PEMBUATAN MEDIA MURASHIGE DAN SKOOG (MS)

Laporan PraktikumUntuk memenuhi tugas Matakuliah Kultur Jaringan Tumbuhan

yang dibina oleh Ibu Balqis, S.Pd., M.Si dan Ibu Frida Kunti Setiowati, S.Si, M.Si

Oleh:Kelompok II

Alfian Oktavijayanti (110341421527)Jamilatus Sa’diyah (110341421534)Novy Kurnia Rikardo (10342422006)

The Learning University

UNIVERSITAS NEGERI MALANGFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGIFebruari 2015

A. Topik

Pembuatan Media

B. Hari/Tanggal

Rabu/11-Februari-2015

C. Tujuan

1) Untuk mempraktikkan cara membuat media dengan tepat

D. Dasar Teori

Kebutuhan nutrisi sel dan jaringan tumbuhan yang dikultur penting untuk

diperhatikan supaya kultur jaringan tumbuhan berhasil. Nutrisi untuk sel dan jaringan

yang dikultur terdiri atas komponen utama dan komponen tambahan. Komponen utama

meliputi bahan mineral, sumber karbon (gula), vitamin, dan zat pengatur tumbuh (ZPT).

Komponen lain seperti senyawa nitrogen organik, asam-asam organik, metabolit dan

ekstrak tambahan tidak mutlak diperlukan, tetapi dapat menguntungkan pertahanan sel dan

perbanyakannya (Margono dan Balqis, 2003). Tanaman dapat tumbuh pada kondisi in

vitro ketika tersedia media yang terspesialisasi. Media biasanya terdiri dari larutan garan

yang menyediakan kebutuhan unsur mayor dan minor untuk pertumbuhan tumbuhan

(George et al, 2008).

Praktikum di laboratorium memerlukan kepraktisan, maka senyawa yang digunakan

untuk membuat media disiapkan dalam bentuk stok larutan. Stok larutan dapat dibuat

secara terpisah atau dicampur tergantung apakah senyawa tersebut bereaksi satu dengan

yang lain atau tidak. Jika suatu jenis medium menggunakan banyak stok larutan dalam

komposisinya, maka larutan stok perlu disiapkan dalam kuantitas yang banyak. Demikian

pula sebaliknya (Margono, 2001).

Terfokus pada ZPT. Terdapat 2 kelompok ZPT penting, yaitu sitokinin dan auksin.

Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel,

jaringan, dan kultur organ. Perimbangan konsentrasi dan interaksi antara ZPT yang

diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen akan menentukan

arah perkembangan suatu kultur (Karjadi dan Buchori, 2007).

Untuk memudahkan pembuatan, media dibagai-bagi dalam kelompok larutan stok,

yaitu stok elemen makro, elemen mikro, besi suplemen organik, auksin dan sitokinin.

Setiap kelompok ini dibuat secara terpisah. Umumnya larutan stok dibuat dalam jumlah

besar yang ekivalen dengan kandungan zat-zat yang menyususnnya dalam 1 L medium.

Larutan stok disimpan dalam almari pendingin dan dikeluarkan pada saat pembuatan

media saja (Margono dan Balqis, 2003).

E. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain.

1. Erlenmeyer 100 ml

2. Beaker glass 250 ml

3. Batang pengaduk

4. Gelas ukur 100 ml

5. Neraca digital

6. Kompor

7. Autoklaf

8. Nampan plastik

9. Botol stok

10. Botol kultur

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain.

1. Makronutrien

2. Iron

3. Mikronutrien

4. Vitamin

5. Zat pengatur tumbuh

6. Myo-Inositol

7. Sukrosa

8. Agar

9. Kertas pH indikator

10. Aquades

11. Alkohol 70%

12. HCl

13. NaOH

F. Langkah Kerja

1. Pembuatan Larutan Stok

2. Pembuatan Medium

*dilakukan 2x akan tetapi larutan kedua tanpa norit

Menimbang Makronutrien 5x (mg/250 ml) stok A yg terdiri dari: NH

4

NO

3

8250 mg, KNO

3

9500 mg, MgSO

4

7H

2

O 1850 mg, KH

2

PO

4

850 mg kemudian dilarutkan dalam 250 ml aquades

Membuat larutan stok B yaitu CaCl

2

2H2O 2200 mg dilarutkan dal HCl sedikit kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml

Membuat larutasn stok C (5x mg/250ml) yaitu N

2

EDTA 18,65 mg dan F

2

SO

4

7H

2

O 139 mg kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml

Membuat larutan D mikronutrien (10x mg/250ml) yaitu MnSO

4

H

2

O 223 mg, ZnSO

4

4H

2

O 86 mg, H

3

BO

3

62 mg, KI 8,3 mg, NaMoO

4

2H

2

O 2,5 mg CuSO

4

5H

2

O 0,25 mg, CaCl

2

6H

2

O 0,25 mg kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml.

