pengenalan kultur sel mamalia

41
 Pengenalan Kultur Sel Mamalia Puji Astuti

Upload: avindakumalasari

Post on 08-Oct-2015

168 views

Category:

Documents


30 download

DESCRIPTION

biologi sel

TRANSCRIPT

  • Pengenalan Kultur Sel

    Mamalia

    Puji Astuti

  • Animal Cell

    Nucleus

    Nucleolus

    Rough Endoplasmic Reticulum

    Smooth Endoplasmic Reticulum

    Ribosomes

    Golgi Bodies

    Mitochondria

    Cell Membrane

    Cytoplasm

  • Pengenalan Kultur Sel Mamalia

    Apakah Kultur Sel?

    Kultur sel dapat di definisikan sebagai pemindahan sel dari binatang dan dilanjutkan pertumbuhannya dalam lingkungan artifisial yang mendukung

    Sel dapat dipisahkan langsung dari jaringan dan didisintegrasi dengan reaksi enzimatis atau mekanik sebelum dikulturkan, atau dapat diturunkan dari suatu cell line atau strain sel yang sudah ada/establish

  • Cara memperoleh Cell line

    Kita bisa membuat kultur sel primer sendiri atau membeli

    dari kultur sel yang sudah establih secara komersial atau non-profit suppliers (i.e., cell banks);

    Reputable suppliers mempunyai cell lines dengan kualitas yang tinggi yg telah ditest dengan baik integritasnya untuk menjamin kultur sel bebas dari kontaminan;

    Disarankan untuk tidak meminjam kultur dari laboratorium yang lain karena mereka umumnya beresiko kontaminan.

    Dari manapun sumbernya, pastikan cell line yang baru di uji keberadaan kontaminasi mycoplasma sebelum digunakan

  • Kultur Sel/Lines

    Primary culture/Kultur Primer dapat didefinisikan sebgai kultur yang

    diperoleh setelah sel disolasi dari jaringan dan berproliferasi dalam kondisi

    yang sesuai sampai mereka menempati seluruh tempat tumbuh (mencapai

    confluence). Pada tahap ini, sel harus disubkultur (i.e., passaged) dengan

    cara memindahkannya ke dalam tempat tumbuh yang baru berisi media

    baru untuk melanjutkan pertumbuhan;

    Setelah subkultur pertama, sel kultur primer disebut suatu cell line atau subclone. Cell lines yang diturunkan dari kultur primer mempunyai waktu

    hidup terbatas (i.e., they are finite), dan seiring proses subkultur, sel dengan

    kapasitas pertumbuhan tertinggi akan mendominasi, menghasilkan suatu

    tingkat keseragaman genotip dan fenotip dalam populasi;

    Jika suatu subpopulasi suatu cell line diseleksi dari kultur dengan kloning atau dengan metode lain, cell line ini menjadi suatu cloned cell strain.

    Suatu cell strain kadang mengalami penambahan perubahan genetik

    setelah pembuatan parent line.

    http://www.invitrogen.com/

  • Morfologi sel Mammalian

    Hampir semua sel mamalia dapat dikategorikan menjadi 3 kategori dasar menurut morfologi:

    1) Fibroblastic (atau fibroblast-like) cells adalah bipolar atau multipolar, mempunyai bentuk memanjang dan tumbuh melekat

    pada suatu substrate/tempat tumbuh;

    2) Epithelial-like cells adalah berbentuk polygonal dengan dimensi

    yang teratur, dan tumbuh melekat pada substrate dalam pola yang

    dapat dibedakan;

    3) Lymphoblast-like cells adalah berbentuk spheric dan umumnya

    tumbuh seperti suspensi tanpa melekat pada permukaan

    http://www.invitrogen.com/

  • Morfologi sel mamalia

    Selain kategori dasar di atas, sel tertentu mempunyai

    karakteristik morfologi yang spesifik, tergantung

    perannya dalam inangnya.

    Neuronal cells nampak dalam bentuk dan ukuran yang berbeda,

    tetapi secara garis besar dapat dikategorikan menjadi 2: tipe I

    dengan axon panjang digunakan untuk menggeraklan signal dalam

    jarak jauh dan tipe II tanpa axons. Suatu neuron khusus nampak

    sebagai perpanjangan dengan banyak cabang dari badan sel,

    disebut dendritic tree.

    http://www.invitrogen.com/

  • Sel neuron

  • Morfologi sel mamalia

    Human Embryonic Kidney 293 cells, sering disebut HEK 293, 293 cells, atau HEK cells adalah cell line spesifik yang diturunkan dari

    human embryonic kidney cellsdan ditumbuhkan dalam kultur

    jaringan.

    http://www.invitrogen.com/

    Gambar phase contrast

    memperlihatkan morfologi

    293 sel sehat ditumbuhkan

    dalam kultur melekat pada

    80% confluency (1) dan

    kultur suspensi (2)

    1

    2

  • Finite vs Continuous Cell Line

    Sel normal umumnya membelah dengan jumlah

    terbatas sampai kemudian hilang kemampuan berproliferasi, suatu event genetik yang disebut senescence; cell lines ini disebut finite.

