LAPORAN PRAKTIKUM BIOFARMASETIKAABSORBSI OBAT IN VITRO

Disusun oleh :Anindita Reningtyas( 088114016 )Meyrina Hardjani( 088114018 )Dessy Jayanti( 088114019 )Johana Tania G.( 088114020 )Oktin Sulastri( 088114021 )Natalia Endah U.( 088114022 )Kelompok: D 2PJ Laporan:

LABORATORIUM BIOFARMASETIKAFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMAYOGYAKARTA2011

Percobaan IVAbsorbsi In Vitro

A. TUJUAN1. Mahasiswa mampu menjelaskan proses absorbsi obat dalam saluran pencernaan2. mahasiswa mampu menjelaskan pengaruh pH terhadap absorbsi obat dengan rumus Handerson-Haseelbach3. Mahasiswa mampu membuat grafik hubungan antara jumlah kumulatif obat yang ditransport sebagai fungsi waktu

B. DASAR TEORIAbsorpsi adalah perpindahan obat dari tempat pemberian menuju ke tempat aksi (Goodman & Gilmans, 2006). Absorpsi sistemik suatu obat dari tempat ekstravaskuler dipengaruhi oleh sifat-sifat anatomik dan fisiologik tempat absorpsi serta sifat-sifat fisikakimia atau produk obat (Shargel, 2005).Uji pelarutan in vitro mengukur laju dan jumlah pelarutan obat dalam suatu media aqueous dengan adanya satu atau lebih bahan tambahan yang terkandung dalam produk obat (Shargel, 2005).Jumlah ionisasi suatu elektrolit lemah tergantung pada pKa dan pH medium obat terlarut. Handerson dan Hasselbach menggunakan persamaan berikut untuk asam lemah dan basa lemah guna menyatakan hubungan antara pKa dan pH (Shargel, 2005).Untuk obat asam lemah :Rasio = = Untuk obat basa lemah :Rasio = = (Shargel, 2005).

Menurut hukum difusi Fick, molekul obat terdifusi dari daerah dengan konsentrasi obat tinggi ke daerah dengan konsentrasi obat rendah. Persamaan hukum Fisck adalah sebagai berikut:

, dimana:Dq.dt: laju difusiD: koefisien difusiK: koefisien partisiA: luas permukaan membranh: tebal mebranCGi-CP: perbedaan antara konsentrasi obat dalam sal cerna dan dalam plasma.(Shargel, 2005).Usus halus adalah organ terpanjang (4-5 m) dan fungsi utamanya digunakan sebagai tempat absorpsi (Aulton, 2001).Struktur asam salisilat

Kelarutan asam salisilat : larut dalam air dan benzene; mudah larut dalam etanol dan dalam eter, larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam kloroform (Anonim, 1995).

C. ALAT BAHANALAT : Tabung Crane dan Wilson (modifikasi bengkel USD) 1

Spektrofotometer Visible Waterbath Neraca analitik Alat bedah Alat-alat gelas Sentrifugasi Tabung sentrifugasi

BAHAN : Cairan lambung buatan tanpa pepsin (pH 1,2) Cairan usus buatan tanpa prankeatin (pH 7,5) Tikus putih jantan Larutan NaCl 0,9% Asam salisilat Eter Gas oksigen Alkohol Reagen thrinder

D. SKEMA KERJA

a. Pembuatan larutan stok asam salisilatPembuatan larutan stok asam salisilat konsentrasi 0,1% sebanyak 10 ml (dilarutkan menggunakan NaCl 0,9%)

b. Pembuatan kurva bakuDari larutan stok dibuat larutan intermediet 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07 mg/ml

