Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur

Kalus Pada Jagung

O

L

E

H

NAMA : JAKOP E T HUTAPEA

NIM : 409141044

KELAS : PENDIDIKAN BIOLOGI B’09

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2011

Peningkatan Somaklonal Melalui Kultur Kalus Pada Jagung

1. Pengertian Kalus

Kalus adalah sekumpulan sel amorphous (tidak berbentuk atau belum

terdiferensiasi) yang terbentuk dari sel-sel yang membelah terus menerus secara in

vitro atau di dalam tabung. Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman seperti akar,

batang dan daun. Secara histologi, kalus berasal dari pembelahan berkali-kali sel-sel

parenkim di sekitar berkas pengangkut dan beberapa elemen penyusun berkas

pengangkut kecuali xilem. Dalam teknik kultur jaringan (in vitro), kalus dapat

diinduksi dengan menambahkan zat pengatur tumbuh yang sesuai pada media kultur,

misalnya auksin dan sitokinin yang disesuaikan. Jika konsentrasi auksin lebih besar

daripada sitokinin maka kalus akan terbentuk, sedangkan jika konsentrasi sitokinin

yang lebih besar dibandingkan dengan konsentrasi auksin maka yang terbentuk

bukanlah kalus, melainkan tunas. Selain zat pengatur tumbuh atau hormon

pertumbuhan, penambahan vitamin dan protein juga diperlukan untuk pertumbuhan

kalus. Induksi kalus dalam teknik kultur jaringan tanaman diperlukan untuk

memunculkan keragaman sel somatik di dalam kultur in vitro dan meregenerasikan

sel tersebut menjadi embrio somatic

Tanaman regenerasi dari kalus embrio yang diturunkan dari jagung pertama

kali dikembangkan oleh oleh Green dan Phillips (1975). Sejak itu, telah menjadi jelas

bahwa genotipe digunakan adalah penting bagi respon kultur jaringan. Somatik

embriogenesis dalam tipe kompak saya kalus yang berasal dari beberapa galur dan

hibrida disesuaikan dengan daerah beriklim sedang telah dilaporkan. Beberapa

jagung genotipe asal tropis dan subtropis juga telah terbukti menghasilkan kalus

embriogenik . Namun, hanya sedikit genotipe menimbulkan kalus tipe meremah II

mampu somatik embriogenesis. Inti serta efek genetik sitoplasmik pada jaringan

tanggapan budaya dan regenerasi tanaman telah dilaporkan Sejumlah penelitian telah

dilakukan pada genetik dan variasi sitogenetika pada tanaman regenerasi dari jagung

kultur jaringan. Walaupun variasi tersebut, disebut variasi, dapat berguna untuk

perbaikan tanaman, hal ini tidak diinginkan bila genetik stabilitas diperlukan.

Kerusakan kromosom yang terkait dengan daerah heterochromatin sering diamati

pada tanaman kultur jaringan. Meiosis penelitian jagung ulang telah menunjukkan

bahwa kebanyakan breakpoints pada lengan kromosom yang mengandung kenop

heterochromatic, dan telah diusulkan yang biasanya terlambat replikasi daerah

mungkin meniru bahkan kemudian di lingkungan budaya terkemuka pembentukan

jembatan anafase karena tertunda pemisahan kromatid kakak di lokasi tombol. Baru-

baru ini, beberapa peneliti menyelidiki terjadinya ketidakstabilan mitosis dalam

budaya kalus embriogenik berasal dari jagung inbrida memiliki komposisi tombol

yang sama. Jembatan akibat keterlambatan pemisahan kromatid kakak

diselenggarakan bersama-sama di lokasi tombol yang diamati, sehingga mendukung

hipotesis yang diusulkan oleh Lee dan Phillips (1987). Selanjutnya, kehadiran

jembatan khas dengan dan tanpa tombol terdeteksi oleh C-bandeng, dan sel metafase

menunjukkan kotor penyimpangan yang melibatkan lengan kromosom memiliki

tombol besar, menyarankan terjadinya kerusakan-fusion- jembatan (BFB) siklus

diprakarsai oleh lengan kromosom rusak selama acara utama.