    Namun, beberapa cell lines menjadi immortal melalui proses yang disebut transformasi, dapat terjadi secara spontan atau dapat diinduksi secara kimia atau diperantarai virus. Ketika suatu finite cell line mengalami transformasi dan memiliki kemampuan membelah tidak terbatas, maka sel tersebut menjadi suatu continuous cell line.

    http://www.invitrogen.com/

  • Stem Cells

    Embryonic Stem Cells: pluripotent stem cells yang diturunkan dari masa sel bagian dalam dari suatu blastocyst, suatu early-stage preimplantation embryo

  • Stem Cells Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs):

    Suatu jenis pluripotent stem cell yang dapat dihasilkan langsung dari sel dewasa.

    (1) Isolasi dan kultur sel donor (2) Transfect stem cell-associated

    genes dalam sel dengan perantara viral vectors. Sel berwarna merah menandakan sel yang mengekspresikan exogenous genes.

    (3) Panen dan kultur sel dengan mitotically inactivated feeder cells (lightgray).

    (4) Kelompok kecil sel yang telah tertransfesi menjadi sel iPS dan menghasilkan ES-like colonies.

  • Stem Cells

    Hematopoietic Stem Cells (HSCs): adalah sel darah yang menghasilkan semua jenis sel darah dan diturunkan dari mesoderm. Sel tersebut berada di red bone marrow, yang menjadi pusat hampir semua tulang.

  • Stem Cells

    Mesenchymal Stem Cells: MSCs, adalah multipotent stromal cells yang dapat berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel, termasuk osteoblasts (bone cells), chondrocytes (cartilage cells), dan adipocytes (fat cells).

  • Stem Cells

    Neural Stem Cells & Glial Precursor Cells

    Neural stem cells (NSCs) adalah self-renewing, multipotent cells yang menghasilkan fenotip

    utama sistem syaraf.

    Glial precursor cells (GPCs), disebut juga glial restricted progenitors (GRP) atau

    oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), adalah

    sel yang berpotensi untuk berdiferensiasi

    membentuk oligodendrocytes atau astrocytes.

    Diturunkan dari jaringan atau dari sel pluripotent

    yang diinduksi faktor eksternal.

  • Isolat astrocyte dilihat confocal

    microscopy, dicat GFAP (merah), focal

    adhesion kinase (hijau), dan nuclear

    stain To-Pro (biru)

  • Pemilihan Cell Line yang Cocok

    Kriteria pemilihan cell line untuk penelitian:

    Spesies: Non-human dan non-primate cell lines biasanya punya batasan biosafety yang lebih sedikit, tetapi pada dasarnya jenis penelitian menentukan apakah menggunakan kultur spesies spesifik atau tidak;

    Karakteristik Fungsional: Apa tujuan penelitian? Contoh: cell line yang diturunkan dari hati dan ginjal lebih cocok untuk testing toksisitas;

    Finite atau continuous: finite cell lines pilihan untuk penelitian yang mengarah pada fungsi ekspresi yang lebih tepat, continuous cell lines lebih mudah digunakan untuk kloning dan maintanance;

    http://www.invitrogen.com/

  • Pemilihan Cell Line yang Cocok Kondisi dan Karakteristik Pertumbuhan : Apakah persyaratan

    untuk kecepatan pertumbuhan, kerapatan jenuh dan kemampuan tumbuh dalam suspensi? Contoh untuk mengekspresikan proterin dalam jumlah tinggi diperlukan cell line dengan kecepatan pertumbuhan tinggi dan kemampuan tumbuh dalam suspensi.

    Normal atau transformed: Transformed cell lines umumnya mempunyai kecepatan pertumbuhan tinggi, plating efficiency lebih tinggi, continuous, dan membutuhkan serum lebih sedikit dalam media, tetapi sel tersebut mengalami perubahan permanen pada fenotipnya karena transformasi genetik;

    Kriteria lain: Kalau menggunakan finite cell line, apakah stoknya cukup? Apakah cell line sudah terkarakterisasi baik atau perlu proses validasi? Jika menggunakan abnormal cell line, apakah punya normal cell line yang ekuivalen yang digunakan sbg kontrol? Apakah cell linenya stabil? Jika tidak seberapa mudah diklon dan dibuat untuk stock frozen yang cukup untuk penelitian?

    http://www.invitrogen.com/

  • Cell

    Line Tipe sel

    Faktor

    pertumbuhan

    dan perlekatan

    Konsentrasi

    yg

    disarankan

    (ng/ml)

    Mediu

    m

    Serum

    Suppl.