Encerkan dengan larutan serosal (NaCl 0,9 %) sampai 10 ml

Pipet 4,2ml larutan intermediet di atas dan masukkan dalam tabung reaksi

Tambahkan 1 ml reagen thrinder

lalu divortex dan didegassing selama 5 menit

diamkan 10 menit (operating time) dan ukur absorbansinya pada 527 nm

Cari persamaan regresinya

c. Penentuan absorbsi asam salisilat in vitroTikus dipuasakan selama 20-24 jam hanya diberi minum air masak ad libitium

pada hari percobaan tikus dikorbankan, bius dengan eter, perut tikus dibuka sepanjang linea mediana dan usus dikeluarkan serta dibersihkan

usus sepanjang 15 cm di bawah pilorus dibuang dan diambil 20 cm selanjutnya dari usus yang sama untuk percobaan (usus perlakuan)

usus dibagi sama panjang, dibersihkan dan bagian anal dijadikan kontrol

ujung anal diikat dengan benang kemudian dengan menggunakan batang lidi usus dibalik sehingga bagian mukosa berada di bagian luar

kanula dimasukkan ke ujung oral (bagian yang tidak diikat)

usus diukur dengan panjang efektif 7 cm yang sebelumnya diisi dengan cairan serosal 1,5 ml larutan NaCl 0,9% b/v

kantong usus yang telah berisi cairan serosal ini dimasukkan dalam tabung yang sudah berisi cairan mukosal 50ml cairan lambung buatan pH 1,2 dan pH 7,5 yang mengandung asam salisilat

Cairan mukosal dibuat dengan cara :0,25 gram asam salisilat + sedikit etanol,diencerkan dengan cairan lambung ( pH 1,2)0,25 gramasam salisilat + sedikit etanol,diencerkan dengan cairan usus ( pH 7,5)

Suhu percobaan dilakukan pada 370C dan aliran gas oksigen berkecepatan 100 gelembung per menit

kontrol percobaan diperlakukan sama tetapi tanpa asam salisilat dalam cairan mukosal

selama percobaan seluruh bagian usus harus terendam dalam cairan mukosal

kadar obat dalam cairan serosal diukur pada 15, 30, 45, dan 60 menit

Caranya : seluruh cairan serosal diambil melalui kanula dan segera dicuci 2 kali dengan 1,4 ml larutan NaCl 0,9% b/v

cairan serosal dikumpulkan dan sentrifugasi selama 5 menit

Caranya : sampel diambil pada bagian supernatan pada volume sama (2,5 ml) lalu ditambah 1 ml reagen Thinder

Vortex 1 menit, tunggu selama OT dan baca absorbansi pada maks

Kontrol juga diperlakukan sama namun tanpa asam salisilat dalam cairan mukosal

E. DATA1. Pembuatan Larutan Stok Asam SalisilatPenimbangan stokDilakukan penimbangan 10 mg asam salisilat, ad 10 ml NaCl 0,9% b/vKonsentrasi stok

C = = 1 mg/ml

2. Perhitungan Kurva Baku Pembuatan larutan seriKonsentrasi 0,02 mg/mlC1 x V1 = C2 x V21 mg/ml . V1= 0,2 mg/mlV1= 2 ml

Konsentrasi 0,03 mg/ml1 mg/ml x V2 =0,3 mg/ml x 10 mlV2= 3 ml

Konsentrasi 0,04 mg/ml1 mg/ml x V3 =0,4 mg/ml x 10 mlV3= 4 ml

Konsentrasi 0,05 mg/ml1 mg/ml x V4 =0,5 mg/ml x 10 mlV4= 5 ml

Konsentrasi 0,06 mg/ml1 mg/ml x V5 =0,6 mg/ml x 10 mlV5= 6 ml

Konsentrasi 0,07 mg/ml1 mg/ml x V6 =0,7 mg/ml x 10 mlV6= 7 ml

Absorbansiblangkoabsorbansi

0,20,213

0,30,268

0,40,391

0,50,448

0,60,479

0,70,505

A = 0,107B = 6,143r = 0,968 y = Bx + Ay = 6,143x + 0,107

3. pH 1,2 (Lambung)

