DNA

Nurul Anisha Hakim131501128

Kelas 3A

Dosen : Prof. Dra. Siti Morin Sinaga., Msc.,Apt

I.PENDAHULUAN • Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida,

yaitu polimer linier yang tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui proses replikasi. Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukleat (ribonucleic acid/RNA). (Marks Dawn,et al., 2000).

Deoxyribonucleic Acid (DNA)

DNA merupakan materi yang membentukkromosom-kromosom dan juga merupakaninformasi genetik yang tersimpan dalam tubuhmakhluk hidup.

Instruksi-instruksi genetika ini berperanpenting dalam pertumbuhan, perkembangan,dan fungsi organisme dan virus

DNA hanya dapat ditemukan di dalam nukleus

Sejarah

DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwan Swiss

Friedrich Miescher di Tubingen, Jerman, yang menamainya nuclein berdasarkan

lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap peranan

DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan ditemukannya

postulat genetika Mendel. DNA dan protein dianggap dua molekul yang paling

memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori tersebut.

DNA Struktur

• Outside / Backbones Made Of:–Alternating

Phosphates and Sugars

• Inside / Steps Made of: –Nitrogenous Bases

James Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun 1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua untaian nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut tersusun secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut).

DNA Nukleotida

• Nukleotida merupakan monomer dari DNA.

• Structure:

– Phosphate

– Deoxyribose Sugar

– Nitrogenous Base

Basa Nitrogen

4 Types of Bases:

– A = Adenine

– T = Thymine

– G = Guanine

– C = Cytosine

Perbedaan DNA dan RNA

Prinsip Kerja DNA Fingerprint

Sebuah sistem fingerprint scanner memiliki dua pekerjaan, yakni mengambil gambar sidik jari Anda, dan memutuskan apakah pola alur sidik jari dari gambar yang diambil sama dengan pola alur sidik jari yang ada di database. Ada beberapa cara untuk mengambil gambar sidik jari seseorang, namun salah satu metode yang paling banyak digunakan saat ini adalah optical scanning.

Inti dari scanner optical adalah charge coupled device (CCD), sistem sensor cahaya yang sama digunakan pada kamera digital dan camcorder. CCD merupakan sebuah larik sederhana dari diode peka cahaya yang disebut photosite, yang menghasilkan sinyal elektrik yang merespon foton cahaya. Setiap photosite merekam sebuah pixel, titik kecil yang merepresentasikan cahaya dan membenturnya. Pixel-pixel ini membentuk pola terang dan gelap dari sebuah gambar hasil scan sidik jari seseorang.

• Tahap selanjutnya dalam pencocokan adalah memasukkan sampel DNA ke mesin PCR. Langkah dasar penyusunan DNA fingerprint dengan PCR yaitu dengan amplifikasi (pembesaran) sebuah set potongan DNA yang urutannya belum diketahui. Prosedur ini dimulai dengan mencampur sebuah primer amplifikasi dengan sampel genomik DNA. Satu nanogram DNA sudah cukup untuk membuat suatu plate reaksi. Jumlah tersebut didapat dari isolasi satu tetes darah kering, dari sel-sel yang melekat pada pangkal rambut atau dari jaringan apa saja yang ditemukan di TKP. Kemudian primer amplifikasi tersebut digunakan untuk menjiplak pada sampel DNA yang mempunyai urutan basa yang cocok. Hasil akhirnya berupa copy urutan DNA hasil amplifikasi dengan DNA sampel. Setelah itu, copy tersebut akan di karakterisasi dengan elektroforesis untuk melihat pola pita DNA nya. Karena setiap urutan DNA pada semua orang berbeda, maka jumlah dan lokasi pita DNA setiap individu juga berbeda. Pola pita inilah yang disebut dengan DNA fingerprint.

Prinsip metode PCR (Poly chain Reaction)

• PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA (PENGGANDAAN DNA )secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu darikeseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasisuhu yang mendekati suhu didih air, jadi diperlukan enzim polimeraseyang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Padaproses PCR, enzimpolimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermusaquaticus (Taq)yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90oC.

• Berikut adalah tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCRyaitu :

• Denaturasi

Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oCyangmnyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNAtunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baruyang akan dibuat.

• Penempelan (Annealing)

Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA barujika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjangsekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA targetyang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primerdapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendahsekitar 550C selama 30-60 detik.

• Pemanjangan (Ektension)

• Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimeraseakan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabunganantara primer, DNA cetakan dan nukleotida.

• Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yangbaru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelandan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulanganproses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secaraeksponensial (Marks Dawn, et al., 2000).

Komponen-Komponen untuk Reaksi PCR

• DNA cetakan / DNA target

Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA

• Primer

Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu : target yang dituju.

1. Panjang primer : 15-30 pb

2. Kandungan GC sekitar 50%

3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda

4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari

5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin

• DNA Polimerase

Merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan dan umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air.

• Buffer / Dapar

Buffer atau dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase.

• dNTPS

dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan dalam perpanjangan primer melalui pembentukkan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target (Innis M. and Gelfand D. in White Thomas, 1990).

Replikasi DNA

❶ Inisiasi

Pelepasan untai DNA• Sebuah enzim yang disebut helikase direkrut ke lokasi untuk unwinding

(proses penguraian/seperti membuka resleting) heliks dalam alur tunggal.

• Helikase melepaskan ikatan hidrogen antara pasangan basa, dengan cara yang tergantung energi. Titik ini atau wilayah DNA yang sekarang dikenal sebagai garpu replikasi (Garpu replikasi atau cabang replikasi adalah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi). Setelah heliks yang terbuka, protein yang disebut untai tunggal mengikat protein (SSB) mengikat daerah terbuka dan mencegah mereka untuk menempel kembali. Proses replikasi sehingga dimulai, dan garpu replikasi dilanjutkan dalam dua arah yang berlawanan sepanjang molekul DNA.

❷ Sintesis Primer• Sintesis DNA Primer

Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakanuntai yang ada sebagai template yang dibawa oleh enzimyang dikenal sebagai DNA polimerase.

DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secaraindependen, dan membutuhkan 3′ gugus hidroksil untukmemulai penambahan nukleotida komplementer. Ini mensintesisbentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada. segmen pendekdisebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida.

Hal ini memberikan DNA polimerase platform yang diperlukanuntuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah primerterbentuk pada kedua untai, DNA polimerase dapatmemperpanjang primer ini menjadi untai DNA baru.

❸ Sintesis leading strand

DNA polimerase dapat menambahkannukleotida baru hanya untuk ujung 3′ dari untaiyang ada, dan karenanya dapat mensintesis DNAdalam arah 5′ → 3′ saja. Tapi untai DNA berjalandi arah yang berlawanan, dan karenanya sintesisDNA pada satu untai dapat terjadi terusmenerus. Hal ini dikenal sebagai untaianpengawal (leading strand).

❹ Sintesis lagging Strand (untai tertinggal)

Pada untai berlawanan, DNA disintesis secara terputus denganmenghasilkan serangkaian fragmen kecil dari DNA baru dalam arah 5‘→ 3′. Fragmen ini disebut fragmen Okazaki, yang kemudian bergabunguntuk membentuk sebuah rantai terus menerus nukleotida. Untai inidikenal sebagai lagging Strand (untai tertinggal) sejak proses sintesisDNA pada untai ini hasil pada tingkat yang lebih rendah.

❺ Penghapusan Primer

Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untaibaru terbentuk harus digantikan oleh DNA. Kegiatan ini dilakukan olehenzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini khusus menghilangkan primerRNA melalui ‘5→ 3′ aktivitas eksonuklease nya, dan menggantikanmereka dengan deoksiribonukleotida baru dengan 5 ‘→ 3′ aktivitaspolimerase DNA.

❻ Ligasi

Setelah penghapusan primer selesai untai tertinggal masihmengandung celah antara fragmen Okazaki berdekatan. Enzimligase mengidentifikasi dan menyumbat celah tersebut denganmenciptakan ikatan fosfodiester antara 5 ‘fosfat dan 3′ gugushidroksil fragmen yang berdekatan.

❼ Terminasi (pemutusan)

Replikasi ini terhenti di lokasi terminasi khusus yang terdiridari urutan nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi olehprotein khusus yang disebut tus yang mengikat ke situs tersebut,sehingga secara fisik menghalangi jalur helikase. Ketika helikasebertemu protein tus itu jatuh bersama dengan untai tunggalprotein pengikat terdekat.

SINTESIS PROTEIN

• Dalam tahap-tahap sintesis protein akan dibahas bagaimanaDNA dan RNA melaksanakan proses dalam pewarisan sifatkepada keturunannya dengan melakukan proses sintesisprotein, yaitu proses penyusunan senyawa protein denganmembentuk rangkaian rantai polipeptida.