    MCF

    7

    Human

    mammary

    carcinoma

    EGF(a) 100 DMEM 2%

    FBS

    HF

    Human foreskin

    fibroblast EGF(a) 2 DMEM

    10%

    FBS

    --

    Primary

    hepatocyte EGF(a) 10 DMEM

    10%

    FBS

    WB

    Rat hepatic

    epthelium EGF(a) 10

    Richter'

    s MEM

    10%

    FBS

    HeLa

    Human cervical

    carcinoma EGF(a) 2.5 x104 DMEM

    10%

    FBS

    A431 Epidermal

    carcinoma EGF(a) 2.5 x 104 DMEM

    10%

    FBS

    --

    Primary human

    fibroblast EGF(a) 1x103

    MEM

    Earle's

    10%

    FBS

  • Cell

    Line

    Tipe sel

    Faktor

    pertumbuhan

    dan perlekatan

    Konsentrasi

    yg

    disarankan

    (ng/ml)

    Mediu

    m

    Serum

    Suppl.

    MKN-

    7

    Human

    adenocarcinom

    a

    EGF(a) 50 DMEM 8%

    FBS

    BALB

    /c

    3T3

    Mouse

    fibroblast EGF(a) 50

    DMEM/

    F-12 --

    TM-4 Mouse testes

    epithelium EGF(a) 3

    DMEM/

    F-12 --

    NRK-

    49F Rat fibroblast EGF(a) 50

    DMEM/

    F-12 --

    GH3

    Rat

    neuroblastoma bFGF 1 F-12 --

    BHK-

    21

    Baby hamster

    kidney bFGF 3

    DMEM/

    F-12

    5%

    Calf

    MKN-

    7

    Human

    adenocarcinom

    a

    EGF(a) 50 DMEM 8%

    FBS

  • Kondisi kultur

    Kondisi kultur sangat berbeda untuk tiap jenis sel, tetapi lingkungan

    artificial dimana sel ditumbuhkan tidak beragam yang umumnya terdiri dari:

    substrate atau medium yg mensuplai essential nutrients (asam amino, karbohidrat, vitamin, mineral)

    Faktor pertumbuhan (FBS; defined media supplements) Hormones (extra) gases (O2, CO2) Lingkungan fisiko-kimia yang diatur (pH, tekanan osmosis,

    temperature)

    hampir semua sel anchorage-dependentdan harus dikulturkan dengan melekatkan pada solid atau semi-solid substrate (adherent atau monolayer culture), yang lain dapat ditumbuhkan mengapung dalam medium kultur (suspension culture).

    http://www.invitrogen.com/

  • Menghitung sel dengan Hemacytometer

    Bersihkan chamber dan cover slip dgn alkohol. Keringkan dan tempatkan coverslip dlm posisi yg tepat.

    Panen sel. Tambahkan 10 L sel dlm hemacytometer. Jgn berlebihan.

    Tempatkan chamber dlm inverted microscope, 10X objective. gunakan phase contrast untuk membedakan sel.

    Hitung sel pd bagian kotak yg besar tengah bergaris (1 mm2). Kotak bergaris ada dlm lingkaran. Kalikan 104 untuk memperkirakan jml sel per mL. Lakukan 2 X dan hitung rata-rata.

    http://www.invitrogen.com/

    Avi: 7

  • HepatoPac

    HepatoPac Platform Hepregen diekmbangkan sebagai suatu bioengineered microliver platform yang unik sebagai model fungsional liver in vivo.

    Teknologi rekayasa jaringan Microfabrikasi dikombinasi untuk menghasilkan model miniatur hati manusia yg terorganisasi

    Multiwell plate yg terstandarmicropattern level industri mengandung koloni sel hati dikelilingi penyokong stroma

    http://www.hepregen.com/technology.html

  • Sel manusia untuk skrining

    hES-CMC2D adalah sel hES yg diturunkan dari klaster cardiomyocyte, dibuat sebagai monolayers dalam format 96-well plate.

    Keuntungan:

    Sel manusia

    Sumber homogen

    Lingkungan asli dari multiple ion channels

    High toxicological relevance

    Secara genetik unmodified

    Suplai tidak terbatas

    Fresh dan ready to use

    Figure 1: Schematic illustration of an in vitro testing platform for hES-CMC2D (adapted from Mandenius et al, 2011)

    http://www.cellartis.com/

  • Penggunaan stimulus elektrik atau kimia dapat

    menghasilkan awal proses parthenogenesis

  • hpSC (human pluripotent stem cell)

    Ketika digunakan untuk transplant-based stem cell therapies, stem cells kemungkinan besar menghadapi problem Human leukocyte antigen (HLA) matching issues yang sama yang membatasi solid organ allogeneic transplants dan menyebabkan immune rejection. Resiko penolakan proporsional dgn tingkat perbedaan cell-surface antigen-presenting proteins donor dan recipient.