Membuat larutan E (vitamin 100 ppm mg/100ml) Nicotinic acid 5ml, Pyridoxine-HCl 5ml

Membuat larutan F-ZPT (5x dalam 250 ml) yaitu myo-inositol 5mg dalam 250ml aqyades

Mencampurkan larutan stok A, B, C, D, Vitamin, dan ZPT dengan gula 30 g ke dalam

Menambahkan aquades hingga 250 ml ke dalam erlenmeyer

dimasukkan ke dalam beaker glass 250 ml daiduk dan di cek pHnya menggunakan kertas pH indikator universal khusus. Jika < 5,7 tambahkan NaOH+

, jika > 5,7 tambahkan HCl kemudian tambahkan norit 2gr dan agar 7gr

Panaskan di atas kompor yang dialasi kassa dan tuangkan dalam botol kultur yang telah disterilisasi 1/5 bagian dengan cepat sebelum memadat

sterilisasi dengan autoiklaf +/- 1 jam dan simpan di tempat yang steril

G. Analisis Data

Pada praktikum kali ini membuat medium. Proses membuat medium ada 2 tahapan

yaitu membuat larutan stok dan membuat medium disertai sterilisasi. Proses pembuatan

larutan stok terlebih dahulu dilakukan penghitungan untuk menimbang bahan dan berapa

kali harus memipet. Pembuatan stok ada berbagai macam. Ada stok A,B, C, D, E, dan F.

Stok A adalaha larutan makronutrien 5x (mg/liter). Cara penghitungan larutan stok A

adalah sebagai berikut.

• NH4NO3 = 1650 × 5 = 8250 mg,

• KNO3 =1900 × 5 = 9500 mg

• MgSO47H2O = 370 × 5 =1850 mg,

• KH2PO4 = 170 × 5 =850 mg

Cara penghitungan larutan stok B 5x (mg/250ml)adalah sebagai berikut.

• CaCl2 2H2O = 440×5 = 2200 mg

dilarutkan dal HCl sedikit kemudian ditambahkan aquades hingga 250 ml

Larutan Stok C adalahIRON 5x (mg/250 ml). Cara penghitungan larutan stok C adalah

sebagai berikut.

• N2EDTA = 37,3×5 =18,65 mg

• F2SO47H2O = 27,8×5 =139 mg

Larutan Stok D adalah Mikronutrien 10x (mg/250ml). Cara penghitungan larutan stok D

adalah sebagai berikut.

• MnSO4H2O = 22,3 ×10 = 223 mg,

• ZnSO44H2O = 8,6 ×10 = 86 mg,

• H3BO3 = 6,2 ×10 = 62 mg,

• KI = 0,83×10 = 8,3 mg,

• NaMoO42H2O = 0,25×10 = 2,5 mg

• CuSO45H2O = 0,025×10 = 0,25 mg,

• CaCl26H2O = 0,025×10 = 0,25 mg

Larutan Stok E adalah Vitamin 5x(100 ppm mg/100ml). Vitamin yang dihitung hanya

Nicotinic acid dan pyridoxine-HCl. Cara penghitungan larutan stok E adalah sebagai

berikut.

Ditambahkanaquades dan dilarutkan sampai 250 ml

ditambahkan aquades dan dilarutkan sampai 250 ml

ditambahkan aquades dan dilarutkan sampai 250 ml

• Nicotinic acid

Vp = Ve× Ke

Kp

= 1000× 0,5100 ppm

= 5ml

• Pyridoxine-HCl 5ml dalam 250 ml

Vp = Ve× Ke

Kp

= 1000× 0,5100 ppm

= 5ml

Larutan Stok F adalah ZPT 5x(mg/250 ml). ZPT yang dihitung hanya Myo-Cara

penghitungan larutan stok F adalah sebagai berikut.

