dna tanaman jarak
TRANSCRIPT
PENGEMBANGAN METODE ISOLASI DNA GENOM PADA TANAMAN JARAK PAGAR (Jatropha curcas)
AbstractPenanda molekuler telah digunakan secara ekstensif untuk mempelajari hubungan genetik
jumlah tanaman. Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk memperoleh mencetak DNA jari
adalah RAPD (random RAPD) teknik, teknik molekuler didasarkan pada teknologi PCR. Kualitas
produk amplifikasi tergantung pada beberapa faktor seperti konsentrasi MgCl2, primer, kondisi
PCR dan kualitas DNA. Dalam penelitian ini, percobaan dilakukan untuk mengetahui teknik
isolasi DNA yang tepat untuk tiga aksesi Jatropha curcas (Karangtengah, Lamongan dan NTB).
Tiga teknik isolasi DNA telah diuji dan dua dari mereka mampu menghasilkan kualitas yang baik
DNA genom. Hasil itu menunjukkan bahwa teknik ini dapat digunakan untuk isolasi DNA genom
biji jarak pada analisis molekuler.
Key words : Jatropha curcas, DNA isolation
I. Pendahuluan
Pemanfaatan minyak jarak pagar (Jatropha curcas L) sebagai bahan biodiesel merupakan
salah saru alternatif untuk mengantisipasi meningkatnya permintaan bahan bakar. Minyak jarak
pagar selain merupakan sumber minyak terbarukan (reneweble fuels) juga termasuk non edible
oil sehingga tidak bersaing dengan kebutuhan konsumsi manusia seperti pada minyak kelapa
sawit, minyak jagung dsb. Secara agronomis tanaman jarak pagar cukup sesuai untuk
dibudidayakan dengan kondisi agroklimat di Indonesia, bahkan pada kondisi kering dan pada
lahan marginal. Akan tetapi ada berbagai permasalahan yang dihadapi antara lain belum adanya
varietas unggul dan masih terbatasnya pendekatan molekuler dalam pemuliaan tanaman pagar.
Tanaman jarak pagar termasuk dalam famili Euphorbiacae, di mana genus Jatropha
memiliki 175 spesies. Dari jumlah tersebut lima spesies ada di Indonesia, yaitu Jatropha curcas L
dan Jatropha gossypiifolia yang sudah digunakan sebagai tanaman obat. sedangkan Jatropha
integerrima Jacq, Jatropha multifida dan Jatropha podagrica Hook digunakan sebagai tanaman
hias. Dalam perkembangan dewasa ini, species Jatropha curcas L. menarik minat karena sifat
minyaknya yang dapat digunakan untuk substitusi minyak diesel dan dapat dimanfaatkan sebagai
bahan biodiesel.
Dalam bidang pemuliaan tanaman jarak pagar hingga saat ini masih terbatas pada seleksi
dan uji lapang dengan menggunakan karakter morfologi dalam upaya mendeskripsikan tanaman.
Dalam hal ini, kebanyakan karakter yang nampak merupakan interaksi genetik dan kondisi
lingkungan. Oleh karen itu, diperlukan adanya upaya analisis molekuler pada tanaman jarak
pagar. Teknik biologi molekuler telah memberikan peluang untuk mengembangkan dan
mengidentifikasi peta genetik dari suatu kultivar tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan
menggunakan penanda DNA telah berhasil membentuk penanda molekuler yang mampu dalam
mendeteksi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi keragaman dan evolusi pada tingkat genetik
(Hoon-Lim et al. 1999). Beberapa teknik penanda DNA tersebut adalah Restriction Fragment
Length Polymorphism, Amplified Fragment Length Polymorphism dan Random Amplified
polymorphic DNA.