  • Stem cells

  • Produk kesehatan berbasis sel

    1. Manipulasi bersifat substansi: selama proses proses

    produksi sel atau jaringan dimanipulasi sehingga

    karakteristik biologi, fungsi fisik atau strukturnya

    dimodifikasi untuk mencapai fungsi. Contoh: seleksi

    dan ekspansi sel, sel yg dimanupilasi genetik

    2. Penggunaan non homologous: sel atau jaringan

    tidak ditujukan untuk digunakan untuk fungsi yg

    sama antara resipient dan donor. Contoh bone

    marrow aspirate digunakan untuk pasien penderita

    jantung untuk regenerasi myocardium

  • Produk kesehatan berbasis sel

    c. 15.000 patients

  • Produk kesehatan berbasis

    rekayasa jaringan

    In vitro skin

  • Neurotech

    Encapsulated Cell Technology

    www.neurotechusa.com/

  • Neurotech

    Age-related macular degeneration (AMD) adalah penyebab utama kebutaan

    pada orang tua di negara barat dengan prevalensi 30% pada individu umur

    lebih dari 70 tahun. Degenerasi macula (bagian pusat retina) menyebabkan

    hilangnya penglihatan pada bagian pusat.

    Retinitis Pigmentosa (RP) menyebabkan degenerasi fotoreseptor sel di retina

    (rod dan cone), yang dalam waktu lama mengurangi penglihatan malam

    dan periferal yang memicu kebutaan

  • Kultur sel Neurotech

    Produk Neurotech, NT-501, terdiri dari

    encapsulated human cells genetically

    modified to secrete ciliary neurotrophic

    factor (CNTF). CNTF adalah faktor

    pertumbuhan yg mengatasi

    photoreceptors yang melemah dan

    melindungi dari degenerasi. NT-501

    didesign untuk secara terus menerus

    menghasilkan dosis terapi yg rendah dan

    aman ke bagian belakang mata.

  • Cell based medicinal products Cell-based MPs EudraCT Clinical trial applications (3Q 2005 4Q 2009)

    3Q / 2005 3Q / 2006 3Q / 2007 3Q / 2008 4Q / 2009

    Cancer immunotherapy 3 23 45 70 103

    Cardio-vascular therapies 4 17 31 44 49

    Skin/liver/eye/diabetes/intestine/bone TE 5 12 28 48 74

    Neurological 1 4 5 6 7

    Lymphohistiocystosis (HLH) - 1 1 1 1

    AIDS - 1 1 1 1

    Infertility - 1 1 1 1

    _________________________________________________________________________________________

    Products (trials) 13 (25) 59 (73) 112 (132) 171 (213) 236 (329)

    Data from Dr. E.Flory/Eudra CT 246 (2010)

  • R&D around CADUCEUS

    1. J Cell Mol Med. 2012 Jan 6. Dose-Dependent Functional Benefit of Human Cardiosphere Transplantation in Mice with Acute Myocardial Infarction. Shen D, Cheng K, Marbn E. 2. Circulation. 2012 Jan 3. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Malliaras K, Li TS, Luthringer D, Terrovitis J, Cheng K, Chakravarty T, Galang G, Zhang Y, Schoenhoff F, Van Eyk J, Marbn L, Marbn E. 3. J Am Coll Cardiol. 2011 Jan 25;57(4):455-65. Intramyocardial injection of autologous cardiospheres or cardiosphere-derived cells preserves function and minimizes adverse ventricular remodeling in pigs with heart failure post-myocardial infarction. Lee ST, White AJ, Matsushita S, Malliaras K, Steenbergen C, Zhang Y, Li TS, Terrovitis J, Yee K, Simsir S, Makkar R, Marbn E.

  • Physiological role of cells in

    circulation? J Cell Mol Med. 2011 Aug;15(8):1726-36. Circulating stem cell vary

    with NYHA stage in heart failure patients. Fortini C, et al.

    We have investigated the blood levels of sub-classes of stem cells (SCs) [mesenchymal stem cells (MSCs), haematopoietic stem cells (HSCs), endothelial progenitor cells/circulating endothelial cells (EPCs/CECs) and tissue-committed stem cells (TCSCs)] in heart failure (HF) patients at different stage of pathology and correlated it with plasmatic levels of proangiogenic cytokines.

    PDF: 1

  • MSC

    B Harnessing the Mesenchymal

    Stem Cell Secretome

    for the Treatment of

    Cardiovascular Disease

    Cell Stem Cell 10, March 2, 2012

  • iPS Avi: 2B, 2