500 mg ditambahkan 250 ml aquades

= 250/5 gr= 5x

• Myo-inositol yang dipipet Vp = Ve× Ke

Kp

= 1000× 0,5100 ppm

= 5ml

Setelah semua larutan stok dismpan di dalam lemari es, larutan stok siap untuk

dicampukan dengan sukrosa, agar dan aquades. Mula-mula gula dilarutkan di dalam

erlenmeyer dengan aquades, kemudian dimasukkan larutan stok sesuai label dan

ditambahkan aquades hingga 1 liter. Tabung dikocok agar larutan tercampur rata

kemudian dituangkan ke dalam beaker glass dan di cek pH menggunakan kertas indikator

universal khusus. Jika < 5,7 tambahkan NaOH+, jika > 5,7 tambahkan HCl kemudian

tambahkan norit 2gr dan agar 7gr. Larutan dipanaskan di atas kompor yang dialasi kassa

dan ditunggu hinga mendidih. Larutan tersebut dituangkan pada botol kurtul steril +/- 1/5

bagian. Proses ini harus dilakukan dengan cepat agar larutan tidak memadat. Setelah ituu

botol kultur berisi medium disterilisasi menggunakan autoklas 1 jam. Setelah itu botol

dikeluarkan dan digoyang agar larutan tercampur rata. Kemudian dismpan di lemari

medium yang steril.

H. Pembahasan

Media merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam proses perbanyakan

tanaman dengan teknik kultur secara in vitro. Karenanya dalam proses pembuatan media

diperlukan cara yang tepat dan steril serta ukuran tertentu terhadap berbagai komponen

yang akan dicampurkan sebagai media kultur. Hal ini sesuai dengan pernyataan Rahardja

(2003) bahwa untuk membuat media dengan komposisi tertentu diperlukan penimbangan

dan penakaran bahan secara tepat karena ketidak tepatan ukuran dapat menyebabkan

terjadinya proses yang tidak dikehendaki.

Pada prinsipnya medium diberikan kepada sel-sel tanaman in vitrodengan maksud

memberikan nutrisi sesuai dengan kebutuhan sel-sel tanaman tersebut secara alami sebagai

tanaman utuh yang tumbuh dialam. Tumbuhan dialam bebas bersifat autotrof, memerlukan

nutrient sederhana yang terdapat didalam tanah berupa garam-garam mineral dan air untuk

meneruskan siklus hidupnya. Hal ini dapat dipahami karena sebagian terbesar tubuh

tumbuhan tersusun atas unsur-unsur penyusun zat anorganik tersebut. Pada kultur in vitro

tumbuhan, untuk keperluan hidupnya sel-sel pada eksplan juga memerlukan nutrient yang

komposisinya jauh lebih komplek karena eksplan sedikit banyak telah kehilangan sifat

autotrofnya (Santoso, 2003).

Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalisasikan

pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang akan dikulturkan. Pemilihan medium

tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta perhitungan masing-

masing kegiatan praktikum yang diinginkan. Isi dan komposisi dari medium kultur

dirancang secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Dalam praktikum ini media yang

dibuat adalah media Murashige dan Skoog yang dikenal dengan medium MS. Menurut

Gunawan (1994) medium MS merupakan medium yang sangat banyak digunakan untuk

kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman, medium ini mengandung garam-garam

mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat.

Komposisi yang digunakan dalam praktikum pembuatan medium MS meliputi larutan stok

A, B, C, D, E, F, agar, dan gula dengan kadar tertentu. Setiap bahan yang dicampurkan

dalam medium MS tersebut memeliki manfa’at dan tujuan tertentu pada pertumbuhan dan

perkembangan tanaman kultur.

Larutan Stok A yang dicampurkan dalam meium MS adalah larutan makronutrien

yang terdiri dari NH4NO3 , KNO3, MgSO47H2O, dan KH2PO4. Larutan stok B adalah

larutan CaCl2 2H2O yang juga merupakan unsur makro yang dibutuhkan tanaman. Unsur

makro yang dibutuhkan tanaman kultur dalam prosesnya secara in vitro diberikan dalam

bentuk persenyawaan. Hal ini bersesuaian dengan pernyataan Santoso (2003) bahwa unsur

makro dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya diberikan dalam bentuk

persenyawaan. beberapa persenyawaan makronutrien yang umum digunakan pada medium

kultur jaringan, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; CaCl2. 2H2O;

MgSO2. 7H2O; KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O; Na2SO4; (NH4)2SO4;

NH4Cl; dan K2SO4.

