laporan praktikum biomol 1

8/16/2019 Laporan Praktikum Biomol 1

1/32

PENDAHULUAN

Sebuah sampel biologis dapat diperoleh dari suatu tindak kejahatan dalam

bentuk darah atau noda air mani atau darah segar dari seorang tersangka yang berisi

beberapa unsur di samping DNA. Molekul DNA harus dipisahkan dari materi sel lain

sebelum diuji. Sel-sel protein terbungkus melindungi DNA di dalam lingkungan sel

dapat menghalangi kemampuan analisa DNA. Sementara itu metode ekstrasi DNA

dapat dikembangkan untuk memisahkan protein-protein dan materi sel-sel yang lain dari

molekul-molekul DNA. Sebagai tambahan kuantitas dan kualitas DNA sering perlu

diukur sebelum kelanjutan lebih lanjut dengan prosedur analitis untuk memastikan hasil

yang optimal. Ada tiga teknik utama yang digunakan saat ini untuk ekstrasi DNA pada

laboratorium forensik DNA: ektraksi organik, ekstraksi Chele, dan !"A paper #gambar

$.%&. 'kstraksi eksak atau masam-ma(am prosedur isolasi DNA tergantung pada bukti-

bukti tipe biologis yang akan diuji. Sebagai (ontoh darah utuh harus diperlakukan

dengan (ara yang berbeda dari suatu noda darah atau suatu fragmen tulang.

'kstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi )at asam karbol

(holoform, telah digunakan untuk *aktu yang lama dan mungkin telah digunakan untuk

situasi di mana baik +! atau C+ dilakukan. obot molekular tinggi DNA, yang

mana penting bagi metoda +!, mungkin diperoleh se(ara paling efektif dengan

ekstraksi organik.

Metoda Chele dari ekstraksi DNA lebih (epat dibandingkan dengan metode

ekstraksi organik. Sebagai tambahan, metoda Chele membutuhkan lebih banyak

langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke

sampel. agaimanapun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses

ekstraksi dan oleh karena itu hanya yang bermanfaat untuk prosedur pengujian yang

berbasis C+.

Semua (ontoh harus se(ara hati-hati ditangani dengan mengabaikan metoda

ekstraksi DNA untuk menghindari pen(emaran sampel ke sampel atau pengenalan

1


2/32

tentang tambahan DNA. roses ekstraksi memungkinkan di mana (ontoh DNA jadi

lebih peka pada pen(emaran di laboratorium dibanding pada *aktu lain dalam proses

analisa forensik DNA. Dengan suatu alasan laboratorium-laboratorium biasa

memproses sampel-sampel petunjuk pada *aktu yang berbeda dan kadang-kadang

dengan loksi yang tidak sama dari dimana sampel tersebut diambil.

Metoda yang populer untuk persiapan pengambilan referensi sampel adalah

dengan menggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal

dengan suatu (arikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira % (m / pada kain kapas

tersebut, dengan rata-rata 01.111-21.111 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata

311ng DNA genomi(. 4asil nyata akan ber5ariasi dengan jumlah sel-sel darah putih

yang akan menunjukkan sampel dan efisiensi proses ekstraksi DNA.

2


3/32

6ambar $.% Skema yang biasa digunakan untuk proses ekstrasi DNA

'kstraksi DNA disimpan se(ara khusus pda suhu -/1oC, atau bahkan pada suhu

-21oC pada penyimpanan dalam *aktu lama, untuk menjaga aktifitas inti. Nu(leas-

3


4/32

nu(leas adalah en)im-en)im #protein& yang diketemukan di dalam sel-sel turunan DNA

untuk memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-komponen nu(leotide.

Nu(leases memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik sehingga salah satu

pengujian untuk men(egah mereka dari men(erna DNA di dalam darah adalah

menggunakan tabung purple-topped yang berisi bahan penga*et darah yang dikenal

sebagai 'D"A. 'D"A meliputi, atau membalut, semua magnesium bebas dengan begitu

men(egah nu(leases menhan(urkan DNA di dalam (ontoh darah yang dikumpulkan.

EKSTRAKSI ORGANIK (PHENOL-CLOROFORM)

'kstraksi organik melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. ertama,

sodium Dodecylsulfate #SDS& dan Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka

dinding sel sepanjang protein yang melindungi molekul DNA selagi mereka ada di

dalam kromosom. Selanjutnya (ampuran phenol/cloroform ditambahkan untuk

memisahkan protein dari DNA. DNA menjadi lebih dapat larut di dalam air yang

mengandung (ampuran organic-aqueous. 7etika proses sentrifuge, bekas peninggalan

protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari tahap yang mengandung air

dan menggandakan molekul DNA sehingga dapat ditransfer dengan baik untuk

dianalisa. eberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 #Millipore, illeri(a,

MA& dan konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme

inhibitors #Comey et al %889&. Sementara metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk

recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini adalah *aktu menggunakan bahan

kimia yang penuh resiko dan memerlukan (ontoh untuk ditransfer antara banyak tabung

#faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi&

PROSES PENARIKAN CHELEX

Sebuah prosedur alternatif untuk penarikan DNA yang telah terkenal dikalangan

ahli forensik adalah penggunaan dari suspensi resin kombinasi yang dapat ditambahkan

langsung pada sampel #misalnya, darah, ber(ak darah, atau semen&. Diperkenalkan

kepada komunitas forensik DNA pada tahun %88%, (hele+ %11 #ab io-+ad,

4


5/32

4er(ules, CA& adalah pertukaran ion resin yang ditambahkan sebagai suspensi pada

beberapa sampel #alsh et.al .%88%&. (hele terdiri dari styrene di5inylben)ene

(opolimers mengandung sepasang ion iminodia(etate yang bereaksi sebagai grup-grup

kombinasi dalam ikatan ion metal poli5alen seperti magnesium. Serupa dengan

pengisian besi untuk menjadi sebuah magnet, beberapa ion magnesium tertarik dan

terlempar keatas. Dengan memindahkan magnesium dari reaksi tersebut, DNA

menghan(urkan en)im-en)im dikenal sebagai nukleus yang tidak diaktifkan dan

molekul-molekul DNA yang terlindungi.

ada sebagian besar protokol, sampel biologis seperti ber(ak darah ditambahkan

sampai dengan 3; suspensi (hele dan dididihkan selama beberapa menit untuk

meme(ah sel-sel dan melepaskan DNA. Sebuah permulaan, langkah pen(u(ian

sebelumnya sangat membantu untuk menghilangkan kontaminasi dan hambatan yang

mungkin timbul seperti heme dan beberapa protein #illard et.al . %882&. emanasan

sampai temperatur %111 C meme(ahkan DNA protein sel sama seperti menga(aukan

membran sel dan menghan(urkan protein sel setelah pemusingan didalam mesin

sentrifuse untuk mendorong resin (hele dan sisa-sisa selular kedasar tabung reaksi,

(airan bagian atas setelah proses pengendapan dihilangkan dan dapat ditambahkan

langsung ke reaksi pengerasan C+.

roses penarikan (hele untuk melindungi DNA dari ber(ak darah atau semen

yang mengandung ber(ak tidak efektif untuk +! karena (hele meme(ahkan DNA

rantai ganda dan lapangan rantai tunggal DNA dari proses pemisahan.


6/32

enambahan darah utuh yang terlalu banyak atau ber(ak darah yang terlalu besar

pada solusi pelepasan (hele dapat menghasilkan beberapa penghanbatan C+. "he

AM!=S"+ kit direkomendasikan se(ara manual $ ul darah utuh atau ber(ak darah

kurang lebih $ mm $ mm #Applied iosystem %882&.

KERTAS FTA

endekatan lain dari pemisahan DNA melibatkan penggunaan kertas !"A"M.

ada akhir tahun %821an, kertas !"A"M dikembangkan oleh ee urgoyne di>ni5ersitas

!linders diAustralia sebagai suatu metode untuk penyimpanan DNA #urgoyne et.al.%889&. !"A"M adalah suatu kertas untuk penyerapan sellulosa dasar yang mengandung

empat substansi kimia untuk melindungi molekul DNA dari penurunan nuklease dan

melindungi kertas dari pertumbuhan bakteri #urgoyne %88?&. 4asilnya, DNA pada

kertas !"A"M stabil pada suhu kamar selama periode beberapa tahun. Meskipun

demikian, beberapa studi e5aluasi !"A"M dan tiga kertas komersial lainnya sebagai

media penyimpanan DNA menemukan sedikit perbedaan dalam kemampuan masing-

masing untuk men(apai hasil typeable S"+ setelah penyimpanan selama %8 bulan.

#7line et.al. /11/&.

engunaan kertas !"A sederhana meliputi penambahan sebuah ber(ak darah

kedalam kertas dan memudahkan noda untuk kering. Sel-sel menjadi lisis pada saat

kontak dengan kertas dan DNA dari sel darah merah tidak dapat dipindahkan dalam

susunan dari kertas tersebut. otongan ke(il kertas yang dipindahkan dari ber(ak darah

kartu !"A dan ditempatkan kedalam tabung untuk di(u(i. DNA yang terlempar dapat

dibersihkan dengan (ara men(u(inya dengan (airan pelarut untuk membersihkan heme

dan penghambat lainnya dari reeaksi C+. embersihan potongan kertas ini dapat

terlihat se(ara 5isual karena pada saat kertas di(u(i, *arna merah menghilang disertai

dengan (airan pada bagian atas setelah pengendapan. otongan bersih kemudian

ditambahkan se(ara (ermat kereaksi C+. ilihan lain, beberapa grup telah melakukan

proses penarikan (hele diatas potongan kertas !"A dan telah menggunakan (airan pada

6


7/32

bagian atas setelah pengendapan didalam reaksi C+.#orente et.al . %882, kline et.al.

/11/&

7euntungan besar dari !"A adalah hasil yang konsisten mungkin didapat tanpa

perhitungan. Selanjutnya prosedur dapat se(ara otomatis didalam roboti( *orkstation

#elgrader dan Marino %880&. ada situasi-situasi dimana multipel assay dibutuhkan

untuk dilarikan pada (ontoh yang sama, potongan ber(ak darah dapat digunakan ulang

untuk susunan pengerasan DNA dan penggolongan #Del +io et.al. %88?&. >ntungnya,

potongan-potongan kertas kering tidak suka berdiam didalam tabung-tabung yang telah

diberikan dan sepanjang listrik statis dapat melompat antara *ells didalam tempat

sampel.


8/32

Sementara masing-masing metode efektif dalam mengekstraksi sampel-sampel DNA,

para ahli forensik tetap se(ara tradisional mengandalkan $ metode utama, yaitu:

ekstraksi organik, ekstraksi (hele, dan kertas !"A.


9/32

Dua inhibitor C+ yang biasanya ditemukan pada kasus forensik adalah

hemoglobin dan ber(ak biru dari bahan denim. Melanin yang ditemukan pada sampel

rambut dapat menjadi sumber penghambatan C+ ketika men(oba memperkuat DNA

dari mitokondria. nhibitor-inhibitor ini (enderung mengikat sisi aktif "aB DNA

polymerase dan juga men(egah fungsi ketika proses amplifikasi DNA.

DNA mengalami degradasi melalui berbagai mekanisme termasuk se(ara

en)imatik dan se(ara kimia*i #indahl %88$&. 7etika sel atau organisme mati, molekul

DNA-nya mengalami (ellular nu(leases yang diikuti dengan pen(emaran bakteri, jamur

dan serangga yang bergantung pada kondisi lingkungan #oinar /11$&. Selain itu

peme(ahan hydrolyti( dan kerusakan oksidatif dasar dapat membatasi keberhasilan

penyelidikan dan amplifikasi DNA. "ujuan utama dari peme(ahan hydrolyti( adalah

pengikatan gula gly(osidi( dan peme(ahan ini mengarah pada penghilangan inti sel.

'fesiensi amplifikasi C+ akan berkurang atau bahkan gagal jika sejumlah molekul

DNA sampel biologis pe(ah di daerah dimana penguatan primers atau antara for*ard

dan re5erse primers. @leh karena itu panas dan kelembaban yang memper(epat

peme(ahan hydrolyti( adalah musuh dari DNA yang utuh. 7emudian radiasi > #sinar

matahari langsung& dapat menyebabkan hubungan silang dari nukleus "imin pada

molekul DNA. 4al ini pada akhirnya men(egah polimerase C+.

6una memastikan bah*a DNA yang diperoleh dari ekstraksi manusia lebih

banyak dibandingkan sumber lainnya seperti bakteri, De*an enasehat DNA

mengisyaratkan standar 8,$ kuantitas DNA tertentu manusia #ihat ampiran &.

"etapi DNA dalam (ontoh yang telah dipisahkan, kuantitas dan kualitasnya dapat

dinilai se(ara layak. "erhadap hampir semua pengujian berbasis C+, determinasi

jumlah DNA dalam suatu (ontoh penting, karena rangkaian konsentrasi yang sempit

bekerja dengan sangat baik. Sebagai (ontoh, 7it-kit S"+ multiple yang diterapkan

Cofiler dan rofiler iosistem plus, untuk hasil-hasil optimal menetapkan tambahan

diantara %-/3 ng DNA template #Applied iosystems %882&. Didalam rangkaian

konsentrasi DNA serupa, kit-kit romega S"+ juga bekerja dengan sangat baik

.


10/32

#7renke dan rekan, /11/&. egitu banyak DNA dapat mengakibatkan pun(ak-pun(ak

atau pun(ak terpisah yang diluar skalaE untuk teknik pengukuran #lihat ab ?&.

egitu sedikit template DNA dapat mengakibatkan allele drop-outE , karena reaksi-

reaksi C+ gagal mengintensifkan DNA. "erkadang fenomena ini disebut dengan

fluktuasi sto(hasti( #lihat ab 9&.

Se(ara tipikal metode-metode a*al kuantitas DNA melibatkan penyerapan

pada panjang gelombang /?1 nm atau pemijaran setelah penandaan gel hasil dengan

ethidium bromide. Sayangnya, karena pendekatan-pendekatan ini tidak sangat peka,

mereka menggunakan (ontoh-(ontoh forensik berharga yang tidak tidak dapat

diganti. Selain itu, pengukuran-pengukuran penyerapan tidak khusus untuk DNA dan

yang men(emari protein-protein atau phenol yang tersisa dari prosedur ekstraksi

dapat memberikan sinyal-sinyal tinggi yang palsu.

>ntuk mengatasi masalah-masalah ini, untuk tujuan-tujuan kuantifikasi DNA,

beberapa metode telah dikembangkan. ni men(akup prosedur slot blot dan

pengujian-pengujian plat mikrotiter berbasis pemijaran, selain juga apa yang disebut

pendekatan-pendekatan C+ kuantitatif atau real-timeE. aru-baru ini dipublikasikan

ulasan yang bagus tentang berbagai metode kuantifikasi DNA #Ni(klas dan uel

/11$b&.

KUANTIFIKASI SLOT BLOT

Mungkin metode-metode yang sangat umum digunakan didalam laboratorium-

laboratorium saat ini untuk kuantifikasi DNA genomik adalah apa yang disebut prosedur slot blotE. "es ini khusus untuk DNA manusia dan primata lainnya akibat

probe pasangan #bp& basis 91 yang merupakan pelengkap bagi rangkaian DNA

satelit alpha khusus primata D%0/% yang terletak pada kromosom %0 #aye dan

rekan,%828, alsh dan rekan, %828&. engujian slot blotE pertama-tama diuraikan

dengan probe-probe radio aktif #aye dan rekan, %828&, tetapi selanjutnya

10


11/32

dimodifikasi dan diperdagangkan dengan format-format (hemilumines(ent atau

kalori meter #alsh dan rekan, %88/&.

Slot blot melibatkan penangkapan DNA genomik pada serat nilon yang

dilanjutkan dengan penambahan probe khusus manusia. ntensitas-intensitas sinyal

Chemilumines(ent atau kalori meter dibandingkan diantara rangkaian standar dan

(ontoh-(ontoh #6ambar $.$&.

Gambar . !lustrasi hasil Kuantitas D"# manusia dengan prosedur $lot %lot. Dilusi berturut-turut

standar manusia dila&sana&an pada salah satu sisi selaput $lot %lot untu& tu'uan perbandingan.

Kuantitas masing-masing contoh yang tida& di&etahui diper&ira&an oleh perbandingan visual dengan

standar. Kalibrasi sebagai contoh( sampel yang diindi&asi&an oleh ana& panah. $angat de&at dengan

tampilan standar )(* ng

7uantitas slot blot adalah pengukuran relatif yang melibatkan perbandingan

(ontoh- (ontoh yang tidak diketahui dengan rangkaian standar yang biasanya

dipersiapkan melalui dilusi berurutan dari (ontoh konsentrasi DNA yang tidak

diketahui. Sementara perbandingan standar-standar DNA dan (ontoh-(ontoh tidak

diketahui pada selaput slot blot sering dilakukan se(ara 5isual dan oleh karenanya

dipengaruhi oleh subyektifitas pengamat, penangkapan digital dan bayang-bayang

11


12/32

kuantifikasi slot blot telah diperlihatkan dengan sistem pen(itraan kamera CCD

#(harged-(oupled di5i(e& #udo*le dan rekan /11%&.

Se(ara tipikal kira-kira $1 (ontoh dites pada selaput slot blot dengan (ontoh-

(ontoh standar ?-2 yang disimpan pada masing-masing sisi selaput untuk tujuan-

tujuan perbandingan. Sebagai (ontoh, standar dapat menjadi penipisan rangkaian

DNA manusia yang dimulai dengan /1 mg, %1 ng, 3 ng, /,3 ng dan seterusnya. >ntuk

tujuan tes kuantifikasi ini se(ara tipikal hanya 3 ul etrak DNA digunakan.

>ntuk melakukan pengetesan dibutuhkan *aktu beberapa jam tetapi agak pekakarena dapat mendeteksi DNA yang berekor tunggal dan DNA yang berekor ganda

turun ke tingkat kira-kira %31 pg atau kira-kira 31 salinan DNA genomik manusia.

Standar DNA %31 pg dapat terdeteksi hanya setelah %3 menit pengungkapan lapisan

sinar F #alsh dan rekan, %88/&. Dengan pendeteksi (hemilumins(ent , kepekaan

dapat diperluas diba*ah %31 pg dengan melakukan pengungkapan yang lebih lama

ke lapisan sinar F dan mem-blot standar-standar DNA dilusi rendah tambahan pada

selaput. "ingkat-tingkat %1-/1 pg telah dilaporkan dengan pengungkapan tiga jam

#alsh dan rekan, %88/&. un jika hasil-hasil tidak terlihat dengan pengujian

hibridisasi ini, sejumlah ahli ilmu forensik masih tetap dengan pengetesan DNA dan

sering memperoleh profil S"+ yang berhasil. Dengan demikian, pengujian slot blot

tidak sepeka dengan yang akan lebih disukai.

4ingga a*al /119, pengujian slot blot tersedia sebagai produk komersial dari

Applied iosystems #!oster City, CA& yang disebut 7it 7uantifikasi DNA Manusia

Guantiblot. 7it ini menggunakan probe DNA dari kromosom %0 dan dengan

demikian bermanfaat untuk diingat *alau pun bah*a pengujian ini sebagai mana

dengan tes-tes hampir semua manusia, yang bekerja pada primata-primata seperti

simpanse dan gorilla karena kemiripan dengan manusia dan rangkaian DNA primata

lainnya.

12


13/32

DNA PROFILLING yaitu suatu teknik pemeriksaan laboratorium dengan

menggunakan DNA sebagai bahan spesimen yang bisa berasal dari manusia, bakteri dan

5irus.

Tahapan –tahapan daa! DNA p"#$%%n& '

E*+t"a*+% , I+#a+% DNA

- 'kstraksi yaitu mengeluarkan DNA dari inti sel dengan (ara melisiskan sel

se(ara mekanik #sonifikasi atau (entrifugasi& maupun kimia.

- solasi yaitu memisahkan DNA dari bahan-bahan lainnya seperti +NA dan

protein

./ant%$%*a+% DNA

Haitu suatu (ara untuk mengetahui keberhasilan dari ekstraksi DNA dengan

menghitung kadar DNA dan kemurnian DNA.

7emurnian DNA dihitung dengan menghitung rasio antara daya serap maksimal

DNA terhadap sinar > pada panjang gelombang /?1 nm dengan daya serap

maksimal protein terhadap sinar > pada panjang gelombang /21 nm.

erhitungan:

K0!/"n%an I Abs J /?1

Abs J /21

jika didapatkan hasil :

a. K % I berarti masih terdapat banyak protein

b. L % #%,3 /,1 & I hasil ideal yang diharapkan

(. L / I menunjukkan adanya +NA

Kada" DNA I Abs J /?1 31

7eterangan :

a. Abs J /?1 I absorban pada panjang gelombang /?1 nm.

b. I pengen(eran # biasanya dipakai 01&.

(. 31 I konstanta

>ntuk C+ kadar DNA yang dihasilkan minimal 311 ng=l 011 ng=l

1 A!p%$%*a+% DNA d0n&an PCR ( P#2!0"a+0 Cha%n R0a3t%#n)

13


14/32

Dilakukan se(ara in5itro dengan teknik C+. C+ adalah suatu reaksi penggandaan

DNA dimana prinsip kerjanya sama dengan replikasi. edanya, kalau replikasi

hanya menggunakan prinsip en)imatik, sedangkan C+ selain en)imatik juga

menggunakan prinsip perubahan suhu.

Tahapan – tahapan PCR '

a. Denaturasi yaitu proses merubah DNA dari double strain menjadi single strain.

b. Annealing yaitu penempelan primer untuk masing-masing DNA template pada

original strain, sehingga terjadi pembentukan strain baru.

(. 'kstention yaitu pemanjangan strain baru dari primer oleh en)im "aB

olymerase.4 5%+/a%+a+% DNA

erfungsi untuk mengetahui keberhasilan penggandaan dengan menggunakan gel

elektroforesis atau kapilarisasi elektroforesis.

GAMBAR SKEMATIK SIKLUS PCR

14


15/32

K0t0"an&an ' #%& denaturasi pada suhu 89OC. #/& Annealing pada suhu 39OC. #$&

'kstention pada suhu 0/ OC. #& I "aB olymerase. #9& Siklus pertama yang sudah

lengkap.Strand DNA baru yang dihasilkan digunakan sebagai (etakan untuk siklus

berikutnya. Setiap tahapan siklus diulang /3 kali.

PROSEDUR PEMERIKSAAN DNA MITOKONDRIA

15


16/32

EKSTRAKSI DAN ISOLASI DNAT/6/an ' untuk mengeluarkan DNA dari inti sel dan memisahkan DNA dari bahan-

bahan lainnya seperti +NA dan protein.

M0t#d0 ' solasi dengan DNAP@

Aat '

- "abung (entrifuge

- +ak tabung

- !ree)e (entrifuge

- orte

- 'ppendorf

- Mikropipet

- Hello* tip dan blue tip

R0a&0n '

- DNAP@

- Chloroform

- sopropanol

- 'tanol 01;

- D # destilled *ater = nuklease free *ater&

Sa!p0 ' darah 'D"A

Ca"a K0"6a '

%. Ambil tabung (entrifuge %3 (( dan masukkan reagen DNAP@ sebanyak %((.

/. "ambahkan darah 'D"A sebanyak 1,3 (( kemudian 5orte dengan segera.

$. nkubasi selama %3 menit.

9. "ambahkan (hloroform sebanyak 1,/ (( kemudian 5orte dengan segera.

3. nkubasi selama %3 menit.

?. Centrifuge dengan ke(epatan 2111 rpm selama %3 menit.

0. Ambil supernatant dengan hati-hati kemudian masukkan ke dalam tabung

eppendorf baru.

2. olak-balik dengan pelan, "ambahkan isopropanol 1,3 ((, inkubasi selama 3

menit.

8. Centrifuge dengan ke(epatan %/111 rpm selama %1 menit.

%1. uang supernatant.

16


17/32

%%. Cu(i pellet dengan etanol 01 ; sebanyak 1,3 ((.

%/. Centrifuge dengan ke(epatan %/111 rpm selama 3 menit.

%$. uang supernatant.

%9. ellet ditambah D sebanyak 31 ml dan 5orte hingga larut sehingga

terbentuk DNA template.

.UANTIFIKASI DNA

T/6/an ' >ntuk mengetahui keberhasilan dari ekstraksi dengan menghitung kadar

dan kemurnian DNA.

Aat '

- Spektrofotometer

- 7u5et

- Mikropipet

- "ip

Bahan '

- DNA template

- ABuades

Ca"a K0"6a '

%. 'n(erkan sampel 01 dengan (ara ?81 l aBuadest Q %1 l sampel.

/. Masukkan 011l blanko eBuadest ke dalam ku5et kemudian ukur absorbannya.

$. Masukkan 011l sampel yang telah dien(erkan, kemudian ukur absorbannya

pada panjang gelombang /?1 nm.

9. a(a lagi absorban sampel pada panjang gelombang /21 nm.

3. 4itung kadar dan kemurniannya. Ha+% '

Sa!p0 '

- Absorban pada panjang gelombang /?1 nm I 1,%32

- Absorban pada panjang gelombang /21 nm I 1,%/%

- 7emurnian I 1, %32 I %,$13

1,%/%- 7adar DNA I 1,%32 01 31 I 33$ ng=l

17


18/32

Sa!p0 '

- Absorban pada panjang gelombang /?1 nm I 1,/%8- Absorban pada panjang gelombang /21 nm I 1,%03

- 7emurnian I 1, /%8 I %,/3

1,%03- 7adar DNA I 1,/%8 01 31 I 0?0 ng=l

1 PENGGANDAAN DNA DENGAN PCR

P"%n+%p ' menggandakan DNA se(ara in5itro dengan menggunakan prinsip

en)imatik dan perubahan suhu.

Aat '

- Alat C+

- Mikropipet

- "abung eppendorf

- orte

- mikro(entrifuge

R0a&0n '

- C+ mi :

a. uffer b. Mg /Q

(. "aB polimerase

d. dN"

- rimer # untuk menentukan daerah yang akan digandakan sehingga

tidak semua untai yang digandakan& :

a. !or*ard

b. +e5erse

- D # destilled *ater = nuklease free *ater&

Bahan ' DNA template

Ca"a K0"6a '

%. iarkan master mi men(apai suhu ruangan, kemudian 5orte dan putar pada

mikro(entrifuge.

/. Siapkan (ampuran untuk pembuatan /3 l sebagai berikut :

a >ntuk kemurnian %,$13 dan kadar 33$ ng=l :

Master mi I %/,3 l

1


19/32

rimer % I /,3 l

rimer / I /,3 l

DNA template I %,3 l

D I ? l

$ >ntuk kemurnian %,/3 dan kadar 0?0 ng=l :

Master mi I %/,3 l

>pstream primer #primer %& I /,3 l

Do*nstream primer #primer /& I /,3 l

DNA template I % l

D I ?,3 l

$. akukan setting pada alat sebagai berikut :

89oC 9 menit untuk pemanasan

89oC % menit untuk denaturasi

33oC-?1oC 9 menit untuk annealing

0/oC / menit untuk ekstention

7etiga siklus yaitu denaturasi, annealing, dan ekstention diulang /3 kali

9. etakan (ampuran reaksi pada thermal (y(ler yang sudah disetting seperti diatas

dan proses C+ akan berjalan sesuai setting sampai selesai.

4 5ISUALISASI DNA DENGAN GEL ELKTROFORESIS

T/6/an ' untuk mengetahui hasil penggandaan DNA dengan C+

P"%n+%p ' ergerakan DNA dalam suatu gel yang diberi arus listrik. DNA yang

bermuatan negati5e akan bergerak kearah kutub positif sesuai dengan

berat molekul DNA. Semakin besar berat molekulnya, DNA akan

semakin lambat bergerak.

Aat '

- Cetakan agar

- 6elas ukur

- Mi(ro*a5e

1.


20/32

- "imbangan elektrik

- Spatel

- 'rlenmeyer - ampu ultra5iolet

- late elektroforesis

R0a&0n '

- uffer "' 1,3 ;

- arutan '"+ #'tidium bromide&

- Agarose /;

Ca"a K0"6a '

A P0!7/atan a&a"#+0 8 +07an2a* 9 !

#%& Ditimbang 1,9 gram agarose dalam erlenmeyer, kemudian dilarutkan dengan

/1 ml "' 1,3 ;

#/& 'rlenmeyer ditaruh di dalam mi(ro*a5e dan diko(ok setiap 8 detik sampai

benar-benar larut, kemudian diangkat

#$& Masukkan agar yang sudah larut ke dalam (etakan dan biarkan beku

#9&

B Lan&*ah-Lan&*ah E0*t"#$#"0+%+

#%& Masukkan agar yang sudah di(etak ke dalam plate elektroforesis

#/& "uangkan "' %1 ; kedalam plate sampai agar tersebut terendam

#$& Masukkan marker ke dalam *ell % sebanyak 9-3 l

#9& Masukkan (ontrol positif ke dalam *ell / sebanyak %/,3 l

#3& Masukkan sampel % ke dalam *ell $ sebanyak %/,3 l dan seterusnya

#?& eri arus listrik %11 A selama $1 menit

#0& Ambil gel dan masukkan ke dalam larutan etidium romida selama $1 menit

agar DNA dapat ter*arnai.

#2& Sinari dengan > untuk melihat hasil elektroforesis

Ha+% ' 4: 7p

20


21/32

EKSTRAKSI DAN ISOLASI DNA

21


22/32

22


23/32

23


24/32

24


25/32

25


26/32

G>AN"!7AS DNA

26


27/32

PENGGANDAAN DNA

27


28/32

PEMBUATAN AGAR

2


29/32

2.


30/32

ELEKTROFORESIS

HASIL ELEKTROFORESIS ;ANG DISINARI U5

DAFTAR

PUSTAKA

Aba),


31/32

S.


32/32

urgoyne,.A. #%880& Proceedings from the 7ight !nternational $ymposium on 4uman

!dentification( p. %3$. Madison, is(onsin: promega Corporation.

Castle, .'., 6ar(ia-Closas, M., !ranklin, "., Chano(k, S., uri, ., el(h, +., +othman,

N. and aught, j. #/11$& #merican +ournal of 4uman Genetics, 0$, ?9?-?3%.

Comey, C."., koons, .., resley, 7.., Smeri(k,

laporan praktikum biomol 1

Documents