BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Lingkungan tercemar, kesalahan pola makan dan gaya hidup, mampu

merangsang tumbuhnya radikal bebas (free radical) yang dapat merusak tubuh.

Radikal bebas merupakan salah satu penyebab timbulnya penyakit degeneratif antara

lain kanker, aterosklerosis, stroke, rematik dan jantung.

Upaya untuk mencegah atau mengurangi resiko yang ditimbulkan oleh aktivitas

radikal bebas adalah dengan mengkonsumsi makanan atau suplemen yang

mengandung antioksidan. Antioksidan dapat menetralkan radikal bebas dengan cara

mendonorkan satu atom protonnya sehingga membuat radikal bebas stabil dan tidak

reaktif.

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menunda atau mencegah

oksidasi dengan cara menghambat terjadinya reaksi rantai oksidatif. Fungsi utama

antioksidan adalah menetralisasi radikal bebas, sehingga tubuh terlindungi dari

berbagai macam penyakit degeneratif.

Antioksidan alami adalah antioksidan yang umumnya diisolasi dari sumber

alami yang kebanyakan berasal dari tumbuh-tumbuhan dan buah-buahan. Menurut

penelitian Lahucky et al. (2010) bahwa beberapa tanaman diketahui memiliki

kandungan senyawa antioksidan dan mengandung senyawa fenolik yang memiliki

kemampuan sebagai antioksidan. Penelitian mengenai senyawa kimia pada tanaman

ini khususnya kandungan antioksidan perlu dilakukan sehingga diharapkan dapat

memberikan informasi yang lengkap untuk pemanfaatannya dalam bidang farmasi,

pangan, industri, dan lain-lain.

1.2 Tujuan

Tujuan dari pembuatan makalah mengenai metode Uji Antioksidan ini yaitu

Untuk mengetahui cara atau metode Uji Antioksidan.

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Radikal Bebas

Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan satu buah elektron dari

pasangan elektron bebasnya, atau merupakan hasil pemisahan homolitik suatu ikatan

kovalen. Akibat pemecahan homolitik, suatu molekul akan terpecah menjadi radikal

bebas yang mempunyai elektron tak berpasangan. Elektron memerlukan pasangan

untuk menyeimbangkan nilai spinnya, sehingga molekul radikal menjadi tidak stabil

dan mudah sekali bereaksi dengan molekul lain, membentuk radikal baru. Radikal

bebas dapat dihasilkan dari hasil metabolisme tubuh dan faktor eksternal seperti asap

rokok, hasil penyinaran ultra violet, zat pemicu radikal dalam makanan dan polutan

lain. Penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas bersifat kronis, yaitu dibutuhkan

waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata. Contoh penyakit yang

sering dihubungkan dengan radikal bebas adalah serangan jantung,kanker, katarak

dan menurunnya fungsi ginjal. Untuk mencegah atau mengurangi penyakit kronis

karena radikal bebas diperlukan antioksidan.

2.2 Antioksidan

Antioksidan merupakan sebutan untuk zat yang berfungsi melindungi tubuh

dari serangan radikal bebas. Yang termasuk ke dalam golongan zat ini antara lain

vitamin, polipenol, karotin dan mineral. Secara alami, zat ini sangat besar peranannya

pada manusia untuk mencegah terjadinya penyakit. Antioksidan melakukan semua itu

dengan cara menekan kerusakan sel yang terjadi akibat proses oksidasi radikal bebas.

Antioksidan membantu menghentikan proses perusakan sel dengan cara

memberikan elektron kepada radikal bebas. Antioksidan akan menetralisir radikal

bebas sehingga tidak mempunyai kemampuan lagi mencuri elektron dari sel dan

DNA. Proses yang terjadi sebenarnya sangat komplek tapi secara sederhana dapat

dilukiskan seperti itu.

2

BAB III

PEMBAHASAN

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat oksidasi dengan cara

bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif yang

relatif stabil. Senyawa fenolik dan flavonoid merupakan sumber antioksidan alami

yang biasanya terdapat dalam tumbuhan.

