8

PENDAHULUAN

Untuk melindungi jaringan dari serangan proteolitik mediasi MMP, MMP disintesis dan disekresikan sebagai zimogen inaktif atau pro-MMP (Ward et al., 1991). Dalam mulut sehat, aparatus ligamentum periodontal penyokong gigi terlindung dari proteolisis mediasi MMP, tetapi pada periodontitis dewasa, hal ini melemah dan akhirnya hilang. Tissue Inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) menghambat MMP yang telah teraktifasi (Overall, 1994). Sehubungan dengan kadar TIMP-1 yang rendah pada GCF dari pasien periodontitis dewasa (Ingman et al., 1996, 1997) tidak mampu untuk menghambat MMP yang meningkat.Pro-collagenase (pro-MMP-8) dan pro-gelatinase (pro-MMP-9) pada GCF terutama berasal dari neutrofil fluid-phase (Golub et al., 1995). Neutrofil degranulasi yang diaktifkan oleh plak bakteri menghasilkan pro-enzim laten (Ding et al., 1996, 1997). Belum begitu jelas bagaimana mereka teraktifasi dalam gingival crevice pada pasien periodontitis dewasa.Stromelysin-1 (MMP-3) mengaktifkan pro-MMP-8 (Ito dan Nagase, 1988) dan pro-MMP-9 (Ogata et al., 1992). Neutrofil tidak mengandung stromelysin-1 (Weiss, 1989). Stromelysin-1 (MMP-3) disintesis oleh fibroblast dan pada tingkat yang lebih rendah, oleh beberapa sel lainnya. Stromelysin juga dihasilkan sebagai pro-enzim laten (Okada dan Nakanishi, 1989; Ingman et al., 1994, 1996). Kami mempertimbangkan bahwa enzim GCF dan stromelysin-1 pada jaringan ginggiva mungkin berperan dalam kaskade aktifasi resiprok, mengarah pada aktifasi pro-collagenase dan pro-gelatinase cairan crevicular.

BAHAN & METODE

Pasien dan Sampel Cairan Crevicular GingivaPasien dirujuk untuk tindakan periodontal di Departemen Periodontologi, Universitas Gazi, Turki, atau di Universitas Helsinki, Finlandia. Komite Etik Lokal menyetujui protokol penelitian. Grup adult periodontitis (AP) terdiri dari 3 wanita dan 4 pria (umur rata-rata, 46 tahun; kisaran, 45-49). Grup kontrol terdiri dari 3 wanita dan 2 pria (umur rata-rata, 31 tahun; kisaran, 19-34) dengan periodontium sehat secara klinis. Informed consent didapat pada perjanjian awal. Diagnosis periodontitis dewasa berdasarkan nilai patologis indeks ginggiva ( 2; Loe, 1967), indeks plak ( 2; Silness dan Loe, 1964), dan pemeriksaan pocket depths ( 4 mm), dikombinasikan dengan keterangan radiografik dari kehilangan tulang seperti yang terdeteksi dari orthopantomograms.Tidak ada subjek penelitian yang menerima tindakan periodontal atau pengobatan selama 6 bulan lalu. Tidak ada pasien yang merokok. Sampling GCF dan pemrosesan telah siap seperti yang dideskripsikan dalam detail di tempat lain (Tervahartiala, 2003). Meskipun usia di antara kedua grup penelitian berbeda, tiada korelasi signifikan antara umur dan penelitian MMP manapun pada pasien periodontitis dewasa atau kontrol, atau pada kombinasi kedua grup, menunjukkan bahwa umur bukan merupakan faktor perancu dalam konteks ini.

Gambar 1. Analisis MMP cairan crevicular gingiva pada pasien periodontitis dewasa dan kontrol yang sehat dengan Western blot dan zymography. (A) Karakteristik berbagai bentuk molekul MMP-3, -8, -9 pada sampel GCF dengan Western blotting; dan (B) karakteristik MMP-9 dengan gelatine zymography (11% acrylamide dengan gel terpisah yang mengandung 1mg/mL gelatin). Eksperimen ini dilakukan oleh 7 pasien periodontitis dan 5 pasien kontrolWestern BlottingBerbagai bentuk molekul MMP-3, -8, dan -9 dari sampel GCF dianalisis dengan western blotting (Ingman et al, 1994). bercak diinkubasi dengan sheep anti-human MMP-3 IgG (2g/ml) (Calbiochem, produk penelitian onkogen, San Diego, CA, USA), atau rabbit anti-human MMP-3 IgG atau MMP-9 igG pada pengenceran 1: 500 dan 1: 1000 (antibodi diberikan oleh Dr.Jurgen Michaelis, Departemen Patologi, Christchurch Medical School, Selandia Baru, Michaelis et al, 1990, dan Dr.Lars Kjeldsen, laboratorium Penelitian Granulosit, rumah sakit Universitas Copenhagen, Kjeldsen et al, 1993). Evaluasi dilakukan dengan pencitraan densitometer model GS-700 dan analis molekuler / PC program (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

ZymographySampel GCF dianalisis untuk aktivitas gelatinolitik dengan menggunakan 7,5% dan 11% gel SDS-poliakrilamida yang mengandung substrat gelatin 1mg/mL (Ding et al, 1997). gel yang diwarnai dihitung dengan pencitraan densitometer model GS-700 (Bio-Rad, hercules, CA, USA).

Pewarnaan Immunohistochemichal MMP-3 di Jaringan GingivaKami mewarnai parafin berukuran 6m (Tervahartiala, 2003) dengan 2 g/mL IgG MMP-3 anti-human (produk Onkogen Penelitian, Calbiochem, San Diego, CA, USA).

Kultur SelFibroblast gingiva manusia diisolasi dengan teknik kultur yang mantained di RPMI-1640 yang mengandung 10% serum janin anak sapi dan antibiotik. sel konfluen dari bagian 4-7 dipindahkan ke RPMI-1640 yang bebas serum selama 24 jam sebelum dikultur tanpa atau dengan TNF- (10 ng / mL, R&D System, Inc, Minneapolis MN, USA).

Aktivitas Assay untuk MMP-3, MMP-8, dan MMP-9Aktivitas MMP diukur dengan metode substrat pro-urokinase yang dimodifikasi (sistem aktivitas assay Biotrak, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inggris) (Hanemaaijer et al, 1998). produksi warna diukur dalam Titertek Multiscan 8-channel fotometer (laboratorium Flow, irvine, Scotland)

Analisis StatistikPerhitungan statistik dibuat dengan menggunakan program analisis data prisma (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA). kami menggunakan analisis variasi satu arah (ANOVA), diikuti dengan beberapa perbandingan uji Bonferroni, untuk membandingkan fibroblast yang terangsang dan yang tidak terangsang . Nilai P kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik. The Mann-Whitney U Test digunakan untuk menganalisis perbedaan antara pasien periodontitis dewasa dan kontrol. Uji korelasi Pearson digunakan untuk menilai korelasi antara MMP-3, -8, dan -9, dan bentuk molekul yang berbeda. Korelasi antara indeks plak dan bentuk pro aktif dari MMP-3 dilakukan dengan uji korelasi Pearson.

HASIL

Proteinase GCF pada Pasien Periodontitis Dewasa dan Kontrol yang SehatAktivitas klinis dan parameter keparahan penyakit lebih tinggi pada pasien periodontitis dewasa dibandingkan kontrol ( p < 0.01, Appendix Tabel 1). Pada pasien periodontitis dewasa MMP-3 meningkat pada uji Western blots di GCF (p=0.003; pro- dan bentuk aktif), sedangkan MMP-8 (p=0.018, pro- dan bentuk aktif) dan MMP-9 (p=0.03: pro-dan bentuk aktif) meningkat lebih lambat (Appendix Tabel 1) (Gbr. 1 A). Rasio proMMP menjadi MMP aktif adalah 0.5 0.1. untuk MMP-3 1.2 0.1, untuk MMP-8 dan MMP-9 pada pasien periodontitis dewasa 3.3 0.7 ( meanSEM) (Lihat Appendix tabel 2). Analisa zymography menjelaskan kemiripan tapi tidak menunjukkan kecendungan yang signifikan untuk jumlah aktivitas gelatinolitik, berisi pro-gelatinase and ikatan gelatinase. (2.156 1.152 vs 0.473 0.277, p >0.05) (Appedix Tabel 1) (Gbr. 1B). Analisis Western blot menjukkan sampel GCF pada kontrol yang sehat hanya menghasilkan 55 kDa pro-MMP-3 (tidak mencapai 45 kDa MMP-3). Pada pasien periodontitis dewasa ProMMP-3 dengan berat molekul 55kDa secara proteolitik menghasilkan 45 kDa MMP 3, berdasarkan pengamatan sesuai dengan bentuk aktif dan degradasi fragmen dengan berat molekul kecil (28 kDa). Beberapa ikatan MMP-3 terdiri dari >100kDa kompleks. Pada kontrol MMP-8 terdapat dalam bentuk laten 75-kDa, yang tidak diproduksi secara menyeluruh atau diproduksi dalam jumlah yang rendah untuk dapat dideteksi. Pro MMP-8 dan MMP-8 60 kDa (aktif) diobservasi pada pasien periodontitis. MMP-8 dengan berat molekul 55-kDa tipe mesenkimal/fibroblast ditemukan pada pasien periodontitis, tapi tidak ditemukan pada kontrol. MMP-8 dengan berat molekul yang besar (> 100 kDa) mewakili kompleks MMP-8 atau dimer-dimer yang terdeteksi pada pasien periodontitis. Sebagian dari MMP-9 secara proteolitik didegradasi menjadi fragmen seberat 82 kDa, 72 kDa, 47 kDa, dan 33 kDa pada pasien periodontitis, tapi tidak pada kontrol. 130 kDa ikatan MMP-9 merepresentasikan komplek MMP-9 dengan neutrophil gelatinase-terkait lipocalin.

Gambar 2. Pewarnaan MMP-3. (A) imunoreaktivitas yang intens terlihat pada jaringan gingiva pasien periodontitis dewasa (n = 7). Fibroblast ditandai dengan panah. (B) pewarnaan MMP-3 lemah pada jaringan yang sehat (n = 5), dimana (C) tidak ada warna yang terdeteksi pada kontrol negatif. Skalabar = 100m.

Korelasi antara Parameter BiokimiaIkatan imunoreaktif aktif MMP-3 memiliki korelasi positif yang kuat dengan MMP-8 aktif (r=0.869, p=0.001) MMP-9 aktif (r=0.8000, p=0.0307) pada pasien periodontitis. imunoreaktivitas menunjukkan keterkaitan yang signifikan antara bentuk pro- dan bentuk aktif MMP-3 (r=0.957, p=0.0007), MMP-8 (r=0.9754, p=0.0002), dan MMP-9 (r=0.895 p=0.04) pada pasien periodontitis dewasa. Korelasi antara pro- dan bentuk aktif molekul MMP-9 telah dikonfirmasi dengan zymography (r=0.9052, p=0.0132). pada kontrol seluruh MMP diamati dalam bentuk laten pro-enzyme, tidak ada korelasi yang signifikan antara MMP-3 dan MMP-8 (r=0.611, p=0.2375 atau MMP-9 (r=0.6098 p=0.2748). index plak menjelaskan peningkatan MMP-3, -8, -9 level di GCF, tetapi tidak ada korelasi yang signifikan antara nilai index plak dan pro- atau bentuk aktif MMP-3, -8, -9 di periodontitis atau kontrol yang di analisis secara terpisah atau bersama.

Pewarnaan Immunohistokimia Jaringan GingivalJumlah sel MMP-3 positif dan intensitas pewarnaannya didapati cukup tinggi pada pasien periodontitis dewasa dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Imunoreaktivitas MMP-3 diamati pada sel yang mirip dengan fibroblast- dan makrofag di jaringan gingiva bergranulasi pada pasien periodontitis (Fig 2). Ada 3.7 el per high-power field (x 400) pada pasien periodontitis (n=7) dibandingkan dengan 1.3 0.4 pada kontrol (n=5) (p=0.0057). kontrol menunjukkan immunoreaktif negatif (Fig 2). Untuk morphometrik, kita meneliti 5 field per section secara acak dan menganalisa 2 section untuk masing-masing pasien.

Pengamatan Kultur Sel Pengukuran MMP aktif dan pro-MMP dengan aktivitas MMP assay menunjukkan peningkatan yang signifikan dari pro-MMP-3 karena adanya stimulasi fibroblast TNF- (p < 0.001). Sintesa MMP-8 dan MMP-9 mengalami peningkatan (Gbr. 3). Kita melakukan akitivitas MMP assay dengan atau tanpa aminophenylmercuri asetat untuk menilai secara terpisah, bentuk total (bentuk pro dan kombinasi bentuk aktif) dan bentuk aktif (hanya enzim, diaktivasi tanpa aktivator eksternal berupa aminophenlymercuric asetat) MMP. Meskipun TNF - secara signifikan meningkatkan sintesis MMP-3, -8, dan -9, semua supernatan MMP-3 pada kultur fibroblast terstimulasi merupakan bentuk laten, dimana MMP-8 dan -9 dalam bentuk aktifnya (Fig 3). Zymography supernatan fibroblast menjelaskan seluruh MMP-9 berada dalam bentuk aktif 82-kDa (Appendix, Gbr.5).

Gambar 3. Aktivitas MMP-3, -8, dan -9 (mean SEM) (A) tanpa APMA dan (B) dengan APMA pada TNF-terstimulasi (+) supernatan fibroblast gingiva selama 48 jam dibandingkan dengan sel yang tidak terstimulasi (-). ***p < 0,001, **p