• Tahap-tahap sintesis protein ini terjadi di dalam ribosom danpengaturan sintesis protein dilakukan oleh gen (DNA) didalam inti. Gen, dalam hal ini DNA ketika menjalankanfungsinya, yaitu menyusun protein sangat dipengaruhi olehsusunan sel serta gen-gen lain dalam lingkungannya. Kegiatansel diatur oleh berbagai enzim, yaitu senyawa protein yangbekerjanya sangat spesifik.

• Tahap-tahap sintesis protein terjadi melalui dua tahap, yaknitranskripsi dan translasi.

Transkripsi

• Proses ini berlangsung di dalam inti sel. Transkripsimerupakan proses sintesis langsung RNA dari DNA. Pada saatinti sel memerintahkan perlunya sintesis protein, informasiDNA dialihkan melalui RNA pembawa pesan yang disebut RNAmessenger (mRNA). mRNA berisikan salinan langsungpasangan basa dari DNA. Tahap inilah yang dinamakan dengantranskripsi.

• Tahap inisiasi transkripsi dimulai dengan pengenalan daerahgen di DNA oleh enzim RNA polimerase. Daerah ini dinamakandengan promoter, yakni tempat dimulainya sintesis pasanganDNA oleh mRNA.

• RNA polimerase akan membuka ikatan double helix padabagian gen yang dikenali dan kemudian akan menyalin urutanbasa yang ada pada DNA

• Proses transkripsi diakhiri jika gen di daerah rantai templatetelah selesai dibaca (terdapat kodon stop). DNA memilikimekanisme agar RNA polimerase dapat mengenali akhir darigen dengan kode basa tertentu, daerah ini dikenal dengannama terminator. Proses akhir dari transkripsi ini dinamakandengan terminasi. Setelah itu, rantai mRNA akan keluar dariDNA menuju ribosom di sitoplasma.

• 2. Translasi• Tahap sintesis protein berikutnya adalah translasi. mRNA mengandung

urutan basa yang akan diterjemahkan menjadi protein (asam amino). Kode genetik, yang dibawa di dalamnya (kodon) dibaca dalam urutan tiga basa (triplet) menjadi protein. Proses penerjemahan kodon menjadi protein atau yang disebut dengan translasi.

• Ribosom, sebagai tempat pembuatan protein terdiri atas dua bagian yang disebut subunit kecil dan subunit besar. Secara garis besar, translasi dibagi menjadi tiga tahap, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi, mRNA akan menempel pada subunit kecil ribosom. Subunit kecil ini akan mengenali kode awal genetik AUG dari mRNA yang disebut sebagai start kodon. Subunit besar ribosom kemudian akan bergabung dengan subunit kecil membentuk kompleks ribosom.

• Proses penerjemahan ini dibantu oleh tRNA yang membawa pasangan kodon dari mRNA. Pasangan basa tRNA di ribosom ini dinamakan sebagai antikodon. tRNA akan datang membawakan pasangan basa yang sesuai dengan kodon dari mRNA.

• Tahapan selanjutnya adalah elongasi dari pembacaan kodonoleh tRNA sehingga terbentuk rantai polipeptida. Elongasiakan berhenti pada tahap pembacaan urutan basa spesifikyang memerintahkan proses translasi dihentikan (tahapterminasi). Urutan ini biasanya terdiri atas UAA, UAG, danUGA yang dikenal dengan nama stop kodon.

Mutasi DNA

Mutasi adalah suatu perubahan yang terjadi pada bahangenetik yang menyebabkan perubahan ekspresinya. Perubahanbahan genetik dapat terjadi pada tingkat pasangan basa,tingkatsatu ruas DNA, bahkan pada tingkat kromosom. Peristiwaterjadinya mutasi disebut mutagenesis. Sedangkan, individu yangmengalami mutasi sehingga menghasilkan fenotip baru disebutmutan. Faktor yang menyebabkan mutasi disebut mutagen.

Mutasi Gen (Mutasi Titik)Mutasi gen atau mutasi titik adalah mutasi yang terjadi karena

perubahan pada satu pasang basa DNA suatu gen. PerubahanDNA menyebabkan perubahan kodon-kodon RNAd, yangakhirnya menyebabkan perubahan asam amino tertentu padaprotein yang dibentuk.