Unsur makro yang dibutuhkan oleh tanaman diantaranya meliputi; Nitrogen, Fosfor,

Kalium, Sulfur, Calsium, dan magnesium. Nitrogen diberikan dalam bentuk persenyawaan

yang bermacam-macam, antara lain: KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3;

NH4H2PO4; (NH4)2SO4; NH4Cl. Kebutuhan N terbesar adalah untuk menyusun asam-

asam nukleat, protein, sebagai koenzym atau persenyawaan lain yang mengandung N

seperti klorofil, alkaloid, derivat purin dan pirimidin dan beberapa hormon endogen.

Medium Murashige dan Skoog (MS) menyediakan nitrogen dalam bentuk garam

NH4NO3, ini merupakan strategi yang baik dan mempunyai keuntungan ganda, karena

selain sumber N nya lengkap juga dalam bentuk garam effeknya terhadap penurunan pH

medium berkurang (George dan Sherrington, 1984).

Fosfor diberikan pada medium kultur jaringan dalam bentuk persenyawaan KH2PO4

atau K2HPO4; NH4H2PO4; NaH2 PO4. Dalam praktikum ini senyawa yang ditambahkan

dalam bentuk KH2PO4 . Unsur fosfor didalam sel diubah menjadi persenyawaan RNA dan

DNA yang sangat penting yang bertanggung jawab atas sifat-sifat keturunan. Unsur P juga

diperlukan sebagai aktifator enzim untuk memacu pertumbuhan pada jaringan

meristematik. Kelebihan unsur P dapat menghambat pertumbuhan eksplan, karena akan

terjadi persaingan penyerapan deng9an unsur lain seperti seng (Zn), besi (Fe) dan tembaga

(George dan Sherrington, 1984).

Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KNO3; KH2PO4 atau K2HPO4, KCl;

dan K2SO4. Unsur K sangat diperlukan untuk memacu pembelahan sel, sintesa

karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta untuk mereduksi nitrat. Kalium

berpengaruh pada hidratasi, menambah atau mengurangi hidratasi pada misel sehingga

mempengaruhi keluar masuknya nutrien ke dalam sel. Sulfur atau belerang diberikan pada

medium dalam bentuk MgSO4. 7H2O; (NH4)2SO4; K2SO4; FeSO4.7H2O;

MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; CuSO4. 5H2O. Sulfur ada didalam beberapa molekul

protein dan koenzym. Memacu perkembangan akar, juga berguna untuk ketahanan atau

proteksi tubuh tumbuhan (George, E. F., dan P. D. Sherrington, 1984).

Calcium diberikan pada medium dalam bentuk Ca(NO3). 4H2O; CaCl2.2H2O; Ca3

(PO4)2. Dalam praktikum ini calcium dibuat larutan stok B dengan persenyawaan yang

digunakan berupa CaCl2 2H2O. Calcium mempengaruhi hidratasi, permeabilitas,

penyerapan nutrient, dan mempengaruhi tingginya pH. Magnesium terutama diberikan

pada medium dalam bentuk MgSO47H2O. Magnesium diperlukan sebagai elemen utama

dalam pembentukan klorofil, berperan penting sebagai aktivator ensim terutama dalam

proses fosforilasi dan sintesis protein dengan cara membentuk komplek enzim-substrat.

Selain unsur makro yang berupa larutan A, dalam medium juga ditambahkan larutan

stok C yang merupakan IRON dengan persenyawaan N2EDTA dan F2SO47H2O. Stok D

dalam medium merupakan mikronutrien yang terdiri dari persenyawaan MnSO4H2O,

ZnSO44H2O, H3BO3 (Boric acid), KI, NaMoO42H2O (sodium molybdat) , CuSO45H2O

(Cupric sulfate), dan CaCl26H2O. Unsur hara mikro adalah unsur yang diperlukan dalam

jumlah sedikit. Unsur hara mikro yang dibutuhkan tanaman diantaranya meliputi; Boron

(B),Molybdenum (Mo), Manganase (Mn), Zincum (Zn), Cuprum (Cu), dan Chlorine (Cl).

