MAKALAH PRAKTIKUM BIOKIMIA KLINIS“Antioksidan dan Oksidasi Biologi”

ANTIOKSIDAN DAN OKSIDASI BIOLOGI

1.1 Tujuan Percobaan

1. Memperlihatkan proses oksidasi senyawa fenol oleh polifenol oksidase (PPO)

dalam kentang.

2. Memperlihatkan efek antioksidan vitamin c terhadap oksidasi fenol oleh PPO

kentang.

3. Memperlihatkan bahwa minyak bila mengalami oksidasi dapat menjadi tengik.

4. Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis.

1.2 Waktu dan Tempat

21 oktober 2010 di Lab Biokimia Klinis

1.3 Tinjauan Pustaka

a. Uji Oksidase dalam Kentang dan Pengaruh Pemberia Vitamin C

Fenol atau asam karbolat atau benzenol adalah zat kristal tak berwarna yang

memiliki bau khas. Rumus kimianya adalah C6H5OH dan strukturnya memiliki gugus

hidroksil (-OH) yang berikatan dengan cincin fenil. Kata fenol juga merujuk pada

beberapa zat yang memiliki cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil.

Fenol memiliki kelarutan terbatas dalam air, yakni 8,3 gram/100 ml. Fenol memiliki

sifat yang cenderung asam, artinya dapat melepaskan ion H+ dari gugus hidroksilnya.

Pengeluaran ion tersebut menjadikan anion fenoksida C6H5O yang dapat dilarutkan

dalam air.

1

Dibandingkan dengan alkohol alifatik lainnya, fenol bersifat lebih asam. Hal ini

dibuktikan dengan mereaksikan fenol dengan NaOH, di mana fenol dapat

melepaskan H+. Pada keadaan yang sama, alkohol alifatik lainnya tidak dapat

bereaksi seperti itu. Pelepasan ini diakibatkan pelengkapan orbital antara satu-

satunya pasangan oksigen dan sistem aromatik, yang mendelokalisasi beban negatif

melalui cincin tersebut dan menstabilkan anionnya.

Fenol didapatkan melalui oksidasi sebagian pada benzena atau asam benzoat

dengan proses Raschig. Fenol juga dapat diperoleh sebagai hasil dari oksidasi batu

bara. Fenol merupakan komponen utama pada antiseptik dagang, triklorofenol atau

dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi

beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam

pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin, pembasmi rumput liar, dan

lainnya). Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada

kulit yang terbuka. Rumus bangun fenol dapat dilihat pada gambar 1 di bawah ini.

Fenol merupakan komponen utama pada anstiseptik dagang, triklorofenol atau

dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi

beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam

pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin) pembasmi rumput liar, dan

lainnya. Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada

kulit yang terbuka.

Enzim merupakan protein yang dihasilkan oleh sel hidup yang bertindak sebagai

katalis dalam reaksi kimia organik, yang dapat mengubah bahan sedangkan dia

sendiri tidak mengalami perubahan. Enzim tersebut dapat terus bekerja setelah

kematian organisme. Berkaitan dengan hal tersebut, kinerja fenol dalam enzim,

telah dilaporkan oleh beberapa peneliti dengan objek percobaan yang berbeda-

beda. Sebagai senyawa aromatic, fenol -bila ingin dihilangkan keberadaanya-, dapat

2

dihilangkan dengan menggunakan enzim extra-cellular peroksidase dengan pH

optimal 7-8. Pada pH netral, proses tersebut meningkat, namun mengalami

penurunan seiring dengan meningkatnya suhu dari 0 -30 C.

Kentang (Solanum tuberosum) mudah sekali mengalami pencoklatan (browning),

bila penenganannya kurang baik , salah satu factor yang mempengaruhi adalah

asam askorbat, tirosin, enzim polifenol oksidase dan oksigen yang tersedia. Reaksi

pencoklatan dapat terjadi melalui dua proses yaitu proses pencoklatan enzimatik,

disebabkan adanya enzim PPO dan tirosin yang berperan sebagai substrat

sedangkan proses non enzimatis disebabkan karena reaksi Meillard, karamelisasi

atau oksidasi asam askorbat (Richardson, 1983 dalam18).Proses pencoklatan yang

terjadi akan mengurangi kualitas produk dan menurunkan minat konsumen

(Friedman,1990 dalam18). Proses pencoklatan sebenarnya dimulai dari kentang yang

dikupas, dipotong-potong, oksidasi asam askorbat, senyawa phenol seperti senyawa

tirosin sebagai substrat, akan dikatalisis enzim PPO menjadi quinon dan

berpolimerisasi membentuk o quinon, sehingga menghasilkan warna kecoklatan.

Penentuan asam askorbat dalam varietas kentang digunakan untuk proses

penghambatan pencoklatan kentang atau proses browning (inhibitor), karena

menurut Mondy,1993, asam askorbat dapat menghambat enzim PPO pembentuk

melanin.

Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses

oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi, zat

yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah.

Antioksidan juga didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel

dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit,

radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal

lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang

3

tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul

biologi.Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber

pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan

protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit lainnya.

Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan

fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat

dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk

menangkap radikal bebas. Antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan,

antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid.

Antioksidan diharapkan aman dalam penggunaan atau tidak toksik, efektif pada

konsentrasi rendah (0,01-0,02%), tersedia dengan harga cukup terjangkau, dan

tahan terhadap proses pengolahan produk. Antioksidan penting dalam melawan

radikal bebas, tetapi dalam kapasitas berlebih menyebabkan kerusakan sel.

Berdasarkan asalnya, antioksidan terdiri atas antioksigen yang berasal dari dalam

tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Adakalanya sistem antioksidan

endogen tidak cukup mampu mengatasi stres oksidatif yang berlebihan. Stres

oksidatif merupakan keadaan saat mekanisme antioksidan tidak cukup untuk

memecah spesi oksigen reaktif. Oleh karena itu, diperlukan antioksidan dari luar

(eksogen) untuk mengatasinya

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dibedakan menjadi antioksidan

primer yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau mengubahnya menjadi

produk yang stabil , dan antioksidan sekunder atau antioksidan preventif yang dapat

mengurangi laju awal reaksi rantai serta antioksidan tersier. Mekanisme kerja

antioksidan selular menurut Ong et al. (1995) antara lain, antioksidan yang

berinteraksi langsung dengan oksidan, radikal bebas, atau oksigen tunggal;

mencegah pembentukan jenis oksigen reaktif; mengubah jenis oksigen reaktif

4

menjadi kurang toksik; mencegah kemampuan oksigen reaktif; dan memperbaiki

kerusakan yang timbul.

Antioksidan primer berperan untuk mencegah pembentukan radikal bebas baru

dengan memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih

stabil. Contoh antioksidan primer, ialah enzim superoksida dimustase (SOD),

katalase, dan glutation dimustase. Sedangkan, Antioksidan sekunder berfungsi

menangkap senyawa radikal serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh

antioksidan sekunder diantaranya yaitu vitamin E, Vitamin C, dan β-karoten. Dan

Antioksidan tersier berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang

disebabkan oleh radikal bebas, Contohnya yaitu enzim yang memperbaiki DNA pada

inti sel adalah metionin sulfoksida reduktase.

b. Uji Ketengikan Lemak

Reaksi oksidasi lemak/minyak merupakan reaksi yang terjadi jika ada kontak

antara oksigen dengan minyak atau lemak. Reaksi ini mengakibatkan minyak atau

lemak rusak yang ditandai dengan bau tengik. Pada reaksi oksidasi lemak/minyak ini

terjadi proses oksidasi asam lemak tidak jenuh yang akan menghasilkan peroksida

Contoh Reaksi Oksidasi Minyak/Lemak

5

Untuk menghindari terjadinya oksidasi maka digunakan antioksidan.

Antioksidan adalah bahan tambahan yang digunakan untuk melindungi komponen-

komponen makanan yang bersifat tidak jenuh (mempunyai ikatan rangkap),

terutama lemak dan minyak. Meskipun demikian antioksidan dapat pula digunakan

untuk melindungi komponen lain seperti vitamin dan pigmen, yang juga banyak

mengandung ikatan rangkap di dalam strukturnya.

Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi

lemak. Untuk mempermudah pemahaman tentang mekanisme kerja antioksidan

perlu dijelaskan lebih dahulu mekanisme oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari

tiga tahap utama yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi.

Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa

turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat dari

hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Pada tahap selanjutnya, yaitu propagasi,

radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi

(reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan

hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3).

Inisiasi : RH —- R* + H* (1)

Propagasi : R* + O2 —–ROO* (2)

ROO* + RH —–ROOH +R* (3)

Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi

lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida

dan keton yang bertanggungjawab atas flavor makanan berlemak. Tanpa adanya

antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar

radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4)

Terminasi : ROO* +ROO* —- non radikal (reaksi 4)

6

R* + ROO* —- non radikal

R* + R* —– non radikal

Adanya ion-ion logam seperti besi, tembaga, iodium, dll, dapat mendorong

terjadinya oksidasi lemak, pada uji ketengikan lemak ini digunakan kalium iodida,

dimana minyak tidak jenuh yang mengalami oksidasi, ikatan rangkapnya dapat

berubah menjadi peroksida lemak yang ditandai dengan terjadinya ketengikan.

Ikatan rangkap akan mengadisi iodium (I2) sehingga ikatan rangkap pada minyak

hilang. Bersamaan dengan itu warna iodium pun akan hilang.

c. Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis

Lipid merupakan sekelompok senyawa heterogen, meliputi lemak, minyak,

steroid, malam (wax), dan senyawa terkait, yang berkaitan lebih karena sifat fisiknya

daripada sifat kimianya. Lipid memiliki sifat umum berupa : relative tidak larut dalam

air, dan larut dalam pelarut nonpolar misalnya eter dan kloroform.