Senyawa antioksidan saat ini bermanfaat untuk berbagai bidang seperti dalam

bidang pangan, industri tekstil, minyak bumi, bahan pewarna dan lain-lain. Riset

tentang pengembangan senyawa berkhasiat antioksidan telah banyak dikembangkan

baik senyawa alam maupun senyawa sintetis. Senyawa antioksidan adalah senyawa

yang berperanan untuk menghambat proses autooksidasi dalam minyak atau lemak

(Ketaren, 1986). Donnelly (1996) telah melaporkan berbagai senyawa yang dapat

berkhasiat sebagai antioksidan dan bisa digunakan dalam bahan makan. Selain dalam

bidang pangan, senyawa antioksidan sangat dibutuhkan juga dalam berbagai industri

seperti industri tekstil (Bangee et al, 1995), perminyakan (Pan et al, 1998 dan Jones &

Balster,1997) serta industri karet (Puspha et al, 1995).( Purwono, 2008).

Pada Percobaan penelitian yang dilakukan Identifikasi Senyawa Antioksidan

dalam Spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Pengujian yang dilakukan

yakni pengujian senyawa-senyawa fitokimia. Uji fitokimia yang dilakukan adalah Uji

Steroid/Triterpenoid, Alkaloid, Flavonoid, dan Antrakuinon.

Dalam penelitian tersebut, proses pengujian dilakukan dengan dua tahap, yaitu :

1. Pembuatan Ekstrak.

Spons Callyspongia sp (sample). yang dikumpulkan dari daerah Kepulauan

Seribu segera direndam dalam metanol dan baru dikeluarkan waktu penelitian

dimulai. Spons sejumlah 650 g dipotong-potong sampai halus, kemudian dimaserasi

selama 6 jam dalam 800 ml aseton, sambil sekali-kali dikocok. Lapisan aseton

3

dipisahkan, kemudian maserasi diulang 4 kali (tiap kali menggunakan 400 ml aseton)

dengan cara

4

5

yang sama sampai filtrat aseton tidak berwarna. Residu dimaserasi lebih lanjut

menggunakan metanol 450 ml dengan cara yang sama, ulangi 3 kali, sampai lapisan

metanol tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh disatukan, diuapkan menggunakan

rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental sejumlah 90,25 g.

2. Uji Aktivitas Antioksidan.

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan 2 cara, yaitu metode DPPH

dan tiosinat.

1. Metode DPPH (Blois, 1958)

Tujuan metode ini mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen

memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal ini dapat dicapai dengan

cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode tersebut. DPPH

merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat

mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas

antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak. Metode DPPH merupakan

metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan

senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot,

dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2010).

Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan

serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara

stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa

antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning

(Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Perubahan absorbansi

akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa

molekul sebagai penangkap radikal bebas.

Aplikasi metode pada Ekstrak Callyspongia sp. dilarutkan dalam metanol

dan dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 10, 30, 50 dan 70 ppm). Masing-

masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam tiap tabung reaksi

6

ditambahkan 500 µl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dicukupkan

sampai 5,0 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37o C selama 30 menit,

selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang 515 nm. Sebagai

Kontrol positif, dan untuk pembanding digunakan vitamin C (konsentrasi 2, 3,

4 dan 5 ppm) dan BHT (konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm). Nilai IC50 dihitung

masing-masing dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi.

Gambar 1. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan

antioksidan (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)

Sumber : http://edhisambada.wordpress.com/

2. Metode tiosianat (Mun’im et al,2003)

Metode ini relatif sederhana, cepat, sensitif, dan selektif dengan

menggunakan spektrofotometri dengan membuat kompleks dari besi (II), Besi

(II) direaksikan dengan 1,l0-fenantrolin membentuk kompleks berwarna

merah. Besi juga dapat ditentukan dengan mereaksikannya dengan kalium

tiosianat menjadi kompleks besi (III) tiosianat. Besi (III) bereaksi dengan

tiosianat membentuk kompleks berwarna merah. Keunggulan metode kompleks

kalium tiosianat adalah pembentukan kompleks hanya diperlukan pereaksi

murah dan mudah di dapat, tidak perlu direduksi dahulu, kompleks yang

terbentuk stabil dan relatif bebas dari gangguan, tidak diperlukan pengontrolan

pH, absortivitas molamya lebih dari 10.000 dm3.mor1.cm-1, dan sangat cocok

7

untuk penentuan besi sebagai besi (III), karena meskipun besi (III) sangat

sedikit berada dalam lingkungan besi (II), namun pembentukan kompleks

dapat terjadi.

Aplikasi dalam 500 µl larutan ekstrak Callyspongia sp. dengan konsentrasi

100 ppm dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan berturut-turut

2,5 ml larutan buffer fosfat 0,2 M (pH=7), 2,5 ml larutan asam linoleat (1,3%

w/v), 1,0 ml air suling, dan 0,25 ml larutan AAPH 46,6 mM dalam etanol 40%.

Selanjutnya diinkubasi dalam keadaan gelap, pada suhu 50o C. Pengambilan

sampel dilakukan setiap satu jam selama 4 jam. Larutan uji sebanyak 0,1 ml

ditambah dengan 0,1 ml larutan besi (II) klorida 20mM dalam HCl 3,5% 0,1 ml

larutan ammonium tiosianat 10% dan dicukupkan volumenya dengan etanol

75% menjadi 10 ml. Homogenkan dengan vortex, setelah 3 menit serapannya

diukur pada panjang gelombang 500 nm. Kemampuan aktivitas antioksidan

dilihat dari rendahnya resapan yang terbentuk terhadap kontrol.

Selain pengujian antioksidan, Dalam penelitian tersebut, dilakukan juga proses

pengujian fitokimia, yaitu pengujian :

1. Steroid/triterpenoid

Sebanyak 1 ml larutan ekstrak diuapkan sampai kering, kemudian ditambah

dengan pereaksi Lieberman-Burchard. Warna biru-ungu yang timbul

menunjukan adanya senyawa terpenoid atau steroid

2. Alkaloid

Larutan ekstrak sebanyak 3 ml ditambah dengan 1 ml HCl 2 N, dan 6 ml air

suling, kemudian panaskan selama 2 menit, dinginkan kemudian disaring.

Filtrat diperiksa adanya senyawa alkaloid dengan pereaksi Dragendorff,

Bouchardat dan Mayer.

8

3. Flavonoid

Larutan ekstrak sebanyak 2 ml ditambah dengan sedikit serbuk seng atau

magnesium dan 2 ml HCl 2N. Senyawa flavonoid akan menimbulkan warna

jingga sampai merah.

4. Antrakuinon

Larutan ekstrak sebanyak 2 ml dipanaskan dengan 5 ml H2SO4 selama 1 menit.

Setelah dingin dikocok dengan 10 ml bensen. Warna kuning pada lapisan

bensen menunjukkan adanya senyawa antrakuinon. Identifikasi dapat diperjelas

dengan menambahkan larutan natrium hidroksida 2N, akan terjadi warna merah

pada lapisan air.

Langkah selanjuntnya adalah pemeriksaan kandungan kimia menggunakan

KLT. Pemeriksaan KLT dilakukan terhadap adanya senyawa yang memberikan hasil

positif pada pemeriksaan menggunakan pereaksi kima. Larutan pengembang yang

digunakan adalah campuran metanol-NH4OH (200:3), dengan larutan deteksi

Dragendorff dan DPPH.

Hasil yang diperoleh setelah pengujian dalam penelitian tersebut bahwa Uji

aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH menunjukkan bahwa ekstrak

Callyspongia sp. mempunyai IC50 sebesar 41,21 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa

ektrak tersebut mempunyai aktifitas aktioksidan yang kuat, karena mempunyai IC50

kurang dari 200 µg/ml (Blois, 1958). Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 1.

Apabila dibandingkan dengan aktivitas antioksidan vitamin C dan BHT yang masing-

masing mempunyai nilai IC50 sebesar 3,45 dan 3,81 mg/ml, aktivitas antioksidan

ekstrak Callyspongia sp. masih lebih rendah. Tetapi pada penelitian ini yang diuji

masih berupa ekstrak kasar, sehingga masih ada kemungkinan senyawa murni yang

dikandung memiliki aktivitas peredaman radikal bebas lebih kuat dibandingkan

ekstraknya.

9

Tabel 2. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan Metode DPPH

10

Gambar 2. Aktivitas antioksidan ekstrak Callyspongia sp., vitamin C dan BHT menggunakan metode tiosianat

Sumber : Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3, Desember 2005, 127 – 133

DPPH dari ungu ke kuning yang diukur pada panjang gelombang 517 nm

(Blois, 1958). Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak Callyspongia sp. menggunakan

metode tiosianat menunjukkan tidak adanya perbedaan aktivitas yang bermakna

(Anava searah dengan tingkat kepercayaan 95%) dengan pembanding vitamin C dan

BHT, seperti terlihat pada Gambar 2. Pada metode tiosianat pengukuran aktivitas

antioksidan berdasarkan daya penghambatan terbentuknya senyawa-senyawa radikal

yang bersifat reaktif. Oksidasi asam linoleat dipercepat oleh AAPH yang merupakan

senyawa penginduksi pembentukan radikal bebas, yang umumnya berupa peroksida

lipid. Dekomposisi AAPH menghasilkan molekul nitrogen dan dua radikal karbon

yang dapat menghasilkan produk yang stabil atau bereaksi dengan molekul oksigen

menghasilkan radikal peroksil.

Proses oksidasi lemak menghasilkan produk primer peroksida (Mun’im, et al

2003). Bilangan peroksida dinyatakan sebagai senyawa yang mampu mengoksidasi

Fe2+ menjadi Fe3+, dan selanjutnya Fe3+ dengan ion CNS menghasilkan warna merah

yang diukur pada panjang gelombang 500 nm. Pada pengamatan jam ke-4, kontrol

negatif menunjukkan serapan sebesar 0,415, sedangkan ekstrak Callyspongia sp.

mempunyai serapan 0,133, vitamin C dan BHT masing-masing 0,132 dan 0,146. Hal

ini berarti bahwa ekstrak Callyspongia sp. mampu menghambat hasil oksidasi asam

11

linoleat maupun mereduksi radikal bebas. Hasil uji statistic (anava searah dengan

nilai α 0,05) menunjukkan bahwa ketiga larutan yang diuji tidak memperlihatkan

perbedaan aktivitas antioksidan yang bermakna.

Hasil identifikasi kimia menunjukkan bahwa ekstrak Callyspongia sp.

mengandung senyawa alkaloid Tabel 2. Identifikasi lanjutan menggunakan KLT

silica gel GF254 dengan larutan pengembang campuran methanol NH4OH (200 : 3)

memperlihatkan adanya bercak dengan Rf 0,33, yang pada pengamatan sinar UV

memberikan warna kuning hijau. Bercak ini memberikan warna jingga dengan

pereaksi Dragendorff, berarti bahwa bercak tersebut merupakan senyawa golongan

alkaloid. Pada uji dengan pereaksi DPPH, bercak ini memberikan aktivitas

peredaman radikal bebas, berarti senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan

dalam ekstrak Callyspongia sp. adalah senyawa golongan alkaloid.

Selain itu, Menurut Robinson (1995), senyawa tanin memiliki aktivitas

antioksidan, menghambat pertumbuhan tumor, menghambat enzim reverse

transcriptase dan DNA topoisomerase. Selanjutnya menurut Harismah (2002), sifat

antibakteri tanin diakibatkan oleh gugus pirogalol dan gugus galoil. Suragih (2002)

menyatakan bahwa katekin, leukoantosianin dan asam galat merupakan senyawa

tanin yang terdapat pada biji X. granatum yang berperan sebagai antibakteri (Dewi,

2008). Dengan adanya senyawa fitokimia seperti tannin maka akan diketahui bahwa

tumbuhan akan memiliki zat antioksidan.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil kajian mengenai cara atau metode pengujian antioksidan,

maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Antioksidan dapat menghambat kerja dari radikal bebas.

2. Ada dua cara dalam pengujian antioksidan, yaitu dengan menggunakan

metode DPPH dan tiosinat.

3. Setelah pengujian antioksidan dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui

metabolit sekunder apa yang terkandung dalam sample dengan KLT.

12

Daftra Pustaka

Anonim. 2012. Antioksidan. Diakses tanggal 8 desember 2013.http://antioxidant.glutera.com/article/read/21/manfaat-betakaroten-si-penangkal-radikal-bebas-glutathione-indonesia.html

Herlambang, Erwin. 2013. Manfaat Alfa Karoten. Diakses tanggal 9 desember 2013. http://www.superlutein.biz/tag/manfaat-alfa-karoten/

Muslih, Wirdha. 2009. Eucheuma Cottonii. Diakses tanggal 8 Desember 2013.http://wirdha.blogspot.com/2009/02/eucheuma-cottonii_23.html

wikipedia. 2013. radikal bebas. http://id.wikipedia.org/wiki/Radikal_bebas. diakses pada hari senin 23 desember 2013 pukul 11.05 pm

13

TUGAS BIOTEKNOLOGI KELAUTAN

Disusun Oleh:

Bani Kesuma 230210110014

Rindy Fatmala 230210110016

Aris Dwi Rahmanto 230210110027

Lim Kristianto Sitompul 230210110074

Fransiska Sonya Puspita 230210110076

Ismail Maqbul 230210120053

UNIVERSITAS PADJADJARANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN

2013