PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini yaitu uji ketelitian pipetasi bertujuan untukmengetahui cara menggunakan pipet piston (clinipette) serta membandingkan ketelitiannya dengan pipet gelas dan untuk mengetahui cara mengukur konsentrasi sampel dengan menggunakan alat spektrofotometer.Keahlian, keterampilan dan ketelitian dalam menggunakan pipet sangat penting dalamanalisis bidang klinik karena perbedaan volume yang kecil saja dapat memberikan hasil yang berbeda sehingga dapat menyebabkan kesalahan dalam menginterpretasikan hasil yang diperoleh. Oleh karana itu, dilakukan percobaan untuk membandingkan ketelitian dari pipet gelas dan pipet piston.

Pipet biasa digunakan dalam pengujian-pengujian biologi molekular, kimia analitik, juga kedokteran. Pipet dibuat dalam berbagai macam jenis untuk tujuan yang berbeda-beda dengan tingkat ketelitian dan ketepatan yang berbeda-beda pula.Pipet piston bekerja dengan metode pemindahan udara berbantuan piston. Ruang hampa dihasilkan dengan menggerakkan piston logam atau keramik pada arah vertikal di dalam lengan yang kedap udara. Ketika piston bergerak ke atas, udara dari ujung naik memenuhi sisa ruang yang kosong, dan udara di ujung kemudian digantikan oleh cairan. Pipet jenis ini memiliki kemampuan yang sangat tepat dan teliti, tetapi justru pemindahan udara menjadi faktor ketidaktelitian, yang disebabkan oleh berubahnya lingkungan, khususnya suhu dan kecakapan teknis pengguna. Untuk alasan inilah pipet ini harus dipelihara dan dikalibrasi secara saksama, dan pengguna harus dilatih untuk menjalakan teknik pemakaian yang tepat dan konsisten. Agarpenggunaan pipet piston optimal, ada beberapa hal yang harus diperhatikan seperti:

Konsisten speed dan kelancaran saat menekan dan melepaskan tombolnya Konsisten tekanan pada plunger Konsisten dan cukup saat memasukkan Tip ke dalam cairan Posisi tip pada cairan Posisinya Hampir Vertikal dari pipet Menghindari semua gelembung udara Tidak membalikkan pipet jika terdapat cairan di ujung tip.

Pada pipet gelas, tergantung pada pembacaan skala. Orang yang menggunakan pipet (praktikan) sangat berpengaruh dengan hasil yang didapat. Padapipet gelas harus tepat dalam pembacaan skala sedangkan pada pipet piston harus diperhatikan hal-hal yang sebelumnya telah disebutkan diatas agar diperoleh hasil yang optimal. Percobaan ini dilakukan dengan bantuan spektrofotometer. Bahan yang digunakan adalah Kalium Permanganat (KMnO4). Larutan baku induk kaliumpermanganat yang sudah ada, kemudian dibuat seri dari larutan baku tersebut dengan pengenceran 1 (300 L), pengenceran 2 (400 L), dan pengenceran 3 (500L). Pengenceran dilakukan secara duplo dengan menggunakanpipet piston dan pipet gelas. Masing-masing absorbansi larutan pada tiappengenceran diukur pada panjang gelombang maksimum 546 nm. Kaliumpermanganat merupakan senyawa yang berwana ungu. Oleh karena itu, pengukuran dilakukan pada panjang gelombang visible pada panjang gelombang 546 nm.

Kemudian diperoleh absorbansi tiap pengenceran dengan menggunakan pipet piston dan pipet gelas, seperti dalam tabel pada data pengamatan. Kemudian dihitung rata- rata (,standar deviasi(SD),dan koefisien variasi (KV). Nilai standar deviasi (SD) dapat diperoleh dengan perhitungan:

Dan koefisien variasi (KV) dapat diperoleh dengan perhitungan:

Nilai standar deviasi digunakan untuk mengetahui presisi dan akurasi yang didapatkan. Akurasi adalah ukuran seberapa dekat suatu angka hasil pengukuran terhadap angka sebenarnya (true value atau reference value). Presisi adalah ukuran seberapa dekat suatu hasil pengukuran satu dengan yang lainnya. Makin kecil nilai SD dan KV yang didapatkan, maka ketelitian makin baik.Berdasarkan hasil pengamatan pada pengenceran pertama sebanyak 300 l larutan KMnO4 dipipet dengan menggunakan pipet piston dan pipet gelas. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan aquades sebagai pelarutnya. Aquades ditambahkan hingga 1000 l. Pemipetan ini dilakukan secara duplo. Hasil percobaan dengan menggunakan pipet gelas, didapatkan nilai absorbansi sebesar 0,497; 0,506; 0,518; 0,511; 0,493; 0,480; 0,542; 0,535; 0,488; 0,507. Sedangkan nilai absorbansi dengan menggunakan pipet piston adalah 0,436; 0,438; 0,548; 0,718; 0,486; 0,457; 0,550; 0,572; 0,450; 0,408. Rata-rata nilai absorbansi untuk pipet gelas sebesar 0,5077, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,5063. Nilai standar deviasi untuk pipet gelas sebesar 0,0197, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,093. Koefisien variasi untuk pipet gelas adalah 3,88, sedangkan untuk pipet piston adalah 18,36. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena seharusnya pipet piston memiliki nilai standar deviasi dan koefisien variasi yang lebih kecil dibandingkan pipet gelas.