Penggunaan penanda RAPD didasarkan pada pertimbangan antara lain: informasi
susunan nukleotida dalam DNA tidak perlu diketahui terlebih dahulu, relatif sederhana dan
mudah preparasinya, hanya perlu sejumlah kecil DNA dan memberikan hasil lebih cepat
dibandingkan beberapa penanda molekuler lain. Analisis sidik jari DNA tanaman jarak
didasarkan pada jumlah, frekuensi dan distribusi alel-alel DNA berdasarkan penanda RAPD yang
telah diperoleh. beberapa hal diatas mendasari pemikiran diperlukan adanya upaya analisis
molekuler pada tanaman jarak pagar dengan menggunakan penanda RAPD.
Pemakaian teknik RAPD memiliki resolusi yang sebanding dengan RFLP dalam hal
analisis kekerabatan antar genotip (dos Santos et al. 1994) dan mampu menghasilkan jumlah
karakter yang tidak terbatas sehingga sangat membantu dalam analisis keragaman genetik
tanaman yang tidak diketahui latar belakang genomnya (Liu dan Furnier, 1993). Analisis RAPD
hanya memerlukan sejumlah kecil DNA sehingga sangat sesuai untuk species tanaman berkayu
(Rowland dan Levi 1994). RAPD memerlukan biaya lebih rendah dibandingkan biaya untuk uji
kekerabatan berdasarkan anaisis DNA yang lain. Metode RAPD menggunakan primer dengan
ukuran sepuluh basa sering digunakan untuk studi kekerabatan, identifikasi varietas (CIMMYT,
1998), pemetaan genetik, analisis struktur DNA organisme dan finggerprinting suatu individu
organisme. Teknik RAPD menggunakan primer acak maupun spesifik telah terbukti dapat
digunakan sebagai penanda molekuler untuk berbagai karakter agronomis penting. Pemakaian
marka molekuler RAPD banyak digunakan untuk menyusun kekerabatan beberapa individu
dalam spesies maupun kekerabatan antar spesies. Penggunaan kekerabatan ini dapat dijadikan
rujukan dalam pemuliaan persilangan untuk mendapatkan keragaman yang tinggi dari hasil suatu
persilangan (Maftuchah, 2001).
Dalam proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa
metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat.
Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida tersebut
akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Penambahan senyawa pereduksi sepertri
marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegar proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat
(Wilkins dan Smart, 1996). Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja
enzim Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA
yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase
(Fang et al., 1992 dalam Porebski et al, 1997) Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi
DNA genom tanaman yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses
amplifikasi PCR.
Dari hasil penelitian ini diharapkan akan diperoleh DNA genomik tanaman jarak pagar
dan metode isolasi DNA yang sesuai pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L) sebagai
materi dalam proses amplifikasi PCR.
2. Metode Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Molekuler Tanaman Pusat Pengembangan
Bioteknologi, Universitas Muhammadiyah Malang. Tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.)
yang dipergunakan berasal dari Kebun Koleksi Plasma Nutfah Jarak dari Balai Penelitian
Tanaman Tembakau dan Serat (BALITTAS) – Karangploso, Malang. Aksesi jarak pagar yang
dipergunakan dalam penelitian ini adalah Lamongan. Nusa Tenggara Barat dan Karang Tengah.
Isolasi DNA Genomik Tanaman Jarak (Jatropha curcas L)
DNA genom tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) diisolasi dari daun muda tanaman
jarak pagar. Prosedur ekstraksi DNA dari daun tanaman jarak pagar dilaksanakan berdasarkan
metode standar (Sambrook et al., 1989) dengan menggunakan bufer CTAB, metode Doyle and
Doyle (1990), serta metode Zheng et al (1995) dengan menggunakan bufer pengekstrak SDS.
Setelah DNA hasil isolasi dimurnikan, kemudian dilakukan analisis melalui running agarose gell
0,8 %.
