RODRIGO ROCHA LATADO

TpicosIntroduo

Principais caractersticas

Sistemas de cultivo in vitro de clulas e tecidos

Aplicaes das tcnicas de cultura de tecidos vegetais

BIOTECNOLOGIA VEGETAL:Cultura de TecidosManipulao GenticaBiologia Molecular

Cultura de tecidos vegetais

- Nome genrico que se d aos vrios procedimentos de cultivo in vitro de clulas, tecidos e rgos vegetais em um meio nutritivo e em condies asspticas. Extrado de Glossrio de Biotecnologia (2005)INTRODUO

Principais Caractersticas in vitro = cultivo em frascos de vidro ou de plstico; ambiente artificial (fsico e nutricional);

ocupa menor espao fsico;

diferentes tipos de clulas, tecidos e rgos; ambiente assptico = ausncia de microorganismos e insetos;

Cultivo in vitro de banana (micropropagao)

Cultivo in vitro de banana

aclimatizaoPlantio

Cultura in vitro de bananaFotos: Tulmann Neto

Cultivo in vitro de bananaFoto: P.H. Vigas

HISTRICOTOTIPOTNCIA

- 1o dos primeiros fundamentos da cultura de tecidos vegetais

"...cell is capable of autonomy and even that is totipotent..." (Schleiden, 1838; Schwann, 1839)

...clula autnoma, portanto, contm o potencial necessrio para originar uma planta...

Entretanto,

a totipotncia somente expressa sob condies especiais de estmulos.

HISTRICO CULTURA DE TECIDOS

Fisilogo vegetal austro-hngaro (G. Haberlandt, 1902) foi o 1o a tentar cultivar plantas in vitro, entretanto, devido a limitaes tcnicas da poca, no obteve sucesso.

"Haberlandts vision was of achieving continued cell division in explanted tissues on nutrient media that is, of establishing true, potentially perpetual, tissue cultures.""Harbelandt originated the conceptual and was the first to attempt to cultivate isolated plant cells "in vitro" on an artificial medium." (Dodds & Roberts, 1995)

HISTRICO1900: Idias sobre totipotncia (Morgan, 1901) (Haberlandt, 1902) primeiro a tentar o cultivo de clulas vegetais (folha);

1930 - 1940: Trabalhos bsicos sobre assepsia, formulao de meios nutritivos, descoberta de auxinas; Induo e cultivo de calos;

HISTRICO1934 - primeiro trabalho de cultura de tecidos - pices radiculares de tomate por tempo indefinido (White);

1934 - identificao da auxina AIA (Kogh et al.);

1937 - importncia da tiamina (vitamina) para o crescimento de razes in vitro e elaborou uma mistura orgnica, utilizada at hoje (White);

1939 - obteno e manuteno por tempo indefinido de calo de cenoura (Gautheret; Nobrcour);

1939 - White: obteno de calo de fumo;

HISTRICO1940 1970: Formulao de meios nutritivos, cultura de pices meristemticos, clulas em suspenso, embriognese somtica, isolamento de protoplastos e regenerao de plantas;

1970 1990: Primeiros trabalhos sobre manipulao gentica, fuso de protoplastos e plantas transgnicas;

HISTRICO1941 - adio de gua de coco aos meios de cultura (Van Overbeek et al.);

1946 - 1a regenerao de plantas a partir de pices meristemticos de Lupinus (Ball);

1952 - uso prtico - obteno de plantas de dlia, livres de vrus (Morel & Martin);

1960 mesmo para orqudeas (Morel);

HISTRICO1955 e 1956 - (Miller et al.)- descoberta da cinetina - regenerao de parte area/raiz de tabaco depende do balano auxina/citocinina

1958 (Steward et al.) e 1959 - (Reinert) - formao de embries somticos de cenoura

1960 - isolamento de protoplastos tomate (Cocking)

1962 formulao do meio de cultura MS (Murashige & Skoog);

HISTRICO1966 plantas haplides a partir de cultura de anteras de Datura (Guha & Maheshwari);

1971 regenerao de plantas a partir de protoplastos (Takebe et al.);

1972 - fuso de protoplastos de Nicotiana glauca e N. langsdorfii (Carlson et al.);

