sonikasi merupakan metode untuk melisiskan

sel dengan gelombang suara frekuensi tinggi (20-50 kHz). Gelombang suara ini

menghasilkan energi mekanik yang dapat melisiskan sel. Sampel dalam probe

direndam dalam air dengan suhu yang rendah untuk mencegah denaturasi protein

(Thermo Scientific, 2009). Tujuan dari sonikasi menggunakan water sonicator

adalah untuk menyempurnakan proses homogenisasi kelenjar saliva Anopheles

sundaicus. Sampel yang telah homogen disentrifugasi untuk memisahkan pellet

40

dan supernatan. Supernatan yang didapat dari sentrifugasi sebanyak 23,5 ml.

Volume tersebut mengandung terlalu banyak larutan PBS sehingga perlu

dipekatkan lagi. Semakin pekat larutan berarti jumlah protein ekstrak kelenjar

saliva terlarut akan lebih banyak dibandingkan dengan larutan sehingga bisa

memaksimalkan efek vaksin supernatan yang dibuat. Pemekatan dilakukan

dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada

suhu 4oC. Volume akhir supernatan yang didapatkan dari hasil sentrifugasi

sebanyak 3000 l. Volume pellet yang didapatkan sebanyak 3000 l.

Jenis model vaksin yang digunakan dalam penelitian adalah vaksin pellet

dan vaksin supernatan dari ekstrak kelenjar saliva An. sundaicus dimana keduanya

mengandung adjuvan aluminum hidroksida. Adjuvan berasal dari bahasa latin

adjuvare yang berarti membantu atau meningkatkan (Vogel, 1998). Adjuvan

merupakan substansi bukan antigen yang ditambahkan dalam vaksin (Harold dan

Stills, 2005). Penambahan adjuvan dalam vaksin berfungsi untuk membantu

meningkatkan respon imun sehingga meningkatkan efikasi dari vaksin. Sampai

saat ini banyak adjuvan yang telah ditemukan dan diklasifikasikan dalam

beberapa golongan diantaranya adalah mineral salt adjuvants (aluminum

hidroksida dan aluminum phospat), tensoactive adjuvants, bacteria derived

adjuvants, adjuvants emultions (FIA, FCA, Montanide, Adjuvan 65, Lipovant),

liposome adjuvant , polymericmicrosphere adjuvants, cytokines as adjuvants, dan

carbohydrates adjuvants (Petrovsky et al., 2004). Aluminum hidroksida

merupakan adjuvan yang paling banyak digunakan dalam vaksinasi pada manusia

maupun hewan selama lebih dari 60 tahun dan menginduksi respon imun ke arah

Th2. Penggunaan adjuvan ini terutama digunakan dalam vaksinasi pada penyakit

tetanus, difteri, pertusis, hepatitis A, hepatitis B dan poliomyelitis (Linbland,

2004). Adjuvan ini bekerja dengan cara merangsang pembentukan granuloma

kecil yang menyimpan antigen kemudian melepaskannya sedikit demi sedikit

untuk memperpanjang proses pajanan antigen dengan sistem imun non spesifik

(innate immunity (Coffmann et al., 2010).

Pemisahan bagian pellet dan supernatan kelenjar saliva sebagai komponen

dalam pembuatan vaksin model kelenjar saliva An. sundaicus berhubungan

41

dengan kandungan protein pada masing-masing bagian pellet dan supernatan.

Pemisahan kedua bagian tersebut dilakukan dengan cara sentrifugasi yang

memanfaatkan gaya sentrifugal dan gaya gravitasi. Kecepatan proses

pengendapan dipengaruhi oleh berat molekul dan bentuk partikel. Semakin besar

berat molekul yang disentrifuge maka semakin mudah partikel tersebut akan

mengendap (Yuwono, 2005). Bentuk partikel protein berhubungan dengan

kelarutan protein tersebut. Protein globular merupakan protein berbentuk bulat

dengan rantai peptide yang melipat padat dan jenis protein larut dalam air dan

larutan garam, misalnya albumin, globulin, antibodi, dan hampir semua enzim.

Protein fibrosa merupakan bentuk protein yang menyerupai serabut dengan rantai

polipeptida yang memanjang, misalnya kolagen, keratin, fibroin. Umumnya

protein ini tidak larut dalam air dan larutan garam (Sumardjo, 2009). Sentrifugasi

mengakibatkan partikel-partikel yang berbeda ukurannya terpisah pada lapisan

(zone) yang berbeda pada tabung (Yuwono, 2009). Sentrifugasi homogenate sel

dengan kecepatan antara 10.000-20.000 rpm selama 10 menit menghasilkan

bagian pellet yang terdiri dari nukleus, komponen tidak larut (insoluble),

mitokondria, lisosom, peroksisom dan debris sel. Sedangkan bagian supernatan

mengandung garam, mikromolekul, dan komponen terlarut (soluble) dari

sitoplasma (Carprette, 1995). Dengan demikian pemisahan bagian pellet dan

supernatan bertujuan untuk mengetahui potensi dari komponen protein insoluble

pada pellet dan komponen protein soluble pada supernatan.

Vaksinasi (imunisasi) yang dilakukan dalam penelitian ini sebanyak 3 kali

dengan interval setiap kali vaksinasi adalah 2 minggu. Imunisasi I berperan

sebagai pemicu awal, kemudian diperkuat dengan Imunisasi II dan Imunisasi III

(booster) untuk memaksimalkan respon imun terhadap antigen dalam vaksin.

Pada imunisasi I (vaksinasi primer) tubuh akan membentuk respon imun untuk

mengaktivasi sel B dan sel T. Sel B akan bereplikasi membentuk sel memori yang

menghasilkan antibodi. Paparan berulang dari antigen vaksin menyebabkan sel

memori yang dihasilkan lebih banyak sehingga respon imun humoral yang

terbentuk menjadi lebih kuat (Baratawidjaja, 2009).

42

Rute vaksinasi pada mencit diberikan secara subkutan di femur bagian

luar. Pemberian secara subkutan dan intramuskular merupakan rute tersering dan

terbaik dalam vaksinasi aktif atau pasif. Suntikan secara intravena dapat

mengurangi respons imun (Baratawidjadja, 2009). Selain itu, injeksi subkutan

direkomendasikan untuk penggunaan aluminum hidroksida sebagai adjuvan

karena efek samping yang timbul apabila diberikan secara subkutan sangat

minimal dibandingkan dengan rute lain (Linbland, 2004). Metode injeksi secara

subkutan juga didasarkan pada cara nyamuk menggigit inang untuk menghisap

darah. Saat proses blood feeding nyamuk akan menempelkan probosisnya pada

kulit inang, menembus connective tissue yang terletak tepat diatas lapisan

subkutan (Fontaine et al., 2011). Hal ini menyebabkan antigen terpajan oleh sel

fagosit Langerhans yang berada pada lapisan subkutan sehingga meningkatkan

interaksi dengan sel-sel kekebalan nonspesifik (Harold dan Stills, 2005).

Volume vaksin model yang diinjeksikan pada masing-masing mencit

sebanyak 100L. Hal ini berkaitan dengan rute pemberian vaksin tersebut. 100

L adalah dosis campuran imunogen dan adjuvan yang direkomend

skripsi fix dini pdf

Documents