A. Metode CTAB (Sambrook et al., 1989).
Pada proses isolasi dengan metode CTAB (Sambrook et al., 1989) dilakukan pembuatan
bufer lisis (yang terdiri atas 0,2 M Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl ; 2 %
CTAB) dan bufer ekstraksi (terdiri dari 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ;
dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian
daun digerus dengan bantuan nitrogen cair. Setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA
(campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl). Suspensi divortex sampai tercampur merata,
kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu 65o C. Setelah 1 jam ditambah 750 µl kloroform -
isoamil alkohol (24 : 1). Setelah homogen larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 5 menit, 40 C, lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian
ditambahkan larutan isopropanol dan divortex perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit,
12.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci menggunakan 500 µl
EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi 12.000 rpm, 3 menit dan supernatan dibuang. Sentrifugasi
dilakukan kembali dengan kecepatan 12.000 rpm, 1 menit, kemudian supernatan dibuang dengan
mikropipet. Pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan 50 µl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM
EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C.
B. Metode CTAB (Doyle and Doyle, 1990).
DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang dimasukkan
ke dalam tabung eppendorf dan digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke dalam tabung
ditambahkan 750 µl bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam
pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar,
campuran tersebut ditambahkan dengan 750 µl kloroform - isoamil alkohol ( 24 : 1 ). Campuran
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 40C. Lapisan atas
dimasukkan ke dalam tabung eppendorft lain yang mengandung isopropanol dan dicampur
merata. Setelah disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan
menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam
25 µl bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200
C.
C. Metode SDS (Zheng et al , 1995).
Pada pemakaian metode ekstraksi Zheng et al (1995), sebelum berlangsungnya proses
isolasi DNA dilakukan pembuatan bufer pengekstrak yang terdiri atas 25 mM EDTA (pH 7,5), 50
mM TrisHCl (pH 8), 300 mM NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan daun tanaman jarak pagar
dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian digerus dengan
menambahkan 400 ul buffer pengekstrak. Setelah cukup halus ditambahkan 100 ul buffer
pengekstrak. Setelah itu diambil 400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform.
Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian dan setelah homogen larutan disentrifus
dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan
dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 800 µl Etabol absilut. Larutan
disentrifugasi selama 3 menit, 13.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet
dicuci kembali dengan menggunakan 500 µl EtOH 70 %. Supernatan dibuang, kemudian endapan
dicuci kembali dengan etanol 70%, dan disentrifugasi 13.000 rpm, pada suhu 40C. Supernatan
dibuang kembali, dan pelet dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering, pelet
ditambah dengan 50 ul TE dan DNA disimpan pada suhu -200C.
Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut kemudian dielektroforesis pada 0,8%
gel agarosa pada kondisi 50V selama 30 menit. Deteksi dilakukan dengan menggunakan UV
transluminator dan dilakukan pemotretan gell.
3. Hasil dan Pembahasan
Salah satu keuntungan pemakaian analisis keragaman genetik tanaman dengan
menggunakan teknik molekuler yang memanfaatkan teknologi amplifikasi PCR adalah kuantitas
DNA yang diperlukan hanya sedikit. Disamping itu, dalam pelaksanaan teknik RAPD tingkat
kemurnian DNA yang dibutuhkan tidak perlu terlalu tinggi, atau dengan kata lain teknik
amplifikasi PCR relatif toleran terhadap tingkat kemurnian DNA. Walaupun demikian, dalam
suatu teknik isolasi DNA masih diperlukan suatu tahapan untuk meminimalkan senyawa-
senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisacharida dan metabolit
sekunder. Hal ini disebabkan keberadaan polisacharida dan metabolit sekunder dalam sel
tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat (Wilkins and Smarts, 1996). Dalam
penelitian ini, DNA genom tanaman jarak pagar diisolasi dari daun muda tanaman jarak.