1978 obteno de hbridos somticos entre tomate e batata (Melchers et al.);

HISTRICO1974 descobriram que o plasmdeo-Ti era o princpio indutor da A. tumefaciens, possibilitando a transformao de plantas (Zaenen et al.; Van Larebeke et al.);

1977 integrao de DNA plasmidial, em clulas de tabaco (transformao gentica) (Chilton et al.);

1979 desenvolveram a tcnica de co-cultivo (Marton et al.);

1985 - obtiveram plantas transformadas de tabaco (Horsch et al.);

HISTRICO1994 Lanamento comercial da 1a planta transgnica;

Tamate Flavr Savr (Calgene)

HISTRICO1990 hoje: desenvolvimento de protocolos mais eficientes de cultura de tecidos;

Universidades e Centros de Pesquisa

- estudos bsicos: fisiologia e bioqumica - desenvolvimento de protocolos:

Organognese e Embriognese somticaCultura de clulas haplides, protoplastos, etcSeleo in vitroProduo de sementes sintticasTransformao gentica

CULTURA DE TECIDOS VEGETAISEXPLANTE- qualquer segmento de tecido oriundo de uma planta para iniciar uma cultura in vitro, geralmente com vistas a estabelecerum protocolo de plantas de gentipo superior.

meristemas pr-existentes - exemplos: pice caulinar, meristema, segmento nodal e sementes

no meristemticos - exemplos: disco de folha, segmentos de raiz, segmentos de folha

EXPLANTES

pices caulinaresEstruturasArroz

EXPLANTES

Meristema

EXPLANTES

Segmento Nodal

EXPLANTESDiscos de folhaSegmentos de raiz

SISTEMAS DE CULTURA IN VITRODE CLULAS E TECIDOS Cultura de Embrio: Embrio zigtico imaturo ou maduro;

Cultura de rgos: meristema, raiz, gemas, outros.

Cultura de Calos: cultivo de uma massa no-diferenciada de clulas.

Cultura de Clulas em Suspenso: cultura de clulas isoladas e/ou em pequenos agregados, incubada sob agitao.

Embriognese Somtica: produo de embrio morfologicamente semelhante a um embrio zigtico que diferenciado a partir de clulas somticas.

Cultura de Clulas Haplides: cultura de anteras, gros de plen e vulos, com o objetivo de se obter plantas haplides.

Cultura de Protoplastos: isolamento e cultivo de clulas sem parede celular.

Cultura de embriesMamoFonte: Cid (2003)

Cultura de rgos (gema axilar)Micropropagao de CafFonte: Cid (2003)

Cultura de rgos (gema caulinar)AbacaxiFonte: Cid (2003)

Cultura de rgos (segmento epictilo)CitrosFonte: Almeida (2002)

Cultura de calosEucaliptoFonte: Cid (2003)

Cultura de clulas em suspensoCafFonte: Koehler (2006)Fonte de explantes

Cultura de clulas em suspensoCitros

Cultura de embries somticosCafFonte: Cid (2003)

Cultura de protoplastosBananaFonte: Assani et al. (2006)

APLICAES DAS TCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS Pesquisa Bsica: fisiologia e bioqumica vegetal

Micropropagao: mudas de alta qualidade e em grande quantidade

Limpeza de Vrus: vrus sistmicos em espcies de propagao vegetativa

Cultivo de Embrio: dormncia de sementes ou embries obtidos de cruzamentos entre parentais distantes

Embriognese Somtica: produo de sementes sintticas

Plantas Haplides ou duplo-haplides: obteno de linhagens homozigotas

Conservao de Germoplasma in vitro

Manipulao Gentica: hibridao somtica, transformao gentica, seleo in vitro, induo de mutaes

Pesquisa Bsica: fisiologia e bioqumica vegetalComo possvel se obter:

- linhagens celulares homogneas, sem clorofila e com ciclo sincronizado;- clulas isoladas (protoplastos);- grande nmero de clulas e plantas num pequeno espao e sob condies artificiais;

APLICAES

bioqumica:- nutrio celular e de plantas;- cadeia de transporte em membranas;- toxidez e detoxificao celular;- metablitos secundrios;

fisiologia:- ciclo celular;- fatores de crescimento;- senescncia;- vias de regenerao (embriognese somtica);- fatores que afetam a fotossntese;

Micropropagao clonal- Produo de mudas em larga escala (plantas idnticas); Maior utilizao comercial da cultura de tecidos; Necessidade de se ajustar os protocolos para cada espcie, variedade ou clone;

Espcies que mais tm sido utilizadas para a microprapagao comercial (cana-de-acar, Pinus, eucalipto, banana, abacaxi, morango, batata e ornamentais).