Dari grafik pengenceran pertama dapat diketahui bahwa hasil pengukuran keseluruhan dapat diterima karena tidak ada nilai absorbansi yang berada pada rentang batas control atau diatas X+3SD, yaitu sebesar 0,5668 untuk pipet gelas dan 0,7853 untuk pipet piston. Namun, terdapat data absorbansi pipet piston yang melebihi batas peringatan (X + 2SD) sebesar 0,693Pada pengenceran kedua, sebanyak 400 l larutan KMnO4 dipipet dengan menggunakan pipet piston dan pipet gelas. Pengenceran dilakukan dengan menambahkan aquades sebagai pelarutnya. Aquades ditambahkan hingga 1000 l. Ada beberapa syarat pelarut dalam menggunakan Spektrofotometri Uv-Vis ini, yaitu dapat melarutkan cuplikan, inert (tidak memberikan serapan atau radiasi), meneruskan radiasi dalam daerah panjang gelombang yang diukur, serta harus memiliki tingkat kepolaran yang hampir sama dengan sampel. Setelah melakukan pengenceran, larutan KMnO4 diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada max = 546 nm.

Pengukuran ini dilakukan dua kali untuk setiap kelompok dengan menggunakan kuvet yang berbeda-beda. Penggunaan kuvet yang berbeda untuk setiap pengujian dilakukan agar tidak terjadi kontaminasi dari larutan KMnO4 dengan konsentrasi yang berbeda yang akan mempengaruhi nilai absorbansinya. Ada beberapa kontaminasi yang mungkin terjadi pada saat pengukuran yang berasal dari pemipetan, yaitu:

Kontaminasi Pipet ke SampelPenyebabnya adalah menggunakan tip atau pipet yang sudah terkontaminasi. Pencegahan yang dapat dilakukan adalah membersihkan dan mensterilkan bagian pipet yang kontak dengan sampel. Gunakan tips steril, dan ganti tip setiap berganti sampel.Kontaminasi Sampel ke PipetPenyebabnya adalah sampel atau aerosol dari sampel kontak dan memasuki bagian pipet. Pencegahan yang dapat dilakukan adalah tidak terlalu memiringkan pipet, simpan selalu pipet secara vertikal, sedot cairan dengan perlahan dan gunakan filter tip ataugunakan pipetpositive-displacement.

Kontaminasi Sampel ke Sampel (samplecarryover)Penyebabnya adalah menggunakan tip bekas untuk sampel yang berbeda. Pencegahan yang dapat dilakuan adalah mengganti tip setiapberganti sampel.

Setelah mendapatkan nilai abosrbansi, selanjutnya nilai absorbansi dari kedua cara pemipetan yaitu pemipetan dengan pipet piston dan pipet gelas dibandingkan dengan melihat nilai standar deviasi (SD) dan koefisien variasi (KV). Standar deviasi menunjukkan ketidaktelitian yang dilakukan, sedangkan koefisien variasi menunjukkan ketidaktelitian yang dinyatakan dalam persen. Nilai standar deviasi digunakan untuk mengetahui presisi dan akurasi yang didapatkan dari percobaan ini. Akurasi adalah ukuran seberapa dekat suatu angka hasil pengukuran terhadap angka sebenarnya (true value atau reference value). Presisi adalah ukuranseberapa dekat suatu hasil pengukuran satu dengan yang lainnya. Semakin besar nilai SD dan KVyang didapatkan, maka ketelitian semakin rendah yang berarti metodeyang digunakan mempunyai ketidaktelitian yang tinggi.