1 2 3 4 5 6
Gambar 1. Hasil proses isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan bufer CTAB (Sambrook et al., 1989) : Karang Tengah (baris 1, 2), Lamongan (baris 3, 4), Lombok Barat (baris 5, 6)
Dalam tahap awal dilakukan isolasi DNA genomik tanaman jarak pagar dengan
menggunakan prosedur ekstraksi DNA yang menggunakan bufer pengekstrak CTAB
berdasarkan metode Sambrook et al. (1989). Bufer yang dipergunakan terdiri dari 0,2 M Tris-Cl
pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2M NaCl ; 2% CTAB ; 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ;
5 mM EDTA dan dH2O. Namun dengan penggunaan prosedur ekstraksi CTAB tersebut ternyata
belum dapat menghasilkan DNA genom yang optimal (Gambar 1). Dari hasil elektroforesis
terlihat bahwa kualitas DNA yang dihasilkan belum optimal, oleh karena itu proses isolasi
selanjutnya dicoba dengan menggunakan metode isolasi DNA genomik yang lain.
Pada proses ekstraksi DNA jarak pagar, setelah penambahan bufer pengekstrak CTAB
pada daun yang telah dihaluskan, terbentuk larytan yang sangat kental, yang meunjukkan
tingginya kandungan polisacharida. Selain polisacharida, kandungan senyawa fenolik jarak pagar
juga cukup tinggi, hal ini dapat dilihat dari cepatnya pencoklatan pada ujung daun yang dipotong.
Adanya polisacharida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan
dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan
menyebabkan polisacharida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat.
Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi sepertri
marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambak aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat
(Wilkins dan Smart, 1996). Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja
enzim Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA
yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase
(Fang et al., 1992 dalam Porebski et al, 1997).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar 2. Hasil proses isolasi DNA tanaman Jarak Pagar dengan menggunakan bufer CTAB (Doyle and Doyle, 1990) : Karang Tengah (baris 1, 2, 3), Lamongan (baris 4, 5, 6), Lombok Barat (baris 7, 8, 9)
Pada tahap selanjutnya diujikan prosedur isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan
menggunakan buffer pengekstrak CTAB berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990). DNA
genomik tanaman jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang ditambahkan
bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam pemanas air dan
setelah dingin hingga suhu kamar ditambah dengan kloroform - isoamil alkohol. Hari hasil
running elektroforesis gel agarose menunjukkan metode tersebut dapat menghasilkan DNA
genom jarak pagar Karangtengah, Lamongan dan NTB dengan kuantitas dan kualitas yang cukup
baik (Gambar 2).
Pada pemakaian prosedur isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan buffer
pengekstrak Sodium Dodecyl Sulfate (Zheng et.al., 1995) larutan buffer yang dipergunakan
terdiri atas 25 mM EDTA pH 7,5, 50 mM Tris HCl, pH 8 300 mM Na Cl, 1% Sodium Dodecyl
Sulfate dan dH2O. Dengan menggunakan teknik tersebut telah berhasil diperoleh DNA genom
tanaman jarak pagar aksesi Karang Tengah, Lamongan dan NTB dengan kualitas DNA yang
cukup baik (Gambar 3.).
1 2 3
Gambar 3. Hasil proses isolasi DNA tanaman jarak pagar dengan menggunakan bufer SDS (Zheng et.al., 1995) : Karang Tengah (baris 1), Lamongan (baris 2), Lombok Barat (baris 3).
Pada umumnya ekstraksi DNA tanaman dilaksanakan dengan menggunakan bufer
pengekstrak SDS (sodium dodecyl sulphate) dan CTAB (cetyltrimetilammonium bromide).