Cuidados para se evitar a variao somaclonal !!!!!

Variao Somaclonal: variao detectada em plantas regeneradas por cultura de tecidos (Larkin & Scowcroft, 1981);

Micropropagao de baunilhaMicropropagao de mandiocaFonte: Santos (2001)

Limpeza de vrusPrincipais culturas: Cana-de-acar, Mandioca, Morango, Batata, Plantas ornamentais

Limpeza de vrustermoterapia + cultura do pice meristemtico

ex: vrus do mosaico da cana-de acarcultura de meristema: explante 0,3 mmcultura pice meristemtico (1 2,5 cm) + termoterapia (45oC / 8 horas)

quimioterapia + cultura do pice meristemticoincorporao de antivirais no meio de cultura

Indexao: avaliao da presena do vrusensaios biolgicosmicroscopia eletrnicaserologia (ELISA)hibridao com cidos nuclicos

Cultivo de embrioCultivo de embries zigticos imaturos ou maduros

Objetivos:

Superar a dormncia de sementes (devido a imaturidade ou pela presena de inibidores no endosperma);

Recuperar hbridos raros de cruzamentos incompatveis;

Embriognese somticaCultivo de embries somticos- Constitui-se numa importante ferramenta para os estudos bsicos relacionados com a fisiologia e gnese do desenvolvimento do embrio;

- Mtodo para propagao de plantas elite com uso de biorreatores e produo de sementes sintticas;

- Produo de plantas transgnicas;

Embriognese somtica e sementes sintticasO conjunto de tcnicas que visa o emprego de embries somticos chamado de tecnologia de sementes sintticas ou artificiais.

Cultura de clulas haplides ou duplo-haplidesCultivo de clulas haplides (gros de plen, anteras e vulos);

Objetivos

Obteno de plantas haplides;

Obteno de plantas duplo-haplides (plantas completamente homozigotas) em apenas um ciclo e sem a necessidade de realizar cruzamentos;

Vantagem: tempo

Cultura de anteras e plenAnterasMicrsporogerminandoEmbriognesesomticaEmbries somticosGramnea

Cultura de vulosFlor - OvriovulosCalosOrganognesesomticaObteno de plantasMultiplicaoTabaco

Conservao do germoplasma in vitro- Conservao do germoplasma em pequeno espao, a baixo custo e mantendo a integridade gentica do acesso;

- Maior interesse para espcies de propagao vegetativa, tais como: alho, mandioca , batata, batata doce e outras;

Evitar a variao somaclonal !!!

Possibilidade de troca de germoplasma sadio (sem risco de novas doenas e pragas);

Manipulao Gentica Ampliao da variabilidade: induo de variao somaclonal;

Obteno de novos materiais: hibridao somtica, hibridao assimtrica, cibridizao;

Servir como apoio para outras tcnicas: Induo de mutaes, poliploidizao com uso de colchicina, transformao gentica e outras;

Seleo in vitro de linhagens celulares e plantas;

Bibliografia consultada:

Borm, A.; Veira, M.L.C. Glossrio de Biotecnologia, Viosa, Editora Folha de Viosa, 2005.

Roca, W.M. Mroginski, L.A.; Cultivo de tejidos em la agricultura fundamentos y aplicaciones. Colmbia, CIAT, 1991, 970p.

Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. Braslia, EMBRAPA-SPI v.1, 1998, 864p.

Torres A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A. Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. Braslia, EMBRAPA-SPI v.2, 1999, 354p.

Revista BIOTECNOLOGIA Cincia e Desenvolvimento. KL3 Publicaes: Braslia, 2001.