Dari hasil percobaan dengan menggunakan pipet gelas, didapatkan nilai absorbansi sebesar 0,691 ; 0,600 ; 0,685 ; 0,688 ; 0,672 ; 0,713 ; 0,687 ; 0,689 ; 0,681 ; 0,678. Sedangkan nilai absorbansi dengan menggunakan pipet piston adalah 0,661 ; 0,644 ; 0,650 ; 0,636 ; 0,655 ; 0,674 ; 0,743 ; 0,768 ; 0,664 ; 0,659. Rata-rata nilai absorbansi untuk pipet gelas sebesar 0,6784, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,6754. Dapat terlihat bahwa nilai absorbansi untuk kedua pipet berbeda cukup jauh. Nilai standar deviasi untuk pipet gelas sebesar 0,029, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,043. Koefisien variasi untuk pipet gelas adalah 4,27, sedangkan untuk pipet piston adalah 6,36. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena seharusnya pipet piston memiliki nilai standar deviasi dan koefisien variasi yang lebih kecil dibandingkan pipet gelas.Dari grafik pengenceran kedua dapat diketahui bahwa hasil pengukuran keseluruhan dapat diterima karena tidak ada nilai absorbansi yang berada pada rentang batas control atau diatas X+3SD, yaitu sebesar 0,7654 untuk pipet gelas dan 0,8044 untuk pipet piston. Namun, terdapat data absorbansi pipet piston yang melebihi batas peringatan (X + 2SD) sebesar 0,7614.

Pada pengenceran ketiga, larutan KMnO4 dipipet sebanyak 500 l dengan menggunakan pipet gelas dan pipet piston. Kemudian ditambahkan aquadest hingga 1000 l. Pengukuran dilakukan duplo dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjanggelombang546nm. Hal yang tidak kalah penting diperhatikan adalah cara memegang kuvet atau tempat sampel. Bagian bening pada kuvet tidak boleh dipegang atau kotor, karena bagian bening tersebut akan dilewati berkas sinar. Sehingga jika bagian bening tersebut tersentuh akan mempengaruhi nilai absorbansi sampel.

Dari hasil percobaan dengan menggunakan pipet gelas, didapatkan nilai absorbansi sebesar 0,862 ; 0,855 ; 0,877 ; 0,883 ; 0,851 ; 0,862 ; 0,879 ; 0,849 ; 0,861 ; 0,885. Sedangkan nilai absorbansi dengan menggunakan pipet piston adalah 0,871 ; 0,876 ; 0,767 ; 0,846 ; 0,852 ; 0,849 ; 0,862 ; 0,846 ; 0,889 ; 0,87. Rata-rata nilai absorbansi untuk pipet gelas sebesar 0,8664, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,8528. Dapat terlihat bahwa nilai absorbansi untuk kedua pipet berbeda cukup jauh. Nilai standar deviasi untuk pipet gelas sebesar 0,013, sedangkan untuk pipet piston sebesar 0,03. Koefisien variasi untuk pipet gelas adalah 1,5, sedangkan untuk pipet piston adalah 3,51. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena seharusnya pipet piston memiliki nilai standar deviasi dan koefisien variasi yang lebih kecil dibandingkan pipet gelas. Pipet piston seharusnya terlihat memiliki akurasi dan presisi yang lebih baik dibandingkan pipet gelas.Dari grafik pengenceran kedua dapat diketahui bahwa hasil pengukuran keseluruhan dapat diterima karena tidak ada nilai absorbansi yang berada pada rentang batas control atau diatas X+3SD, yaitu sebesar 0,9054 untuk pipet gelas dan 0,9428 untuk pipet piston. Seluruh hasil juga tidak melebihi batas peringatan yaitu sebesar 0,8924 untuk pipet gelas dan 0,9128 untuk pipet piston. Sehingga data yang didapatkan cukup baik.

Semakin kecil standar deviasi maka akan semakin kecil pula koefisien variasinya. Semakin kecil koefisien variasi maka akan semakin baik pengukurannya karena memilikiketelitian tinggi. Pada hasilpercobaan, diperoleh data bahwa pemipetan menggunakan pipet pistontidak lebih baik daripada pipet gelas dimana koefisien variasi dari seluruh pengukuran pada pipet piston selalu lebih besar daripada pemipetan dengan pipet gelas. Hal ini mungkin terjadi karena pemipetan yang menggunakan pipet pistondilakukan oleh beberapa orang dimana setiap orang memiliki kemampuan berbeda untuk setiap pelaksanaan prosedurnya. Selain itu kemungkinan terjadi kesalahan karena pemipetan dilakukan dengan tidak baik misalnya tidak dilakukan dengan tegak lurus atau penekanan pistonyang tidak tepat sehingga sampel yang terambiljumlahnya tidaktepat. Akan tetapi kemungkinan kerusakan pada alat (pipet piston) pula dimungkinkan terjadi.