Perlakuan lisis sel dengan menggunakan detergen non ionik CTAB menghasilkan kuantitas DNA
yang cukup tinggi terutama dari jaringan segar, dengan jumlah DNA yang dihasilkan bervariasi
tergantung pada species dan kondisi awal material yang digunakan (Ausubet et al., 1994). Pada
tanaman dengan kandungan polisacharida dan metabolit sekunder tinggi perlu dilakukan
modifikasi pada saat ekstraksi DNA. Untuk menghilangkan polisacharida ekstraksi lisat dengan
menggunakan kloroform disarankan dibandingkan dengan kloroform/isoamil alkohol karena
lebihn efisien untuk mengisolasi asam nukleat (Ausubet et al., 1994). Secara umum hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa dengan pemakaian tiga metode isolasi DNA genom yang
diujikan maka dihasilkan dua metode yang mampu menghasilkan DNA genom jarak pagar
dengan kuantitas dan kualitas yang baik, yaitu metode Doyle and Doyle (1990) yang
menggunakan bufer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) dan metode Zheng et.al., (1995)
yang menggunakan bufer pengektrak SDS (sodium dodecyl sulphate)
4. Kesimpulan dan Saran
Dalam proses isolasi DNA genom tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa
metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat.
Penggunaan penanda RAPD didasarkan pada pertimbangan antara lain: informasi
susunan nukleotida dalam DNA tidak perlu diketahui terlebih dahulu, relatif sederhana dan
mudah preparasinya, hanya perlu sejumlah kecil DNA dan memberikan hasil lebih cepat
dibandingkan beberapa penanda molekuler lain.
Metode isolasi DNA berdasarkan metode Doyle and Doyle (1990) yang menggunakan
bufer CTAB (cetyltrimetilammonium bromide) dan metode Zheng et.al., (1995) yang
menggunakan bufer pengektrak SDS (sodium dodecyl sulphate) sesuai untuk dipergunakan dalam
isolasi DNA genom tanaman jarak pagar.
Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja enzim Adanya
polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA yang
menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase
Daftar Pustaka
Ausubel, F.M., Brent, R., Kongston, R.E., Moore, D.D., Saidman, J.G., Smith J.A., and Stuhl, K. 1994. Current protocols in molecular biology. New York. John Wiley and Sons. Inc.
CIMMYT, 1998. Molecular Marker Applications to Plant Breeding. In: Amboinet’s First Training Workshop, 9 November-4 Desember, El Batan, Mexico.76 p.
Correa, R. X.,Ricardo V. A., Fabio G. F. Cosme D. C., Maurilio A. M., dan Everaldo G. B., 1999. Genetic Distance in Soybean Based on RAPD Markers. (On line), http://www.scielo.br/scielo.php diakses 22 April 2004.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.
dos Santos JB, Nienhuis J, Skruch P, Tivang J and Slokum MK. 1994. Comparison of RAPD and RFLP genetic markers in determining genetic similarity among Brassica oleracea L. genotypes. Theor. Appl Genet. 87:909-915.
Hoon-Lim S, Peng Teng PC, Lee YH, and Goh CJ. 1999. RAPD analysis of some species in the genus vanda (orchidaceae). Annuals of Botany. 83:193-196.
Liu Z and Furnier GR. 1993. Comparison of allozyme, RFLP and RAPD markers for revealing genetic variation within and between Trembling Aspen and Bigtooth Aspen. Theor. Appl. Genet. 87:97-105.
Maftuchah. 2001. Strategi pemanfaatan penanda molekuler dalam perkembangan bidang hortikultura. Makalah Sarasehan Pemanfaatan Penanda Molekuler di Bidang Hortikultura. Perhorti Jatim – Deptan.
Porebski, S., Bailey, L.G., and Baum, B.R. 1997. Modification of CTAB DNA extractions protocol for plants cotaining high polysacharide and polyphenol components. Plant Molec Biol reporter 15: 8-15
Sambrook J., E.F. Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning : A laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA.
Zheng K, Huang N, Bennet P. and Khush GS. 1995. PCR-based marker assisted selection in rice breeding. IRRI news lett 2.
Wilkins, T.A. and Smart, L.B.. 1996 Isolation of RNA from Plant Tissue. Di dalam: Krieg, P.A. (ed). A Laboratory Guide to RNA. Isolation, Analysis and Synthesis. New York: Wiley – Liss.