Sejauh ini hampir semua kultur jaringan dan transformasi jagung melibatkan

penggunaan embrio zigotik belum menghasilkan sebagai sumber eksplan untuk

regenerasi. Namun, belum menghasilkan embrio yang musiman tersedia dan telah

sangat terbatas sesuai durasi budaya. Hal ini menyebabkan kegiatan kultur jaringan

membosankan rutin dalam kerangka waktu yang ditentukan dan berkesinambungan

tanam untuk kelangsungan penyediaan embrio belum menghasilkan. Sebaliknya,

embrio matang sudah tersedia sepanjang tahun dalam jumlah besar. Selanjutnya,

walaupun beberapa laporan tentang perlawanan dari tropis jagung baris dan embrio

matang untuk bekerja kultur jaringan Embrio matang jagung dapat digunakan untuk

menginduksi kalus tetapi tidak ada planlet yang diregenerasi. Berhasil kembali

tanaman dari matang

embrio dari dua inbreeds jagung, B73 dan Mo17, tetapi regenerasi adalah tergantung

genotipe dan frekuensi hanya 4 sampai 5%. Huang dan Wei (2004) melaporkan

regenerasi garis jagung beriklim dari embrio matang pada frekuensi berkisar 19,85-

32,4%. Sebagian besar baru-baru ini Al-Abed et al. (2006) melaporkan lebih efisien

regenerasi sistem untuk dua hibrida dan dua bawaan baris jagung sedang dengan split

biji matang sebagai eksplan. Di sini, kami melaporkan regenerasi dari satu tropis

jagung galur inbrida dan satu varietas bersari bebas dari embrio matang untuk

pertama kalinya menggunakan benih split teknik.

2. Pembuatan Kultur Kalus

a) Bahan yang diperlukan

Bahan yang digunakan dalam pembuatan kultur kalus adalah jagung, kemudian

media yang merupakan tempat pembuatan kultur kalus adalah garam LS, vitamin B5,

900 mg l-1 prolin, 250 mg l-1 kasein hidrolisat dan 10 mg l-1 filter steril AgNO3 30

g l-1

sukrosa dan 8 g l-1 dari agar. Media B: garam MS dan vitamin, 900 mg l-1 prolin,

250 mg l-1 hidrolisat kasein dan 10 mg l-1 filter steril AgNO3 30 g l-1 sukrosa dan 8

g l-1 dari agar.

b) Teknik Pembuatan Kultur Kalus Pada Jagung

Langkah-langkah yang dilakukan dalam pembuatan kultur kalus adalah

1. Sterilisasi Benih

Membran di sekitar gagang bunga dari biji kering telah dihapus dengan tindakan

pencegahan maksimum tidak mudah rusak atau mengekspos embrio ke pemutihan

agen. Biji kemudian dicuci dengan cair local deterjen dan dibilas tiga sampai empat

kali dengan air mengalir. Thedicuci benih direndam dalam larutan etanol 70%

selama 3 menit dan dibilas dengan air suling tiga sampai empat kali. Biji kemudian

direndam dalam 85% pemutih Jik komersial (Reclkit dan Colman, Kenya) atau 3%

larutan sodium hipoklorit selama 15 menit dua kali, setiap kali menggunakan larutan

segar diikuti oleh biji mencuci tiga sampai empat kali dalam air suling steril (dH2O)

untuk benar-benar menghapus sisa-sisa Jika. Kemudian biji menjadi sasaran salah

satu dari berikut perendaman skema; A) perendaman dalam dH2O steril semalam, B)

berendam di 28% komersial pemutih semalam, C) berendam di 28% pemutih

komersial untuk 6 jam diikuti dengan perendaman dalam dH2O steril selama 18 jam,

D) perendaman dalam 28% pemutih komersial untuk 2 - 3 jam diikuti dengan

merendam di steril dH2O untuk 21 - 22 jam dan E) perendaman dalam semalam

diikuti dH2O steril sterilisasi selama 20 menit dalam pemutih komersial 28%. Biji

dengan gagang bunga dikelilingi oleh membran juga disterilkan dan direndam dalam

steril dH2O semalam. Media, air dan budaya botol yang digunakan dalam percobaan

uap disterilkan pada 121 º C pada tekanan 15pound per square inch (psi) selama 21

menit. pH media disesuaikan dengan 5.8 menggunakan HCl / NaOH sebelum

sterilisasi.

2. Perendaman dan perkecambahan

Biji direndam dalam media perendaman terdiri media LS cair dilengkapi dengan 3

mg l-1 dari 2,4-D selama 48 jam Semi padat MS media dilengkapi dengan 2 mg l-1

dari 2,4-D digunakan untuk perkecambahan biji

3. Induksi kalus

Setelah 3 - 5 hari kecambah dibagi longitudinal untuk mengekspos meristem,

scutellum dan coleorhiza secara bersamaan, dan ditanam pada media induksi kalus

dengan sisi menghadap split media. Media induksi kalus media A dilengkapi dengan

0 - 6 mg l-1 dari 2,4-D atau 3 mg l-1 dari 2,4-D dikombinasikan dengan KT dalam

kisaran 0 - 2 mg l-1. Sepuluh biji split dikultur per piring dan diinkubasikan dalam

gelap pada 26 ± 2 º C. Dua hari kemudian, tumbuh radikula dan bulu kecil

dipindahkan untuk mendorong inisiasi kalus dan kembali kembali ke kamar

pertumbuhan selama 2 - 3 minggu inkubasi. Sangat berkembang biak Kalus

diinduksi menggunakan 2,4-D saja sudah dipindahkan ke Media Sebuah dilengkapi

dengan 2 mg l-1 dari 2,4-D sendirian sementara kalus diinduksi menggunakan 2,4-D

dikombinasikan dengan KT dialihkan kepada media A dilengkapi dengan 2 mg l-1

dari 2,4-D yang dikombinasikan dengan 0,5 mg l-1 dari KT. Kalus disubkultur setiap

dua minggu selama 6 - 8 minggu periode inkubasi dalam gelap pada 26 ± 2 º C.

A & B) Kalus diinduksi pada benih split

Gambar C. kalus embriogenik diinduksi.

4. Regenerasi

Organogenic Kalus dipindahkan ke media penembakan terdiri dari media MS

ditambah dengan 4 mg l-1 BAP dan 2 mg l-1 KT dan diinkubasi pada 26 ± 2 º C di

bawah 16 / 8 fotoperiode. Kalus embriogenik itu, bagaimanapun, dipindahkan ke

Media A dilengkapi dengan tambahan 30 l g-1 dari sukrosa untuk pematangan

embrio dan diinkubasi pada 26 ± 2 º C dalam gelap. Setelah pematangan, embrio

diinkubasi pada MS tanpa hormon pada 26 ± 2 º C media di bawah 16 / 8 fotoperiode

Gambar (D). embrio globular diinduksi pada pemeliharaan media. (E).Embrio

pada media pematangan

Gambar (F). Organogenic kalus diinduksi. (G). pucuk diinduksi pada dari kalus

organogenic

5. Aklimatisasi

Ketika planlet dikembangkan 2-3 daun, mereka transplantasi ke pot plastik

yang diisi dengan lumut pit lembab (Kekkilä Oyj,Tussula, Finlandia). Tanaman

disemprot dengan air dan ditutup dengan polietilen kantong kertas untuk menaikkan

kelembaban relatif dan memberi minum teratur di rumah kaca. Setelah dua minggu,

tanaman diaklimatisasi dipindahkan ke ember diisi dengan tanah lempung dicampur

dengan pasir dan Phytomix (Kenya Benih Co Ltd, Kitale, Kenya) dalam 2:1 dan

rasio dibawa kembali ke rumah kaca.

Gambar (H).Beberapa pucuk diinduksi pada kalus organogenic Katumani.( I) Tunas

pada media elongasi

Gambar (J) .Aklimatisasi

Secara umum diketahui bahwa induksi kalus embriogenik terjadi pada

permukaan scutellum. Zona inisiasi sel meristematik adalah diamati dari scutellum

embrio belum menghasilkan jagung. Namun, semua tanaman regenerasi dalam

penelitian ini adalah

diperoleh dari kalus organogenic induksi di dasar bulu kecil di mana ia melekat

scutellum tersebut. Demikian pula, Danson et al. (2006) melaporkan bahwa dengan

pengecualian mSv garis CYMMYT Pool A3-6 dan garis CMB5 dengan respon

embriogenik 12 dan 8%

masing, tidak ada baris yang tersisa jagung tropis maju melampaui 45 langkah

subkultur hari untuk pembentukan kalus Tipe II. Kultur jaringan awal bekerja pada

elit tropis CML72 baris jagung, CML216, CML323, dan CML327 juga diproduksi

hanya tipe I kalus (Bohorova et al, 1995). Alasan paling mungkin untuk ini bisa latar

belakang peran genetik dalam pembentukan Tipe II kalus. Kematangan tingkat

embrio dipanen dari biji kering juga bisa memainkan peran utama karena kurangnya

regenerasi melalui somatik embriogenesis. Mirip respon induksi kalus rendah

kemampuan dan regenerasi yang berpengalaman untuk dewasa embrio dipanen 21

DAP. Para 16,5 dan frekuensi regenerasi 21,2% dan 1 - 5 pucuk per kalus dilaporkan

dalam penelitian ini adalah rendah dibandingkan laporan. Namun, banyak pekerja

lain juga melaporkan frekuensi regenerasi yang lebih rendah untuk tropis genotipe

jagung. Regenerasi mengurangi frekuensi untuk baris jagung tropis dibandingkan

dengan beriklim baris dari embrio belum matang. Ini respon yang rendah

kemungkinan besar disebabkan oleh sifat perlawanan genotipe jagung tropis dengan

kondisi kultur jaringan dikembangkan menggunakan garis sedang. Namun,

mengingat sepanjang tahun ketersediaan dan kelimpahan, penggunaan embrio

dewasa sebagai sumber eksplan alternatif dapat berguna dalam kultur jaringan

jagung tropis dan transformasi studi. Selain itu, ini adalah laporan pertama mengenai

regenerasi garis jagung tropis dari embrio matang melalui jalur yang melibatkan

induksi kalus.