Hasil pengamatan ini menunjukkan beberapa hal yang tidaksesuai dengan teori mengenai pipet piston dan pipet gelas. Pada pipet piston sudah ada pengaturan volume yang akan diambil sehingga sudah terkalibrasi dengan baik, sehingga lebih teliti dari pipet gelas. Sedangkan pada pipet gelas, tergantung pada ketepatan pembacaan skala. Sehingga ketelitian pipet gelas tidak lebih baik dibandingkan dengan pipet piston karena kemungkinan kesalahan lebih mudah terjadipada pembacaan pipet gelas. Pemipetan yang eksak merupakan salah satu hal yang sangat penting. Apabila pipet-pipet yang digunakan tidak sesuai dan tidak akurat, maka akan menimbulkan penyimpangan-penyimpangan yang relatif besar.

Pipet piston merupakan salah satu alat yang sering digunakan di laboratorium. Awalnya pipet ini memiliki volume yang tetap, namun kemudian berkembang hingga memiliki volume yang dapat diatur pada range tertentu. Pipet jenis ini lebih sering digunakan karena selain volumenya yang dapat diatur, akurasi dan presisi yang tinggi, pemakaiannya pun sederhana dan mudah. Pipet jenis lain yang juga sering digunakan adalah pipet yang terbuat dari gelas. Pipet gelas memiliki kekurangan, yaitu selain penggunaannya yang sedikit sulit, dalam pengambilan larutan harus menggunakan bantuan bulb ataumulut untuk mengambil larutan, akurasidan presisinya lebih rendah dibanding dengan pipetpiston.

Dari pengamatan data tersebut dapat dilihat pula bahwa perbedaan absorbansi pada pengenceran yang sama dengan alat yang sama memberikan hasil absorbansi yang cukup jauh perbedaannya. Dari hal ini pula disimpulkan bahwa kesalahan tidak sepenuhnya karena kurang cermatnya praktikan, namunada faktor alat yang mempengaruhi hasilnya. Seharusnya data yang diperoleh dari penggunaan alat yang sama tidakterlalu jauh. Kesalahan pun mungkin terjadi pada alat spektrofotometer. Tetapi mungkin kesalahannya tidak terlalu besar karena spektrofotometer yang digunakan dalam kondisi yang cukup baik dan terawat. Praktikan pun tidak mengetahui apakah alat sudah dikalibrasi atau belum. Kuvet yang digunakan pun berada dalam kondisi yang baik apabila diperhatikan secara visual. Namun tidak menutup kemungkinan adanya partikel yang menempel pada kuvet sehingga mempengaruhi absorbansi sampel.

Pengukuran KmnO4 dilakukan pada max 546 nm, karena panjanggelombang546nmmerupakan max untuk KMnO4 yang berwarna ungu sehingga pengukurannya dilakukan pada panjang gelombang sinar visible. Pada prinsipnya spektroskopi UV-Vis menggunakan cahaya sebagai tenaga yang mempengaruhi substansi senyawa kimia sehingga menimbulkan cahaya.Cahaya yang digunakan merupakan foton yang bergetar dan menjalar secara lurus dan merupakan tenaga listrik dan magnet yang keduanya saling tagak lurus. Tenaga foton bila mmepengaruhi senyawa kimia, maka akan menimbulkan tanggapan (respon), sedangkan respon yang timbul untuk senyawa organik ini hanya respon fisika atau Physical event. Tetapi bila sampai menguraikan senyawa kimia maka dapat terjadi peruraian senyawa tersebut menjadi molekul yang lebih kecil atau hanya menjadi radikal yang dinamakan peristiwa kimia atau Chemical event. Perbedaan spektrofotometer UV dan visible yaitu:

Spektrofotometer visible

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram. Sampel yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sampel yang memiliki warna. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analit yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan stabil. biasanya pengujian menggunakan reagent pewarna mempunyai waktu maksimal untuk mengukur agar valid.Spektrofotometer UV

spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.Cara kerja alat spektrofotometer UV-Vis yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju monokromator, Cahaya dari monokromator diarahkan terpisah melalui sampel dengan sebuah cermin berotasi, Detektor menerima cahaya dari sampel secara bergantian secara berulang ulang, Sinyal listrik dari detektor diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya, perhitungan dilakukan dengan komputer yang sudah terprogram.Alat spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur absorbansi yang dapat menentukan konsentrasi sampel. Hal ini sesuai dengan Hukum Lambert Beer yaitu konsentrasi berbanding lurus dengan absorbansi.

A= a. b. c

Dimana, A: Absorban

a: Absobtivitas

b: Tebal kuvet / jalannya sinar pada larutan

c: Konsentrasi larutan