Boron diberikan pada medium kultur sebagai asam borak (boric acid, H3BO3) berperan

dalam translokasi karbohidrat, juga terlibat dalam diferensiasi seluler dan perkembangan.

Molybdenum diberikan pada medium sebagai sodium molybdat (Na2MoO4. 2H2O)

berpartisipasi pada konfersi nitrogen ke ammonia dan fiksasi nitrogen, ikut dalam

metabolisme protein, sintesis asam askorbat, dan kofaktor enzim. Manganese merupakan

elemen esensial yang terdapat pada membran kloroplas, berperan sebagai aktifator enzim

serta sebagai bahan pembentuk klorofil, metabolisme protein, dan pembentukan vitamin C

Santoso (2003). Zincum berperan sebagai aktifator ensim, penyusun khlorofil, pemacu

pembentukan zat pengatur tumbuh terutama IAA dan pada medium diberikan dalam

bentuk Zincum sulfate (ZnSO4). Cuprum merupakan bagian dari enzim, Cu bereaksi

menjadi komponen phenolase, lactase dan askorbat oksidase. Ikut ambil bagian dalam

proses fotosintesis dan reduksi nitrit. Chlorine sebagai ion berpengaruh terhadap aktifitas

enzim, dan memacu proses fotosintesis (George, E. F., dan P. D. Sherrington. 1984).

Selain unsur garam organik yang meliputi unsur makro dan mikro tersebut juga

ditambahkan zat organik pada medium. Zat-zat organik adalah persenyawaan yang

mengandung karbon, ditambahkan pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-

Inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat pengatur tumbuh. Dalam praktikum ini

vitamin diberikan dalam bentuk larutan stok E yang meliputi Nicotinic acid dan

pyridoxine-HCl. Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,

diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor

dari reaksi-reaksi enzimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif. Nicotinic acid

(niacin) yang digunakan dalam praktikum ini penting dalam reaksi-reaksi enzimatis

disamping peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid (George, E. F., dan P. D.

Sherrington. 1984). Zat pengatur tumbuh (ZPT) dalam medium yang dibuat ini diberikan

dalam bentuk stok F. Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium

bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh dikelompokan

dalam beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid, dan Ethylene. Myo-

Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan

jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik penting yang

berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan perantara pada perubahan

glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prazat untuk pektin dan penyusun dinding

sel (Abidin, 1994).

Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan

asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber karbon dan enersi. Selain

sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga

keseimbangan tekanan osmotik potensial didalam medium. Gula pada umumnya

diberikan pada medium kultur berupa sukrosa atau komponen-komponennya seperti

monosakarida glukosa atau fruktosa (Widyastuti, 2002). Karena medium yang dibuat

merupakan medium padat sehingga dalam praktikum ini ditambahkan agar.

I. Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum pembuatan media adalah; Media

merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam proses teknik kultur secara in

vitro sehingga dalam proses pembuatan media diperlukan cara yang tepat dan steril serta

ukuran tertentu terhadap berbagai komponen yang akan dicampurkan sebagai media

kultur, komposisi yang digunakan dalam pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS)

dalam praktikum ini meliputi larutan stok A, B, C, D, E, F, agar, dan gula dengan kadar

yang telah ditentukan.

J. Daftar Rujukan

Abidin, Z. 1994. Dasar-Dasar Pengetahuan Tentang Zat Pengatur Tumbuh. Angkasa. Bandung.

George, E. F., dan P. D. Sherrington. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Limited. England.

George, E. F., Hall, M. A., dan Klerk, G. D. 2008. Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. Netherland: Springer.

Gunawan, LW. 1994. Teknik kultur jaringan tumbuhan. PAU. Bioteknologi IPB. Bogor.

Karjadi, A. K. dan Buchory, A. 2007. Pengaruh NAA dan BAP tehadap Pertumbuhan Jaringan Meristem Bawang Putih pada Media B5. Jurnal Hortikultura. 17 (3): 217-223.

Margono, H. 2001. Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.

Margono, H. dan Balqis. 2003. Panduan Belajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.

Rahardja, P. C., dan Wahyu, W. 2003. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman. Agromedia Pustaka. Jakarta.

Santoso, U., dan Fatimah, N. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.

Widyastuti, N. 2002. Inovasi Memperbanyak Bibit Tanaman. (online) www.sinarharapan.co.id/berita/0202/13/ipt02.html. Diakses tanggal 14 Februari 2015