• Subtitusi pasangan basa

Subtitusi pasangan basa ialah pergantian satu pasangnukleotida oleh pasangan nukleotida lainnya Subtitusi pasanganbasa ini kadang-kadang tidak menyebabkan perubahan protein,karena adanya kodon sinonim (kodon yang terdiri atas tigaurutan basa yang berbeda, tetapi menghasilkan asam aminoyang sama).

Misalnya, basa nitrogen pada DNA adalah CGC menjadi CGA sehingga terjadi perubahan kodon pada RNA-d dari GCG menjadi GCU. Sedangkan, asam amino yang dipanggil sama, yaitu arginin.

Subtitusi pasangan basa ada dua macam, yaitu transisi dan tranversi.

• *Transisi adalah penggantian satu basa purin oleh basa purin yang lain, atau penggantian basa pirimidin menjadi basa pirimidin yang lain.

• *Tranversi adalah penggantian basa purin oleh basa pirimidin, atau basa pirimidin oleh basa

• Penambahan atau pengurangan pasangan basa

Penambahan atau pengurangan basa pada DNA dapatmenyebabkan perubahan sederetan kodon RNA-d yangterdapat di belakang titik perubahan tersebut, berartijuga akan terjadi perubahan asam amino yang disandikanmelalui RNA-d tersebut. Akibat lain dari penambahanatau pengurangan basa adalah terjadinya pergeserankodon akhir pada RNA-d. Pergeseran kodon akhirmenyebabkan rantai polipeptida mutan menjadi lebihpanjang atau lebih pendek. Mutasi ini disebut juga mutasiubah rangka karena menyebabkan perubahan ukuranpada DNA maupun polipeptida.

Mutasi ubah rangka ini dapat dibedakan menjadi dua,yaitu penambahan basa (adisi) dan pengurangan basa(delesi).

DelesiDuplikasi

Identifikasi kasus kriminal

STUDI MUTASI TITIK A3243G DNA MITOKONDRIA PENYEBABMATERNALLY INHERITED DIABETES AND DEAFNESS

• Mutasi pada posisi 3243 telah diteliti sebagai mutasi kausal pada diabetes turunan maternal dengan ketulian atau MIDD

• Database MITOMAP 2004 menyebutkan penyakit mithocondrial myopathy, encephalopathy,lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS) juga termasuk satu dari subkelompok klinik mitochondrial encephalopathy yang utama dan disebabkan oleh mutasi tunggal gen tRNALeu yang bertanggung jawab untuk translasi UUR (R = A atau G) kodon leusin (tRNALeu(UUR))

• Pasien yang memiliki mutasi mtDNA A3243G cenderung nonobesitas, nonketoasidosis, menyerang usia dewasa, terutama jika muncul gangguan pendengaran, atau jika terdapat riwayat keluarga garis keturunan seibu yang diabetes dengan gangguan pendengaran(Sriwidodo,2008).

• Penderita diabetes dengan anggota keluarga yang masih sehat, memiliki kecenderungan

• risiko tinggi mendapatkan penyakit diabetes, dan akan sangat menguntungkan apabila dapat didiagnosis dan diintervensi secepat mungkin penderita MIDD memiliki kecenderungan mengalami peningkatan asam laktat, sehingga dihindari penggunaan antidiabetik oral golongan metformin.

Teknologi DNA Rekombinan

• Kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu pengetahuan maupun dibidang terapan.

1. Therapi gen untuk penyakit

• Dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)

• SelBonemarrowmengandung stem sel yang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dan sistem imun

BidangPertanian:

• BakteriIce-(ice minus): bakteriyang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak membeku dimusim dingin. Telah diperdagangkan dengan merek FrostbanR

Organisme transgenik

• Organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.

Contoh:• Tanaman kapas-Bt dan tomat-

Bt tahan terhadap serangan hama karena menghasilka ntoksin yang dapat membunuh hamanya.

• Toksin pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh gen yang berasal dar ibakteri Bacillus thuringiensis (Bt = Bacillus thuringiensis)

• Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik

Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan padatanaman: Bakteri Agrobacteriumtumefaciens

Untuk menyisipkan gen kedalam genom tanaman.

• Prinsip: Agrobacteriumtumefaciens strain liar (galur alami) memiliki plasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandung gen penyebab tumor.

• Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacteriumtumefaciens menyisipkan T-DNA kedalam kromosom sel tanaman sehingga sel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor.

• Gen yang diinginkan dimasukkan kedalam seltanaman dengan cara menitipkannya (menyisipkan)padaT-DNA.

• Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksisel tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidakpatogen