BAB IITINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tinjauan Botani

Tinjauan botani mengenai tanaman kembang bulan (Tithonia diversifolia A.

Gray.) meliputi aspek-aspek, yaitu klasifikasi tanaman, sinonim, nama daerah,

deskripsi tanaman, ekologi dan penyebaran, serta kandungan kimia dan

kegunaannya.

2.1.1. Klasifikasi Tanaman (8)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)

Sub Kelas : Asteridae

Ordo : Asterales

Famili : Asteraceae

Genus : Tithonia

Spesies : Tithonia diversifolia A. Gray

i) Sinonim

Mirasolia diversifolia Hemsley

ii) Nama Daerah

Umum : Kembang Bulan

Jawa : Rondose-moyo, Harsaga

Tapanuli : Sipaet-paet

Minang : Kayu Paik

iii) Nama Asing

Mary Gold, Shrub Sunflower, Mexican Sunflower (Inggris), Mirasol (Guatemala),

Yellow Flower (Portugis)

2.1.2. Deskripsi Tanaman

3

4

Tumbuhan kembang bulan merupakan tumbuhan perdu yang tegak dengan tinggi

lebih kurang ± 5 m. Batang tegak, bulat, berkayu hijau. Daunnya tunggal,

berseling, panjang 26-32 cm, lebar 15-25 cm, ujung dan pangkal runcing,

pertulangan menyirip, hijau. Bunga merupakan bunga majemuk, di ujung ranting,

tangkai bulat, kelopak bentuk tabung, berbulu halus, hijau, mahkota lepas, bentuk

pita, halus, kuning, benang sari bulat, kuning, putik melengkung, kuning.

Buahnya bulat, jika masih muda berwarna hijau setelah tua berwarna coklat.

Bijinya bulat, keras, dan berwarna coklat. Akarnya berupa akar tunggang

berwarna putih kotor.

2.1.3. Ekologi dan Penyebaran

Tumbuhan kembang bulan umumnya tumbuhan liar di tempat-tempat curam,

misalnya di tebing-tebing, tepi sungai dan selokan. Sekarang banyak ditanam

sebagai tanaman hias karena warna bunganya yang kuning indah. Juga merupakan

tumbuhan tahunan yang kerap tumbuh di tempat terang dan banyak sinar matahari

langsung. Tumbuh dengan mudah di tempat atau di daerah berketinggian 5-1500

m di atas permukaan laut

2.1.4 Kandungan Kimia dan Kegunaan

i. Kandungan Kimia

Daun tanaman kembang bulan mengandung alkaloid, flavonoid, tanin, terpenoid,

saponin dan gula pereduksi.(8)

ii. Kegunaan

Daun kembang bulan digunakan secara tradisional sebagai obat untuk mengobati

Diabetes Melitus Tipe 2. Untuk mengobati Diabetes Militus ramuan yang

digunakan adalah dengan merebus 10 lembar daun kembang bulan dengan 4 gelas

air, kemudian dibiarkan sampai hanya tersisa 3 gelas untuk kemudian di minum

hangat ataupun dingin.(3) Tumbuhan kembang bulan juga umum digunakan

sebagai obat luka atau luka lebam, dan sebagai obat sakit perut kembung. Banyak

juga digunakan sebagai obat lepra, penyakit lever, dan obat diabetes militus.(2)

5

Hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh beberapa peneliti

disebutkan jika ekstrak etanol daun kembang bulan mempunyai aktivitas

antimalaria dengan IC50 sebesar 0,75 µg/mL.(9) Sementara penelitian lain

menyebutkan bahwa Ekstrak kloroform daun Kembang bulan memiliki efek

sitotoksik (IC50=16,61μg/mL) terhadap sel HeLa, dan Ekstrak terpurifikasi dari

ekstrak kloroform (tidak larut PE) daun Kembang bulan (T. diversifolia) memiliki

efek sitotoksik terhadap sel HeLa dengan nilai IC50 =3,078μg/mL dan Indeks

Selektivitas sebesar 26,09.(10)

2.2. Senyawa Flavonoid(11,12,13)

Senyawa-senyawa flavonoid adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai

15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu

oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon

Istilah flavonoid diberikan pada suatu golongan besar senyawa yang berasal dari

kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatu jembatan

oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbon benzil

yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosoklik ini, pada tingkat oksidasi

yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk yang

mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggap sebagai

struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini.

2.2.1. Struktur Dasar Senyawa Flavonoid

Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti

fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon.

2.2.2. Penggolongan Senyawa Flavonoid

1. Flavonol

Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida,

dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin

yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiinflamasi. Flavonol lain yang

terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana

dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara

6

tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya

masih dapat dilakukan.

Gambar II.1 Struktur Flavonol (Kaemferol)(11)

2. Flavon

Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat

gugusan 3-hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan

kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon terdapat juga sebagai

glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol. Flavon

yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Luteolin

merupakan zat warna yang pertama kali dipakai di Eropa. Jenis yang

paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat juga flavon yang terikat

pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-

glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok

senyawa flavonoid.

Gambar II.2 Struktur Flavon (Apigenin)(11)

3. Isoflavon

Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan

sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam

tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar

dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun.

Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda

cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang

7

lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah

menjadi coklat.

Gambar II.3 Struktur Isoflavon (Genstein)(11)

4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun

dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman

genus prenus dan buah jeruk; dua glikosida yang paling lazim adalah

neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.

Gambar II.4 Struktur Flavanon (Naringin)(11)

5. Glikoflavon

Glikoflavon adalah ko-pigmen tak berwarna yang terikat pada glikosida

melalui ikatan C-C.

Gambar II.5 Struktur Glikoflavon (Orientin)(11)

8

6. Proantosianidin

Proantosianidin merupakan metabolit alami pada tumbuhan seperti buah

buahan, sayuran, kacang-kacangan, biji-bijian, bunga, dan kulit pohon

senyawa ini termasuk kategori tannin terkondensasi. Proantosianidin

menghasilkan pigmen antosianidin dengan pemutusan oksidatif (bukan

hidrolisis) pada alkohol panas melalui reaksi butanol asam.

Proantosianidin berbentuk oligomer dan tersusun atas monomer seperti

katekin dan epikatekin.

Gambar II.6 Struktur Proantosianidin(11)

7. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar

luas dalam tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini

adalah penyebab hampir semua warna merah jambu, merah marak , ungu,

dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan tinggi. Secara kimia

semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu

sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan

penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau

glikosilasi.

9

Gambar II.7 Struktur Antosianin (Pelargonidin)(11)

8. Khalkon dan Auron

Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan

sinar UV bila dikromatografi kertas.

Gambar II.8 Struktur Khalkon (Butein)(11)

Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu

dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan

tampak pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar

ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi

uap amonia.

Gambar II.9 Struktur Auron (aureusidin)(11)

9. Biflavonil

Biflavonoid (atau biflavonil, flavandiol) merupakan dimer flavonoid yang

dibentuk dari dua unit flavon atau dimer campuran antara flavon dengan

flavanon dan/atau auron.

10

Gambar II.10 Struktur Biflavonil (Heveaflavon)12

2.2.3 Aglikon Flavonoid

Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid ( yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat

dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung 15 atom karbon dalam

inti dasarnya, yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu cincin aromatik

yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tak dapat membentuk

cincin ketiga. Semua varian flavonoid saling berkaitan karena alur biosintesis

yang sama, yaitu melalui jalur sikimat dan jalur asetat-malonat. Modifikasi

flavonoid lebih lanjut mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan :

penambahan atau pengurangan hidroksisali; metilasi gugus hidroksi atau inti

flavonoid; isoprenilasi gugus hidroksi atau inti flavonoid; metilasi gugus orto-

dihidroksil; dimerisasi; pembentukan bisulfat dan yang terpenting, glikosidasi

gugus hidroksil atau intiflavonoid.

2.2.4 Flavonoid O-glikosida

Umumnya flavonoid terdapat sebagai flavonoid O-glikosida, yaitu satu gugus

hidroksil flavonoid atau lebih terikat pada satu gula atau lebih dengan ikatan

hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikosidasi menebabkan flavonoid

menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air, sifat inilah yang

memungkinkan penyimpanan flavonoid di dalam vakuol sel. Gula yang sering

terikat pada flavonoid adalah glukosa, walaupun galaktosa, ramnosa, xilosa dam

arabinosa juga sering terlihat.

11

2.2.5 Flavonoid C-glikosida

Flavonoid C-glikosida merupakan flavononoid yang mengikat gula pada atom

karbon dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan

satu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya

ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoid. Berbeda dengan

dengan flavonoid O-glikosida, jenis gula yang terlibat ternyata lebih sedikit, jenis

glukusa yang paling umum adalah viteksin dan orientin dan juga galaktosa seperti

epigenin 8-C-galaktosida, ramnosa misalnya visenin-1. Jenis aglikon yang terlibat

pun sangat terbatas.

2.2.6 Hidrolisis flavonoid

Hidrolisis flavonoid digunakan untuk memutuskan ikatan flavonoid dengan gula

yang terikat, sehingga penentuan struktur glikosida lebih lanjut dapat dilakukan.

Dengan cara ini berbagai jenis glikosida dapat saling dibedakan. Untuk tujuan ini

biasanya dipakai tiga cara hidrolisis, yaitu hidrolisis asam, enzim, dan basa.

Hidrolisis asam dilakukan dengan menggunakan asam hidroklorida (HCl), proses

yang digunakan adalah dengan melarutkan glikosida flavonoid dengan HCl 2 N :

Metanol (1:1) pada alas bundar, kemudian dipanaskan pada penangas air selama

60 menit. Kemuadian diuapkan dengan menggunakan evaporator-berputar.

Selajutnya sampel yang telah kering dilarutkan dengan sedikit mungkin pelarut

metanol : air (1:1) dan diktromatografi (KKt atau KLT-selulose, 15% asam

assetat) dibandingkan dengan bahan awal untuk menentukan apakah telah terjadi

hidrolisis.

2.2.7 Sifat dan Kelarutan Flavonoid

Aglikon flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia

senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi

harus diingat, bila dibiarkan dalam larutan basa, dan disamping itu terdapat

oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil,

atau suatu gula,flavonoida merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoid

cukup larut dalam pelarut polar seperti Etanol (EtOH), Metanol (MeOH), Butanol

12

(BuOH), Aseton, Dimetilsulfoksida (DMSO), Dimetilformamida (DMF), Air dan

lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoid (bentuk yang umum

ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan

dengan demikian campuran pelarut yang disebut diatas dengan air merupakan

pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar

seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi

cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti Eter dan Kloroform.

2.2.8 Penyebaran flavonoid di alam

Flavonoid merupakan kandungan khas tumbuhan hijau dengan mengecualikan

alga dan hornwort. Flavonoid sebenar terdapat pada semua bagian tumbuhan

termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, nektar, bunga, buah buni, dan biji.

Hanya sedikit catatan yang mengatakan adanya flavonoid pada hewan, misalnya

dalam kelenjar bau belerang, propolis dan di dalam sayap kupu-kupu, itupun

dengan anggapan bahwa flavonoid tersebut berasal dari tumbuhan yang menjadi

makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka.

Segi penting dari penyebaran flavonoid dalam tumbuhan ialah adanya

kecenderungan kuat bahwa tumbuhan yang secara taksonomi berkaitan akan

menghasilkan flavonoid yang jenisnya serupa.

2.3 Metode Isolasi

Isolasi senyawa metabolit sekunder dari suatu simplisia dapat dilakukan dengan

berbagai metode, diawali dengan proses ekstraksi, yang diikuti dengan fraksinasi

atau pemisahan, pemantauan dan kemudian pemurnian

2.3.1 Ekstraksi

Ekstraksi adalah metode penarikan kandungan senyawa kimia metabolit sekunder

dari tumbuhan atau atas bagian tumbuhan dengan menggunakan pelarut-pelarut

yang sesuai.(11) Ada berbagai macam metode ekstraksi, sesuai dengan pelarut yang

digunakannya,(14) yaitu :

1. Ekstraksi cara dingin, contohnya maserasi dan perkolasi.

2. Ekstraksi cara panas, contohnya refluks, Soxhlet, digesti, infuse, dan dekok

13

i. Maserasi

Maserasi adalah proses penyarian simplisia menggunakan bermacam pelarut pada

suhu kamar selama beberapa waktu. Maserasi merupakan cara penyarian yang

sederhana, dan dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan

penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga

sel yang mengandung zat aktif, sehingga zat aktif akan larut kemudian karena

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif dalam sel dengan yang di

luar sel, maka larutan yang terpekat didesak untuk keluar. Peristiwa tersebut

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan

di dalam sel.(14) Penelitian sebelumnya pun menggunakan metode maserasi dengan

berbagai modifikasi metode ekstraksi sebelum maserasi dan sesudah maserasi

dilakukan.

Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus-menerus).

Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan

penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Keuntungan metode ini adalah

menggunakan peralatan yang sederhana, sedangkan kerugiannya adalah waktu

yang diperlukan untuk mengekstraksi sample cukup lama, cairan penyari yang

digunakan lebih banyak dan tidak dapat digunakan untuk bahan-bahan yang

mempunyai tekstur keras seperti benzoin, tiraks dan lilin.(15)

ii. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama

waktu tertentu dan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin

balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5

kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

2.3.2 Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia

nabati atau hewani menurut cara yang cocok, diluar pengaruh cahaya matahari

langsung.(16) Adapula yang menyatakan ekstrak adalah sediaan pekat yang

diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia

14

hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua

pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian

hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.(17)

2.3.3 Fraksinasi(18)

Fraksinasi adalah cara yang digunakan untuk memisahkan golongan kandungan

yang satu dari golongan kandungan yang lain. Fraksinasi ekstrak dapat dilakukan

dengan berbagai cara, tetapi pada dasarnya tergantung pada bentuk fisik ekstrak

kasarnya yaitu ekstrak padat atau setengan padat dan ekstrak cair.

Ekstrak kasar berbentuk padat atau setengah padat dapat difraksinasi dengan dua

cara, yaitu:

a. Ekstraksi padat-cair menggunakan pelarut dengan berbagai tingkat

kepolaran, dapat dilakukan dengan maserasi, perkolasi, dsb.

b. Kromatografi, antara lain kromatografi kolom normal, kromatografi cair

bakum,dll.

Ekstrak kasar beebentuk cair dapat difraksinasi dengan cara ekstraksi cair-cair.

Ekstraksi cair-cair adalah ekstraksi dengan menggunakan dua pelarut yang tidak

tercampurkan. Keberhasilan pemisahan sangat tergantung pada perbedaan

kelarutan senyawa tersebut dalam kedua pelarut secara umum. Prinsip

pemisahannya adalah senyawa tersebut kurang larut dalam pelarut yang satu,

tetapi sangat larut dalam pelarut yang lain. Air banyak dipakai dalam sistem

ekstraksi cair-cair senyawa organik, karena banyak senyawa organik bersifar ionik

atau sangat polar yang cukup larut dalam air. Pelarut lain yang digunakan adalah

pelarut organik non polar yang tidak berampur dengan air. Pelarut organik yang

digunakan harus mempunyai titik didih jauh lebih rendah dari senyawa tereksitasi,

biasanya dibawah 100oC, tidak mahal dan tidak bersifat racun. Dalam sistem

ekstraksi ini akan dihasilkan dua fasa yaitu fasa air dan fasa organik.

2.3.4 Pemisahan

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan dilakukan dengan menggunakan

salah satu dari keempat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut.

Kromatografi merupakan cara pemisahan zat berkhasiat dan zat lain yang ada

15

dalam sediaan, dengan jalan penyarian berfraksi, atau penyerapan, atau penukaran

ion pada zat padat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir. Zat yang

diperoleh dapat digunakan untuk pengidentifikasian struktur atau juga penetapan

kadar. Keempat teknik kromatografi itu adalah : kromatografi kertas (KKt),

kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi

cair kinerja tinggi (KCKT). Pemilihan teknik kromatografi tergantung dari sifat

kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisahkan.(11) Pemisahan dalam

sekala besar dapat dilakukan dengan teknik kromatografi kolom (KK).

i. Kromarografi Lapis Tipis (KLT),

KLT digunakan pada pemisahan zat secara cepat, dengan menggunakan zat

penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca.

Lempeng lapis-penyerap sering menggunakan indikator fluoresensi (F254)

sehingga bahan alam mengabsorbsi sinar UV gelombang pendek (254 nm) akan

tampak bercak hitam pada latar hijau. Sedangkan pada sinar UV gelombang-

panjang, senyawa tertentu menampakkan fluoresensi biru atau kuning terang.(19)

KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut

dalam lipid, yatu lipid, steroid, karotenoid, kuinon sederhana dan klorofil.(11)

Kromatografi lapis tipis dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk

pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis

tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas.

Pada kromatografi lapisan tipis dua dimensi, lempeng yang telah dielusi diputar

90o dan dielusi lagi, umunya menggunakan bejana lain yang berisi pelarut lain.(20)

ii. Kromatografi Kolom (KK)

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah kromatografi

kolom. Pada KK, fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel, selulosa,

sephadex atau poliamida. Sedangkan fasa geraknya dapat dimulai dari pelarut non

polar kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut

tunggal ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya dengan

perbandingan tertentu sesuai tingkat kepolaran yang dibutuhkan.(21) Zat penyerap

(misalnya aluminiumoksida) yang telah diaktifkan, silika gel, kiselgur

terkalsinasi, dan kiselgur kromatografi murni) dalam keadaan kering atau setelah

16

dicampur dengan sejumlah cairan, dimampatkan ke dalam tabung kaca atau

tabung kwarsa dengan ukuran tertentu dan mempunyai lubang pengalir keluar

dengan ukuran tertentu. Zat berkhasiat diserap dari larutan oleh bahan penyerap

secara sempurna berupa pita sempit pada puncak kolom. dengan mengalirkan

pelarut lebih lanjut, dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak

turun dengan kecepatan khashingga terjadi pemisahan dalam kolom yang disebut

kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh beberapa faktor misalnya

daya serap zat penyerap, sifat pelarut, dan suhu dari sistem kromatografi.(22)

2.3.5 Pemurnian

Pemurnian kandungan tumbuhan adalah cara yang dilakukan untuk memurnikan

senyawa hasil isolasi sehingga keberadaannya lebih spesifik berupa senyawa

tunggal. Pemurnian ini diantaranya dapat dilakukan dengan kromatografi lapis

tipis preparatif dan rekristalisasi.

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLT-P adalah cara yang ideal untuk

pemisahan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g) dari senyawa yang kurang atsiri.(20)

KLT preparative dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm)

sebagai pengganti lapisan penjerap yang tipis. Kandungan yang sudah dipisah

dapat diperoleh kembali dengan cara mengerok penjerap di tempat yang sesuai

pada pelat yang telah dikembangkan, lalu serbuk dielusi dengan pelarut seperti

eter, dan akhirnya dikocok untuk menghilangkan penjerap.(11)

KLT preparatif digunakan sebagai prosedur untuk pemisahan senyawa. Sampel

yang dilarutkan dalam pelarut bervolume kecil dan dibuat garis tipis berjarak 2 cm

dari dasar lempeng dan dikeringkan.(19) KLT berskala preparatif memiliki banyak

kegunaan dan pengisian 1-100 mg segera menghasilkan bahan yang cukup murni

untuk uji biologis dan elusidasi struktur.

2.4. Metode Identifikasi

Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah dilakukan isolasi dan

dimurnikan, dilakukan penentuan golongan senyawa dan jenis senyawanya.

17

Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan penambahan bahan

penampak bercak spesifik untuk golongan metabolit sekunder, penentuan

kelarutan, bilangan Rf, dan ciri spektrum UV. Ciri tersebut dibandingkan dengan

data pustaka yang ada. Data mengenai senyawa tumbuhan yang sama ialah dilihat

dari ciri spektrumnya, termasuk pengukuran spektrum UV, inframerah (IM),

resonansi magnet inti-proton (RMI-H) dan spektrum massa (SM).(13)

2.4.1. Spektrofotometri UV-Vis

Penyerapan sinar ultraviolet (ultra lembayung) dan sinar tampak oleh suatu

molekul organik akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik

pada molekul tersebut. Panjang glombang serapan merupakan ukuran perbedaan

tingka-tingkat energi transisi elektronik dari orbital tersebut. Panjang gelombang

cahaya ultraviolet dan tampak jauh lebih pendek daripada panjang gelombang

inframerah. Rentang untuk spektrum tampak, yaitu dari 400 nm (ungu)-750 nm

(merah). Sedangkan ultraviolet dari 200-400 nm. Informasi yang akan diperoleh

dari pengukuran menggunakan Spektroskopi ultraviolet-sinar tampak ini yaitu

ikatan tak jenuh terkonjugasi, konjugasi dengan elektron sunyi dan perpanjangan

sistem elektron-π.(13)

Spektroskopi serapan ultraviolet dan serapan tampak merupakan cara tunggal

yang paling berguna untuk menganalisis struktur dari metabolit sekunder dari

tanaman. Di samping itu spektroskopi UV untuk mengetahui panjang gelombang

maksimum dan perubahan transisi elektron π ke π*.

2.4.2. Spektrofotometri Inframerah (IM)(13)

Spektroskopi Inframerah pada umumnya digunakan untuk menentukan gugus

fungsi suatu senyawa organik dan mengetahui informasi struktur senyawa organik

dengan membandingkan daerah sidik jarinya. Pengukuran pada spektrum

inframerah dilakukan pada daerah cahaya inframerah tengah (mid-infrared) yaitu

pada panjang gelombang 2,5-50 µm atau bilangan gelombang 4000-200 cm-1.

Banyak gugus fungsi dapat diidentifikasikan dengan menggunakan frekuensi

getaran yang terlihat, sehingga spektroskopi inframerah merupakan cara paling

sederhana untuk menentukan golongan senyawa. Spektrum inframerah suatu

18

molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran (vibrasi) yang

berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami getaran

(vibrasi) atau osilasi (oscillation). Bila molekul menyerap radiasi inframerah,

energi yang diserap menyebabkan kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom

yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam keadaan vibrasi tereksitasi; energi

yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila molekul itu kembali ke

keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu tipe ikatan,

bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Radiasi yang diserap oleh

gelombang inframerah, yaitu 667-4000 cm-1. Fungsi dari spektrofotometri

inframerah ini, yaitu untuk mengidentifikasi semua gugus fungsi yang mempunyai

frekuensi vibrasi spesifik seperti, C=O, O=H, NH2, C=C, C≡C, C-C, C-H dan

yang lainnya.