Peroksidasi (auto-oksidasi) lipid yang terpajan oleh oksigen

bertanggungjawab tidak saja terhadap pembusukan makanan (rancidity,tengik),

tetapi juga kerusakan jaringan in vivo. Peroksidasi ini dapat menjadi penyebab

kanker, penyebab peradangan, aterosklerosis, dan penuaan. Efek merugikan

diperkirakan disebabkan oleh radikal bebas (ROO® , RO® , OH® ) yang dihasilkan

sewaktu terbentuknya peroksida dari asam lemak yang mengandung ikatan rangkap

yang diselingi metilen, yi, radikal bebas asam lemak yang terdapat pada asam lemak

tidak jenuh ganda alami. Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang

menghasilkan radikal bebas secara terus menerus dan peroksidasi lebih lanjut.

Proses keseluruhan dapat diperlihatkan sebagai berikut:

7

1. Inisiasi

ROOH + logam (n)+ ROO® + logam (n-1)+ + H+ X® + RH R® + XH

2. Propagasi

R® + O2 ROO®

ROO® + RH ROOH + R® , dst

3. Terminasi

ROO® + ROO® ROOR + O2

ROO® + R® ROOR

R® + R® RR

Karena precursor molecular untuk proses inisiasi umumnya adalah produk

hidroperoksida ROOH, peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang berpotensi

merugikan. Untuk mengendalikan dan mengurangi peroksidasi lipid, baik manusia

dalam aktivitasnya maupun alam menggunakan antioksidan. Propel galat,

hidroksianisol terbutilasi (BHA), dan hidroksitoluen terbutilasi (BHT) adalah

antioksidan yang digunakan sebagai zat tambahan makanan. Antioksidan alami

antara lain adalah vitamin E (tokoferol) yang larut lipid, dan urat serta vitamin C

yang larut air. Betakaroten adalah suatu antioksidan pada PO2 rendah.

Antioksidan terbagi menjadi dua kelas : 1) antioksidan preventif yang

mengurangi laju inisiasi reaksi berantai; dan 2) antioksidan pemutus-rantai yang

mengganggu propagasi reaksi berantai diatas. Antioksidan preventif mencakup

katalase dan peroksidase lain misalnya glutation peroksidase yang beraksi dengan

ROOH; selenium yang merupakan komponen esensial glutation peroksidase dan

mengatur aktivitasnya serta chelator ion logam, seperti EDTA

(etilendiamintetraasetat) dan DTPA (dietilentriaminpentaasetat). In vivo, antioksidan

pemutus rantai yang utama adalah superoksida dismutase yang bekerja dalam fase

cair untuk mengakap radikal bebas superoksida (O2); urat; dan vitamin E yang

bekerja dalam fase lipid untuk menangkap radikal ROO®

8

Peroksidasi juga dikatalisis in vivo oleh senyawa heme dan oleh lipoksigenase

yang terdapat di trombosit dan leukosit. Produk lain auto-oksidasi atau oksidasi

enzimatik yang penting secara fisiologis adalah oksisterol (dibentuk dari kolesterol)

dan isoprostan (prostanoid).

Gambar diatas merupakan reaksi terjadinya peroksidasi lipid. Reaksi dimulai

oleh suatu radikal bebaas yang sudah ada (X’), oleh sinar, atau oleh ion logam.

Malondialdehid hanya dibentuk oleh asam lemak dengan tiga atau lebih ikatan

rangkap dan digunakan sebagai ukuran peroksidasi lipid bersama dengan etana dari

dua karbon terminal asam lemak ω3 dan pentane dari lima karbon terminal asam

lemak ω6.

9

1.4 Materi Metode

Uji oksidase dalam kentang dan pengaruh pemberian vitamin C

Bahan:

1. Ekstrak kentang2. Larutan fenol 1%3. Larutan pirogalol 1%4. Larutan vitamin C

Cara kerja

BAHAN Tabung1 2 3 4

Ekstrak kentang 5 5 5 5Larutan vitamin C - 10 tetes - 10 tetesLarutan fenol 1% 10 tetes 10 tetes - -Larutan pirogalol 1% - - 10 tetes 10 tetesKocok tabung

Uji ketengikan lemak

Bahan

1. Minyak kelapa dan minyak jagung2. Minyak kelapa yang telah dipanaskan berulang3. Kalium iodide

Cara kerja

BAHAN TABUNG1 2 3

Minyak kelapa 0,5 ml - -Minyak jagung - 0,5 ml -Minyak jagung yang telah digunakan / dipanaskan berulang

- - 0,5 ml

Jumlah KI (hitung jumlah tetesan) hingga warna coklat menetap

10

Uji peroksida lipid dalam cairan biologis

Bahan

1. Hemolisat darah2. Larutan asam trikloroasetat3. Larutan TBA 0,67 %

Cara kerja

BAHAN Uji 1 Uji 2 Uji 3Hemolisat darah (ml) 1 1 -Aquadest (ml) - - 1Larutan TCA 10%, dingin (ml) 2 2 2

Aduk dan sentrifugasi (4000 rpm), ambil supernatanLarutan TBA 0,67 % (ml) 3 3 3

Didihkan 10 menit. Setelah dingin, baca pada ⋋ 532 nmHasil:Kadar MDA

1.5 Hasil Pengamatan dan Lampiran Foto

Tabung Bahan

Vitamin C Tablet Vitamin C cair

1

Ekstrak kentang (5ml)

+ larutan fenol 1% (10

tetes)

Merah kecoklatanOrange

kecoklatan tua

2

Ekstrak kentang (5ml)

+ larutan fenol 1% (10

tetes) + larutan vit. C

(10 tetes)

OrangeOrange

kecoklatan muda

11

3

Ekstrak kentang (5ml)

+ larutan pirogalol

1% (10 tetes)

Coklat Tua Coklat tua

4

Ekstrak kentang (5ml)

+ larutan pirogalol

1% (10 tetes) +

larutan vit C

Coklat muda Coklat muda

ampiran Gambar

Pembuatan Larutan vitamin C

Pembuatan Ekstrak Kentang

12

Vitamin C tablet yang digunakan Tablet vitamin yang digerus dan dilarutkan dalam 60ml

air

Vitamin C cair yang digunakan

Hasil dari ekstrak kentang + substrat + Larutan vitamin

13

Pembuatan Ekatrak kentang. Kentang di blender lalu di

saring dan diambil filtratnya lalu dimasukan tabung reaksi

Hasil penambahan dengan menggunakan vitamin C tablet. Kiri-kanan : tabung 1, 2, 3, dan 4

Hasil penambahan dengan menggunakan vitamin c cair. Kiri-kanan : tabung 1, 2, 3, 4

Uji Ketengikan Lemak Kelompok 5

a. Menggunakan minyak kelapa baru

Percobaan 1 40 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna

menjadi coklat

Percobaan 2 41 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna

menjadi coklat

b. Menggunakan minyak kelapa bekas (setelah dipakai/dipanaskan berkali-

kali)

Percobaan 1 35 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna

menjadi coklat

Percobaan 2 36 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna

menjadi coklat

Tabung Bahan Hasil1

Minyak baru yang sudah

ditetesi larutan iodid

2minyak yang sudah

digunakan /dipanaskan

berulang ditambahi larutan

iodida

14

Uji Peroksida Lemaka. Penentuan kadar MDA pada uji 1

Kadar MDA ¿Aε

¿ 0,044153000

¿2,9×10−7

b. Penentuan kadar MDA pada uji 2

Kadar MDA ¿Aε

¿ 0,025153000

¿1,6×10−7

c. Penentuan kadar MDA pada blanko

Kadar MDA ¿Aε

¿ 0,032153000

¿2,1×10−7

Lampiran foto :

Hemolisat darah Hemolisat dimasukkan ke dalam tabung

Hemolisat darah ditambah TCA

Hemolisat darah + TCA divortex

15

Hasil vortex tabung 1, tabung 2 dan

blanko

Hemolisat darah + TCA setelah di

sentrifugasi

Hasil sentrifugasi Pemisahan supernatan dan

endapan hemolisat darah

Supernatan yang telah diambil + TBA

Supernatan + TBA dipanaskan

1.6 Pembahasan

Pembahasan Uji Oksidase dalam kentang dan pengaruh pemberian vitamin C

Tanpa disadari buah seperti apel, pisang dan kentang, jika sudah dipotong maka warna

daging buahnya berubah menjadi kecoklatan. Dalam ilmu pangan gejala itu di namakan

browning atau pencoklatan. Pencoklatan tersebut diakibatkan karena kerusakan jaringan.

Kerusakan jaringan merupakan kerusakan pada protoplasma sel, sehingga fenolase terlepas

dari organellanya dan menjadi aktif. Apabila fenolase kontak dengan udara, reaksi

pencoklatan secara enzimatis akan terjadi.

Substrat fenolik ini akan bereaksi

dengan enzim fenol oksidase dan oksigen

yang harus berhubungan dengan substrat

tersebut. Ikatan yang terjadi akan

menghasilkan warna coklat yang jika terjadi

16

pada buah potong, akan menurunkan kualitas buah. Dalam bahan pangan seperti kentang,

kelompok enzim oksidase tersebut dan senyawa fenol tersedia secara alami. Enzim yang

bertanggung jawab dalam reaksi pencoklatan enzimatis adalah oksidase yang disebut

fenolase, fenoloksidase, tirosinase, polifenolase, atau katekolase. Enzim polifenol oksidase

atau fenolase terdiri dari 2 tipe enzim, yaitu odifenol dan p-difenol. PPO termasuk dalam

golongan enzim oksidoreduktase. Substrat untuk PPO dalam tanaman biasanya asam amino

tirosin dan komponen polifenolik seperti katekin, asam kafeat, dan asam klorogenat.

Asam klorogenat inilah yang banyak terdapat pada kentang. Oksidasi dari asam

klorogenat yang diikuti oleh polimerisasi (gabungan dari monomer-monomer)

menyebabkan pembentukan quinon yang menyebabkan warna coklat pada umbi yang baru

terpotong Terjadinya reaksi pencoklatan yang dikatalis oleh enzim tersebut, selain ada

subtrat juga harus ada tersedia gugus prostestik Cu++ dan oksigen sebagai asektor

hydrogen. Kebanyakan reaksi pencoklatan dasar reaksi pembentukan melalim berwarna

coklat reaksi pertama diduga sebagi hidrolisasi sekunder O-kuinon atau karena kelebihan O-

difenol. Gugus o-kuinon inilah yang membentuk warna coklat.

Proses penghambatan browning dapat dilakukan dengan menambahkan suatu

antioksidan sehingga enzim yang mengoksidasi akan menggalami kerusakan. Antioksidan

adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal

bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam (Suhartono, 2002). Berdasarkan

sumber perolehannya ada 2 macam antioksidan, yaitu antioksidan alami dan antioksidan

buatan (sintetik) (Dalimartha dan Soedibyo, 1999). Ada banyak tanaman yang dapat

dijadikan sumber antioksidan alami, seperti rempah-rempah, dedaunan, teh, biji-bijian,

serealia, buah-buahan, sayur-sayuran dan tumbuhan laga laut. Bahan pangan tersebut

mengandung jenis senyawa yang memiliki antioksidan, seperti asam-asam amino asam

askorbat, golongan flavonoid tokoferol, karotenoid, tannin, peptide, malanoidin, produk-

produk reduksi, dan asam-asam organic lain (Pratt, 1992).

Tujuan praktikum kali ini adalah mengamati efek penambahan vitamin C (asam

askorbat) terhadap oksidasi yang dilakukan oleh PPO dan fenol pada kentang. Selain fenol

dilihat juga pengaruhnya pada purpurogalin. Penambahan vitamin C dapat menghambat

17

proses pencoklatan pada ekstrak kentang. Hal itu dibuktikan pada praktikum ini, dimana

tabung 2 yang berisi ekstrak kentang yang ditambahkan vitamin c lalu diberi larutan fenol

dan kocok sebentar, mempunyai warna yang lebih orange dibanding dengan tabung 1 yang

berisi ekstrak kentang dan fenol yang berwarna coklat. Selain itu tabung 3 yang berisi ekstra

kentang dan larutan pirogalol 1% juga dibandingkan dengan tabung 4 yang berisi ekstrak

kentang, larutan pirogalol 1% serta vitamin C. perbedaan warnaya pun terlihat, namun tidak

sejelas perbedaan tabung 1 dan 2.

Secara umum, mekanisme antioksidasi yang dilakukan vitamin C adalah memperlambat

laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme di luar mekanisme pemutusan rantai

autooksidasi dengan pengubahan radikal ke bentuk lebih stabil (Gordon, 1990). Mekanisme

yang dilakukan adalah Asam askorbat akan bereaksi dengan oksigen dan akan menghambat

kerja enzim PPO sehingga reaksi oksidasifenol tidak terjadi. Praktikum kali ini juga

membandingkan keefektifan dari vitamin c yang digunakan. Kelompok 2 menggunakan

vitamin c tablet yang dilarutkan terlebih dahulu dan kelompok 3 menggunakan vitamin c

berbentu larutan. Dari hasil yang diperoleh, perbedaan warna yang terjadi lebih jelas

terlihat pada kelompok yang menggunakan vitamin dari tablet yang dilarutkan. Kejadiaan

tersebut dimungkinkan karena vitamin C mudah teroksidasi oleh oksigen bebas, sehingga

sebelum vitamin c bekerja menghambat PPO sudah bereaksi terlebih dahulu dengan oksigen

bebas. Selain itu, konsentrasi vitamin C tablet lebih besar dari vitamin C larutan dimana

dalam vitamin c tablet konsentrasinya 1000mg/60ml dan konsentrasi vitamin C cair

1000mg/140ml .

Besarnya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju

oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan

antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah konsentrasi terhadap laju

oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi sampel yang akan diuji. Antioksidan

skunder, asam sitrat, asam askorbat, dan esternya, sering ditambahkan pada lemak dan

minyak sebagai kombinasi dengan antioksidan primer. Kombinasi tersebut dapat member

efek sinergis sehingga menambah keefektifan kerja antioksidan primer. Antioksidan skunder

ini bekerja antioksidan primer. Antioksidan skunder ini bekerja pada satu atau lebih

18

mekanisme berikut (a) memberikan suasana asam pada medium (sistem makanan), (b)

meregenerasi antioksidan utama, (c) mengkelat atau mendeaktifkan kontaminan logan

prooksidan, (d) menangkap oksigen, (e) mengikat singlet oksigen dan mengubahnya ke

bentuk triplet oksigen.

Selain penambahan vitamin C sebagai penghambat proses browning ada hal-hal lain

yang bisa dilakukan seperti :

1. Mengeluarkan senyawa fenol, yaitu dengan jalan membilas terus menerus

dengan air atau dengan aquadest., melakukan subkult berulang ulang,

mengabsorsi dengan arang aktif, mengabsorsi dengan polyvinylpirolidone

(PVP).

2. Memodifikasi potensial redok media

3. Mengurangi agen yang menyebabkan terjadinya pencoklatan, yang paling umum

biasanya yaitu dengan cara mengurangi jumlah karbohidrat mediu, mengurangi

atau memindahkan kontak dengan oksigen.

4. Menghambat dengan enzim phenol oksidase, untuk ini dapat digunakan ‘chelating

agents’. EDTA telah terbukti dapat menghambat kerja enzim polyphenol oksidase.

5. Pengatur pH rendah, ini dapat dilakukan karena enzim polyphenol oksidase

optimalnya pada pH 6.5 dan menurun seirama dengan turunya pH.

6. Penggunaan ruanggelap, karena kerja enzim polyphenol oksidase.

7. Efektifnya dipengaruhi oleh cahaya. Disarankan penggunaan ruanggelap minimal 14

hari setelah penanaman eksplan (Untung Santoso, 2001) .

Uji Ketengikan Lemak

Pada praktikum kali ini kita mencoba untuk menguji ketengikan lemak. Lemak

adalah suatu asam lemak merupakan suatu rantai hodrokarbon dengan suatu

gugusan karboksil terminal, telah diidentifikasi lebih dari 70 asam lemak yang

tersedia di alam. Asam lemak jenuh tidak mengandung ikatan ganda C=C dalam

strukturnya, sementara asam lemak tidak jenuh memiliki satu atau lebih ikatan

ganda, yang kadang-kadang berada dalam konfigurasi geometris cis. Asam lemak

19

tidak jenuh paling melimpah memiliki satu atau dua ikatan ganda (masing-masing,

asam lemak monoenoat dan dienoat); namun, asam lemak olefinik dengan tiga

(trienoat) dan empat (tetraenoat) ikatan ganda juga ditemukan secara alamiah.

Mula-mula minyak kelapa baru (I) dan minyak kelapa yang sudah dipanaskan (II)

masing-masing disiapkan dalam gelas kimia sebanyak 0,5 ml. Kemudian

ditambahkan tetesan KI (Kalium Iodida) ke dalamnya. Lalu hitung berapa tetes KI

yang ditambahkan sampai kedua minyak tersebut berubah warna menjadi coklat

menetap.

Pada minyak kelapa baru (I) membutuhkan 40 tetes KI untuk membuat warna

minyak menjadi coklat menetap. Minyak kelapa termasuk ke dalam asam lemak tak

jenuh yang mengandung ikatan ganda. Ketika ditambahkan tetesan KI (Kalium

Iodida) maka ikatan rangkap akan mengadisi Iodium (I2) sehingga ikatan rangkapnya

menjadi putus atau hilang. Bilangan iodium adalah suatu ukuran dari derajat

ketidakjenuhan. Lemak tidak jenuh dengan mudah dapat bergabung dengan iodium

(tiap ikatan rangkap dalam lemak dapat mengambil dua atom iodium). Bilangan

iodium ditetapkan sebagai jumlah gram iodium yang diserap oleh 100 gram lemak.

Lain halnya dengan minyak yang sudah dipanaskan (II) membutuhkan hanya 35

tetes KI untuk membuat warna minyak menjadi coklat menetap. Hal ini

menunjukkan bahwa perlakuan pemanasan berulang mengakibatkan meningkatnya

kadar asam lemak bebas. Proses pemanasan pada suhu tinggi dapat mempercepat

proses oksidasi.

20

Bilangan asam lemak bebas yang semakin tinggi mengindikasikan kerusakan

lemak akibat pemanasan. Ketengikan ini terjadi karena proses oksidasi oleh oksigen

terhadap asam lemak tak jenuh dalam minyak atau lemak. Proses oksidasi dapat

terjadi pada suhu kamar dan selama proses pengolahan menggunakan suhu tinggi.

Kerusakan lemak yang utama adalah timbulnya bau dan rasa tengik yang

disebut proses ketengikan. Hal ini disebabkan oleh oksidasi radikal asam lemak tidak

jenuh dalam lemak. Oksidasi dimulai dengan pembentukan radikal-radikal bebas

yang disebabkan oleh faktor-faktor yang dapat mempercepat reaksi seperti cahaya,

panas, peroksida; lemak atau hidroperoksida;

Asam lemak tidak jenuh mengalami oksidasi dan menjadi tengik. Bau tengik yang

tidak sedap tersebut disebabkan oleh pembentukan senyawa-senyawa hasil

pemecahan hidroperoksida yang bersifat sangat tidak stabil dan mudah pecah

menjadi senyawa dengan rantai karbon yang lebih pendek oleh radiasi energi tinggi,

energi panas, katalis logam, atau enzim. Senyawa-senyawa dengan rantai C lebih

pendek ini adalah asam-asam lemak, aldehida-aldehida dan keton yang

bersifat volatil dan menimbulkan bau tengik pada lemak.

Uji Peroksida Lipid dalam cairan biologis

Pada praktikum ini dilakukan Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis, dimana

cairan biologis yang digunakan pada praktikum ini berupa darah yang diambil dari

seorang probandus. Untuk menggambarkan proses peroksidasi lipid perlu dilakukan

analisis kadar MDA. Dimana jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui

berdasarkan kemampuan penyerapan cahaya pada panjang gelombang 532 nm.

21

Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi

peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi Malondialdehida

(MDA) yang merupakan produk hasil peroksidasi lipid dalam tubuh dan terdapat

dalam bentuk bebas atau terkompleks dengan jaringan di dalam tubuh. Reaksi

ionisasi senyawa senyawa radikal bebas juga dapat membentuk MDA dan MDA juga

merupakan produk samping biosintesis prostaglandin (Bird dan Drapper, 1984).

Konsentrasi MDA dalam material biologi telah digunakan secara luas sebagai

indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan

indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996).

Pengukuran MDA dapat dilakukan dengan pereaksi thiobarbituric acid (TBA)

dengan mekanisme reaksi penambahan nukleofilik membentuk senyawa MDA-TBA

(Contiet.a l., 1991). Senyawa ini berwarna merah jambu yang dapat diukur

intensitasnya dengan menggunakan spektrofotometer.

Uji peroksida lipid dalam cairan biologis dalam praktikum ini dilakukan dengan

mengukur kadar MDA dari darah probandus dengan metode spektrofotometri

menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Metode ini merupakan metode yang paling

banyak digunakan untuk mengukur peroksidasi lipid, dikarenakan mempunyai

kepekaan yang cukup tinggi, mudah diaplikasikan untuk berbagai sampel pada

berbagai tahap oksidasi lipid dan biayanya murah serta tidak membutuhkan waktu

yang lama (Nawar, 1985).

Hemolisat darah probandus sebanyak masing – masing 1ml dimasukkan ke

dalam tabung 1 dan tabung ke 2. Sedangkan sebagai perbandingan, digunakan

aquadest sebagai blanko. Masing – masing tabung kemudian dicampurkan dengan

larutan TCA 10% sebanyak 2ml agar terjadi presipitasi protein sehingga tidak

terdapat protein dalam darah yang dapat mengganggu proses selanjutnya, dan

kemudian didinginkan. Disentrifugasi (4000 rpm) dan diambil supernatant dari

22

masing – masing tabung. Kemudian masing – masing tabung ditambahkan 3ml

larutan asam tiobarbiturat (TBA) yang selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan

didinginkan. Lalu dibaca serapan masing – masing pada spektrofotometer dengan λ

= 532 nm.

Metode ini didasarkan pada reaksi antara kompleks MDA dengan TBA dalam

suasana asam yang membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah jambu

yang kemudian diukur intensitasnya dengan spektrofotometer pada panjang

gelombang 532 nm. Senyawa 1,1,3,3-tetraetoksipropana (TEP) digunakan dalam

pembuatan kurva standar karena TEP dapat dioksidasi dalam suasana asam menjadi

senyawa aldehid yang dapat bereaksi dengan TBA (Contiet.a l., 1991).

Berdasarkan hasil percobaan didapatkan bahwa tabung 1 (berisi hemolisat

darah+TCA 10%+TBA), tabung 2 (berisi hemolisat darah+TCA 10%+TBA), dan blanko

(berisi aquadest) setelah diamati masing – masing tabung berwarna keruh

kekuningan. Dan kemudian dibaca serapannya pada spektrofotometer dengan λ =

532 nm nilai absorbansinya adalah 0,044; 0,025; 0,032. Sehingga didapatkan kadar

MDA pada masing – masing tabung adalah 2,9 X 10-7; 1,6 X 10-7; dan 2,1 X 10-7.

Nilai absorbansi dari aquadest (blanko) seharusnya lebih kecil dari nilai

absorbansi sample cairan biologis yang diuji. Hal ini terjadi mungkin disebabkan

karena kelemahan dari metode ini yaitu banyak senyawa yang terdapat pada sampel

biologis seperti karbohidrat, pirimidin, hemoglobin dan bilirubin dapat bereaksi

dengan TBA membentuk senyawa yang dapat menghasilkan warna dan juga

diabsorbsi pada 530 nm (Wade dan Van Ru, 1989 dalam Contiet.al.1991). Beberapa

senyawa tersebut larut dalam asam dan akhirnya tereliminasi oleh pencucian selama

proses presipitasi tetapi beberapa tidak, sehingga menyebabkan interferensi.

Kemudian, selama dekomposisi termal lipoperoksida plasma menjadi MDA, asam

lemak yang tidak terperoksidasi akan terperoksidasi. Inilah yang menjelaskan

23

mengapa hasil penetapan MDA plasma tidak pernah maksimum bahkan setelah

perlakuan pemanasan selama beberapa jam (Hackettet.al., 1988 dalam Contiet.al.,

1991). Serta, dekatnya panjang gelombang eksitasi dan emisi (536 dan 549 nm)

menghasilkan interferensi pada pengukuran florometri akibat difusi Rayleigh

(Caraway, 1986 dalam Contiet.al., 1991). Untuk mencegahnya, bisa mengeksitasi

senyawa florosens pada 515 nm tetapi akan menurunkan sensitifitas dan

spesifitasnya.

Selain itu, hal ini juga mungkin disebabkan karena jumlah supernatant yang

diperoleh dari masing – masing tabung berbeda (tabung 2 jumlah supernatant yang

diperoleh lebih sedikit daripada tabung 1), kurang cepat dan kekurang telitian dalam

melaksanakan prosedur percobaan, kekurang telitian dalam pengunaan alat - alat

dan dalam pengambilan supernatant ada endapan yang ikut terambil serta

pemanasan yang tidak sesuai dengan seharusnya sehingga reaksi yang terjadi kurang

sempurna sehingga hasil yang diperoleh kurang optimal.

Contiet.al. (1991) telah mengembangkan suatu teknik analisa kadar MDA yang

lebih baik daripada teknik sebelumnya. Teknik ini analog dengan teknik HPLC yang

dikembangkan oleh Therasse dan Lemonnier, tetapi dikembangkan metode yang

lebih cepat dan sederhana sehingga bisa digunakan untuk sampel yang berjumlah

banyak. Malondialdehid (MDA) direaksikan dengan diethylthiobarbituric acid

(DETBA) dalam suasana asam, kemudian senyawa yang berwarna diekstrak dengan

butanol dan diukur menggunakan spektroskopi florosens sinkronos yang akan

meningkatkan sensi- tifitas dan spesifitas. Tahapan presipitasi dan pencucian tidak

dilakukan karena rumit dan hanya sedikit meningkatkan spesifitas. Penetapan

dengan florosens sinkronous lebih cepat dari HPLC. Sehingga teknik ini sangat cepat

dan sensitif daripada metode Yagi tetapi hasilnya benar-benar berkorelasi dengan

HPLC.

24

1.7 Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh maka dapat disimpulkan bahwa,

1. Penambahan vitamin C menghambat proses browning menyebabkan warna

larutan tidak berwarna coklat.

2. Konsentrasi vitamin C mempengaruhi efek antioksidan. Pada konsentrasi

tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan antioksidan

tersebut menjadi prooksidan.

3. Proses oksidasi yang terjadi pada kentang akibat PPO yang berikatan dengan

oksigen dan substrat yang berupa fenol menyebabkan browning pada

permukaan kentang yang terpotong.

4. Minyak kelapa baru (I) membutuhkan KI lebih banyak yaitu 40 tetes

dibandingkan dengan minyak kelapayang sudah dipanaskan berkali-kali yaitu

hanya 35 tetes.

5. Proses pemanasan pada suhu tinggi dapat mempercepat proses oksidasi.

6. Ketengikan ini terjadi karena proses oksidasi oleh oksigen terhadap asam

lemak tak jenuh dalam minyak atau lemak.

7. Bau tengik yang tidak sedap tersebut disebabkan oleh pembentukan

senyawa-senyawa hasil pemecahan hidroperoksida yang bersifat sangat tidak

stabil dan mudah pecah menjadi senyawa dengan rantai karbon yang lebih

pendek oleh radiasi energi tinggi, energi panas, katalis logam, atau enzim.

8. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid.

9. Metode ini didasarkan pada reaksi antara kompleks MDA dengan TBA dalam

suasana asam yang membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah

jambu yang kemudian diukur intensitasnya dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 532 nm.

10. Kadar MDA pada tabung 1, tabung 2, dan blanko adalah 2,9 X 10 -7; 1,6 X 10-7;

dan 2,1 X 10-7.

25

11. Konsentrasi MDA dalam material biologi telah digunakan secara luas sebagai

indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan

indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996).

26