tAbsorbansiKonsentrasiQQ kumK

(menit)PerlakuanKontrolPerlakuanKontrolTerkoreksi

150,8920,7520,1280,1050,0230,09890,4945

301,7060,9080,2600,1300,1300,5592,7950,245

451,9991,0160,3080,1480,1600,6883,44

Perhitungan konsentrasiY = 6,143x + 0,107

PerlakuanKontrol

T= 15 menitY = 6,143x + 0,1070,892 = 6,143x + 0,107X = 0,128 mg/mL

T= 15 menit Y = 6,143x + 0,107 0,752 = 6,143x + 0,107X = 0,105 mg/ml

T= 30 menitY = 6,143x + 0,1071,706 = 6,143x + 0,107X = 0,260 mg/mL

T= 30 menitY = 6,143x + 0,107 0,908 = 6,143x + 0,107X = 0,130 mg/mL

T= 45 menitY = 6,143x + 0,1071,999 = 6,143x + 0,107X = 0,308 mg/mL

T=45 menitY = 6,143x + 0,107 1,016 = 6,143x + 0,107X = 0,148 mg/mL

C terkoreksi = C terukur C controlQ = C x 4,2Q kumulatif = Q1 + Q2 + Q3 + .Regresi waktu vs Q kum A = - 0,7023B = 0,098r = 0,951 y = Bx + A = 0,098 x- 0,7023

Koefisisn Permeabilitas Membran (K)

0,098 = K . 2,5 K = 0,245 mL/menit

Lag time Lag time memtotong sumbu x (y=0)y = 0,098 x- 0,70230 = 0,098 x- 0,7023x = 7,166Lag time untuk absorpsi asam salisilat di lambung yaitu selama 7,166 menit.

4. pH 7,5 (Usus)

tAbsorbansiKonsentrasiQQ kumK

(menit)PerlakuanKontrolPerlakuanKontrolTerkoreksi

151,1631,1720,1720,173-0,001-0,0043-0,0215

301,9990,3620,3080,0410,2671,14815,74050,016

450,7400,3940,1030,0470,0560,24081,204

Perhitungan konsentrasiY = 0,614x + 0,107

PerlakuanKontrol

T=15Y = 6,143x + 0,1071,163 = 6,143x + 0,107X = 0,172 mg/mLT=15Y = 6,143x + 0,107 1,172 = 6,143x + 0,107X = 0,173 mg/ml

T=30Y = 6,143x + 0,1071,999 = 6,143x + 0,107X = 0,308 mg/mLT=30Y = 6,143x + 0,107 0,362 = 6,143x + 0,107X = 0,041 mg/mL

T=45Y = 6,143x + 0,1070,740 = 6,143x + 0,107X = 0,103 mg/mLT=45Y = 6,143x + 0,107 0,394 = 6,143x + 0,107X = 0,047 mg/mL

Regresi waktu vs Q kum A = 1,082B = 0,040845r = 0,202 y = Bx + A = 0,040845x + 1,082

Koefisien Permeabilitas Membran (K)

0,040845 = K . 2,5 K = 0,016 mL/menit

Lag time Lag time memtotong sumbu x (y=0)y = 0,040845x + 1,0820 = 0,040845x + 1,082x = -26,49 = 26,49Lag time untuk absorpsi asam salisilat di lambung yaitu selama 24,49 menit.

F. PEMBAHASANTujuan praktikum kali ini adalah untuk mengetahui mekanisme absorbsi sautu obat dalam saluran pencernaan, mengetahui pengaruh pH terhadap absorbsi obat dengan menggunakan rumus Handerson-Hasselbach, membuat grafik hubungan antara jumlah kumulatif obat yang ditranspor sebagai fungsi dari waktu, serta dapat membuat grafik hubungan antara jumlah kumulatif obat yang ditranspor sebagai fungsi waktu. Ada 3 metode yang dapat digunakan untuk melihat proses absorpsi obat di dalam saluran pencernaan. Metode tersebut antara lain: metode in vivo, in vitro dan in situ. Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode in vitro. Metode in vitro adalah metode yang dilakukan dengan menggunakan organ tubuh subjek uji tetapi dilakukan di luar tubuh subjek uji. Kondisi di luar tubuh subjek uji harus menyerupai kondisi seperti di dalam tubuh subjek uji. Subjek uji yang digunakan adalah tikus jantan dan organ tubuh yang digunakan adalah usus halus. Tikus jantan digunakan karena untuk mengurangi adanya barrier yang mempengaruhi absorbsi obat akibat aktivitas hormone. Usus halus digunakan karena mempunyai banyak vili sehingga luas permukaannya juga besar. Dengan luas permukaan yang besar, maka memungkinkan jika proses absorpsi berjalan dengan cepat. Pada praktikum ini, usus halus dilakukan dengan menggunakan metode usus terbalik. Metode usus terbalik adalah suatu metode yang dilakukan dengan cara membalik usus sehingga bagian dalam usus yang mengandung mikrovili berada di luar. Membrane mukosa akan tetap mendapatkan oksigen sehingga proses absorpsi yang terjadi menyerupai proses absorpsi di dalam tubuh. Sebelum percobaan, subjek uji dipuasakan 24 jam untuk menjaga kondisi usus apabila terdapat sisa makanan yang akan mempengaruhi pH membrane. Subjek uji dibunuh dengan cara dibius dengan eter dan kemudian dibedah untuk diambil ususnya. Pembedahan dilakukan secara hati-hati untuk menghindari rusaknya usus karena alat bedah. Usus yang diperoleh dibersihkan dari kotoran-kotoran yang ada dengan NaCl dan direndam agar fungsi fisiologisnya tetap berjalan. Usus yang digunakan adalah usus yang berada 15 cm dibawah bagian pylorus, dipotong sepanjang 15 cm karena pada bagian ini proses absorpsi yang teradi maksimal. Sedangkan 20 cm sesudahnya yang digunakan untuk uji karena kemampuan terjadinya kontaminasi usus oleh cairan lambung sangat kecil sehingga dapat mengabsorbsi obat secara maksimal. Usus sepanjang 20 cm ini dibagi 2. Bagian 10 cm pertama digunakan untuk perlakuan dengan cairan lambung, sedangkan bagian 10 cm kedua digunakan untuk perlakuan dengan cairan usus. Pemotongan usus ini harus dilakukan dengan cepat. Usus yang telah terpotong harus segera dimasukkan kedalam cairan fisiologis agar usus tidak rusak. Apabila usus rusak maka usus tidak dapat menghasilkan ATP sehingga usus menjadi rusak.Usus kemudian dibalik dengan bagian mukosa berada di luar dan diikatkan pada pipa gelas secara vertikal dengan menggunakan benang. Pada bagian mukosa inilah terjadi penyerapan oleh villi sehingga diusahakan sesedikit mungkin kontak dengan mukosa. Pada usus perlakuan diisi dengan cairan lambung tanpa pepsin dan cairan usus buatan tanpa pankreatin dan diberi asam salisislat, sedangkan untuk control diisi dengan cairan yang sama namun tanpa diberi asam salisislat. Sebelum digunakan cairan fisiologis buatan dialiri oksigen selama kurang lebih 30 menit sambil direndam dengan es. Tujuannya yaitu untuk menghasilkan oksigen lebih banyak dan oksigen yang dihasilkan dapat terikat pada cairan fisiologis buatan. Pada percobaan untuk mencegah kejenuhan cairan serosal dalam cairan usus maka cairan serosal dikeluarkan setiap 15 menit dan dicuci sebanyak 2 kali dengan larutan serosal (NaCl 0,9%). Pencucian ini juga dimaksudkan untuk mengambil sisa-sisa obat yang telah diabsorbsi yang mungkin masih tertinggal di dalam usus. Hal ini dilakukan sampai menit ke-45. Setelah pengambilan cairan didalam usus, usus kemudian diisi lagi dan dimasukkan kemabli kedalam waterbath.Untuk preparasi dengan menggunakan usus ini sebaiknya tidak dilakukan lebih dari 2 jam. Sebab jika lebih dari 2 jam maka usus sudah rusak sehingga hasil yang didapatkan tidaklah akurat. Cairan serosal yang didapatkan kemudian disentrifuge untuk mengendapkan pengotor dan kemudian diambil supernatant dari cairan serosal tersebut. Cairan serosal berfungsi untuk memfasilitasi asam salisilat yang masuk ke dalam usus. Supernatant kemudian ditambahkan dengan reagen thrinder dan dibaca absorbsinya pada panjang gelombang hasil optimasi yaitu 527 nm. Fungsi dari reagen Thrinder ini adalah sebagai pembentuk kompleks warna ungu dengan menghasilkan FeCl3 yang akan bereaksi dengan gugus fenolik dari asam salisilat. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:

Pada percobaan ini dilakukan penggantian cairan serosal selama 45 menit dengan selang waktu 15 menit yang bertujuan untuk tetap menjaga usus berada dalam kondisi sink. Secara normal dalam tubuh akan terjadi kondisi sink, karena darah telah mengabsorbsi obat terdistribusi secara merata ke dalam seluruh jaringan tubuh dan darah pada daerah yang mengabsorbsi obat akan diganti dengan darah baru yang belum mengabsorbsi obat. Transport yang terjadi pada usus ini adalah secara difusi pasif dari konsentrasi tinggi ke rendah dengan melewati memberan semipermiabel. Dalam percobaan ini maka obat asam salisilat dari cairan mukosa diabsorbsi ke dalam cairan serosal. Difusi pasif mengalami kesetimbangan bila jumlah obat yang menembus memberan luar sama dengan jumlah obat yang menembus membran dalam.Koefisien permeabilitas (P) dihitung untuk mengetahui besarnya permeabilitas membran asam salisilat terhadap membran pada pH lingkungan yang berbeda. Nilai P berbanding lurus dengan slope dan karena nilai Cg tetap maka P tergantung slope. Semakin besar nilai P maka permeabilitas membran terhadap obat juga semakin besar sehingga molekul obat yag terabsorbsi oleh membran semakin besar. Jika slope semakin besar maka P juga semakin besar. Semakin besar harga P maka permeabilitas membran terhadap obat semakin besar sehingga semakin banyak molekul obat yang bisa melewati membran. Jadi, jika lebih bersifat permeabel maka molekul asam salisilat semakin banyak yang terabsorbsi.Ketetapan penetrasi yang tinggi belum tentu baik, bisa juga mengindikasikan adanya kerusakan usus apa lagi, usus merupakan organ yang sangat rapuh. Tapi jika indeks defiasinya mendekati berarti penetapan penetrasinya baik.

pH = pKa + log Asam salisilat adalah obat yang bersifat asam lemah. Dari persamaan Handerson-Hasselbach di atas,maka obat yang bersifat asam lemah akan banyak teraborpsi pada pH lingkungan yang rendah (asam), karena pada pH rendah (pH lambung), asam salisilat akan berada dalam bentuk molekul lebih banyak dibandingkan bentuk ionnya. Bentuk molekul lebih bersifat non polar dibandingkan dengan bentuk ion. Oleh karena itu bentuk molekul tersebut lebih mudah diabsorpsi. Membrane yang dimaksud adalah membran yang terdiri dari fosfolipid bilayer. Apabila asam salisilat berada dalam pH lingkungan yang tinggi (sekitar pH usus),maka asam salisilat lebih banyak berada dalam bentuk ion daripada bentuk molekul. Akibanya asam salisilat lebih sedikit diabsorpsi di usus halus. Mekanisme absorpsi obat asam salisilat terjadi secara difusi pasif. Pada difusi pasif terjadi perpindahan obat saat kondisi sink. Kondisi sink yaitu kondisi di mana konsentrasi obat di dalam saluran pencernaan (Cg) lebih besar daripada konsentrasi obat dalam pembuluh darah (Cb). Kondisi sink tercapai apabila sirkulasi darah yang berjalan terus-menerus sehingga selalu sehingga menyebabkan terjadinya gradien kadar.Lag time merupakan penundaan waktu absorbsi sebelum permulaan absorbsi obat orde pertama atau waktu yang dibutuhkan obat untuk diabsorbsi menembus membran. Tujuan dari penentuan lag time adalah untuk mengetahui pada menit keberapa obat mulai diabsorbsi, makin lama lag time maka obat semakin lama untuk diabsorbsi. Menurut persamaan HandersonHasselbach, seharusnya asam salisilat dalam pada pH 1,2 lebih banyak berada dalam bentuk molekul dari pada bentuk ion sehingga obat semakin mudah terabsorbsi dan menembus membran. Secara teoritis, konsentrasi asam salisilat di dalam lambung lebih tinggi daripada di dalam usus, karena absorpsi asam salisilat di lambung lebih besar daripada di usus. Asam salisilat di dalam usus (pH 7,5) akan berada dalam bentuk ion sehingga sulit untuk diabsorpsi. Hal ini dikarenakan bentuk ion hanya memiliki satu sisi sehingga sulit untuk menembus membran. Dari data didapatkan hasil bahwa jumlah obat yang diabsorpsi (Qkumulatif) asam salisilat pada kondisi pH cairan lambung buatan yaitu sebesar 3,44 mg, sedangkan Qkumulatif asam salisilat pada kondisi pH cairan usus buatan yaitu sebesar 1,204 mg. Hal ini menunjukkan bahwa absorpsi asam salisilat di cairan mukosal lambung lebih besar dibandingkan di cairan mukosal usus. Dari hasil percobaan didapatkan persamaan antara waktu (t) vs jumlah kumulatif asam salisilat dalam cairan lambung (pH= 1,2) yaitu y = 0,098 x- 0,7023, sedangkan persamaan antara waktu (t) vs jumlah kumulatif asam salisilat dalam cairan usus (pH= 7,5) yaitu y = 0,040845x + 1,082. Persamaan ini digunakan untuk menentukan lag time. Lag time pada lambung yaitu selama 7,166 menit dan lag time pada usus yaitu selama 26,49 menit. Data tersebut menunjukkan bahwa absorpsi obat di lambung lebih cepat dibandingkan di usus. Nilai K (tetapan permeabilitas) di cairan mukosal lambung yaitu sebesar 0,245 mL/menit, sedangkan di cairan mukosal usus yaitu sebesar 0,016 mL/menit. Hal ini menunjukkan bahwa permabilitas obat terhadap membran di cairan mukosal lambung lebih besar dibandingkan di cairan mukosal usus. Hal ini disebabkan karena obat (asam salisilat) di dalam cairan mukosal lambung berada dalam bentuk molekul lebih banyak sehingga lebih mudah menembus membran dibandingkan jika obat (asam salisilat) berada di dalam cairan mukosal usus.

G. KESIMPULAN1. Proses aborpsi obat di dalam saluran pencernaan terjadi secara difusi pasif. 2. Absorpsi asam salisilat di cairan mukosal lambung lebih cepat terjadi dibandingkan di cairan mukosal usus. 3. Jumlah asam salisilat yang diabsorpsi (Qkumulatif) pada cairan lambung buatan (pH 1,2) yaitu 3,44 mg, sedangkan Qkumulatif asam salisilat pada cairan usus buatan (pH 7,5) yaitu 1,204 mg. 4. Lag time pada cairan mukosal lambung buatan (pH=1,2) lebih cepat dibandingkan dengan lag time pada cairan mukosal usus buatan (pH = 7,5)5. Permeabilitas dinding usus menggunakan cairan mukosal lambung buatan lebih besar daripada permeabilitas dinding usus menggunakan cairan mukosal usus.

Yogyakarta, 23 Mei 2011

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 51, Departemen Kesehatan Indonesia, JakartaAulton, 2001, Pharmaceutics The Science of DosageForm Design, 2nd edition, 273, Churchill, LivingstoneShargel, L., 2005, Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan, Edisi 2, 85-85, 87-88, 99, Universitas Airlangga, SurabayaGoodman & Gilman's, 2006, The Pharmalogical Basis of Therapeutics, 11th Ed, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA