pengaruh media terkondisi sel punca mesenkimal selaput...

8
J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016 249 Korespondesi: Handi Priambodo E-mail: [email protected]; Hp: 08123185027 Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok; (Studi eksperimental pada mencit) Handi Priambodo, 1 Suradi, 1 Reviono, 1 Yusup S Sutanto, 1 Ana Rima, 1 Harsini, 1 Yuyun Rindiastuti, 2 Abdurahman Laqif, 3 Indah Julianto 2 1 Departemen Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta 2 Departemen Kulit dan Kelamin, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta 3 Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta Abstrak Latar belakang: Asap rokok menyebabkan peradangan paru dan apoptosis yang bermuara terjadinya PPOK. Sekresi sel punca mesenkimal (SPM) berperan penting dalam regenerasi jaringan paru. Penggunaan media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi alternatif untuk transplantasi sel punca mesenkimal. Media terkondisi yang diperoleh dari biakan3D SPM selaput amnion dalam kondisi hipoksia. Tujuan penelitian ini untuk menganalisis pengaruh media terkondisi SPM selaput amnion sebagai anti apoptosis pada kerusakan paru akibat asap rokok. Metode: Penelitian dilakukan dari Februari-Juni 2015. Penelitian ini dilakukan setelah mendapat persetujuan dari komite etik hewan. Untuk menyelesaikan penelitian ini digunakan sebanyak 30 ekor mencit yang diberi asap rokok selama 12 minggu, 15 ekor mencit diberi media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion dan sisanya tidak, selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologi melalui nilai mean linier intercept dan ekspresi active caspase 3 pada jaringan paru hewan coba yang dipapar asap rokok. Dengan uji in vitro sel fibroalveolar yang telah diberi media terkondisi sel punca mesenkimal dan diberi ekstrak asap rokok dinilai menggunakan MTT asay dan konsentrasi VEGF A. Hasil: Media terkondisi sel punca mesenkimal menghambat kerusakan paru yang dikonfirmasi dengan mLi yang rendah, selanjutnya menghambat terjadinya apoptosis sel paru yang dikonfirmasi dengan rendahnya tingkat caspase-3 (p=0.00). selanjutnya secara In-vitro menjelaskan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion mendorong proliferasi sel fibroalveolar (MTT assay; p=0.00), efek anti apoptosis dengan VEGF (VEGF pada media terkondisi sel punca mesenkimal =1082.06 pg/ml; grup kontrol= 261.027 pg/ml) Kesimpulan: Media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion berpotensi menghambat kerusakan paru akibat asap rokok pada mencit dengan menghambat apoptosis sel dengan merangsang VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56) Kata kunci: Media terkondisi sel punca smesenkimal, apoptosis, asap rokok. The Effect of Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell Conditioned Media (MSC-CM) on Cigarette Smoke Induced Lung Damage (an experimental study in mice) Abstract Background: Cigarette smoking causes pulmonary inflammation and apoptosi simplicated in COPD. MSC secreting factors plays crucial role in tissue regeneration. Using MSC conditioned media (MSC-CM) might be an alternativeto MSC transplantation. Conditioned media was obtained from hypoxic 3D culture of amniotic membrane MSC. This study aimed to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke lung damage. The aim of this study is to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke induced lung damage Methods: Research was conducted in 5 months from February to Juni 2015 and under ethical clearance approval. To accomplish this study, 30 mice were exposed to cigarrete smoke for 12 weeks, 15 mice followed by MSC-CM administration and others with unconditioned media, mean linier intercept (mLi) and Caspase-3 were measured from lung histophatology. In vitro study using fibroalveolar cell exposed to cigarette smoke exctract (2%CSE) followed with MSC-CM was conducted to confirm effect of MSC-CM by MTT assay and VEGF level measurement. Result: This research revealed that MSC-CM inhibit lung damage confirmed with significantly lower mLi, while inhibit pulmonary cell apoptosis with significantly lower Caspase-3 level in mice administered with MSC-CM (p=0.00). In vitro study provides the evidence that MSC-CM promote fibroalveolar proliferation (MTT assay; p=0.00), while mediates anti-apoptosis effect which partly depends on up regulating of VEGF (VEGF level of MSC-CM group=1082.06 pg/ml; control group 261.027 pg/ml) Conclusion: MSC-CM has therapeutic potential in cigarette smoke induced lung damage in mice by inhibiting cell apoptosis as well as upregulating VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56) Keywords: Cigarette smoke, apoptosis, stem cell conditioned media

Upload: hoanglien

Post on 05-Mar-2018

243 views

Category:

Documents


7 download

TRANSCRIPT

Page 1: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016 249

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

Korespondesi: Handi PriambodoE-mail: [email protected]; Hp: 08123185027

Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok;

(Studi eksperimental pada mencit)

Handi Priambodo,1 Suradi,1 Reviono,1 Yusup S Sutanto,1 Ana Rima,1 Harsini,1 Yuyun Rindiastuti,2 Abdurahman Laqif,3 Indah Julianto2

1Departemen Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta

2Departemen Kulit dan Kelamin, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta

3Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta

AbstrakLatar belakang: Asap rokok menyebabkan peradangan paru dan apoptosis yang bermuara terjadinya PPOK. Sekresi sel punca mesenkimal (SPM) berperan penting dalam regenerasi jaringan paru. Penggunaan media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi alternatif untuk transplantasi sel punca mesenkimal. Media terkondisi yang diperoleh dari biakan3D SPM selaput amnion dalam kondisi hipoksia. Tujuan penelitian ini untuk menganalisis pengaruh media terkondisi SPM selaput amnion sebagai anti apoptosis pada kerusakan paru akibat asap rokok.Metode: Penelitian dilakukan dari Februari-Juni 2015. Penelitian ini dilakukan setelah mendapat persetujuan dari komite etik hewan. Untuk menyelesaikan penelitian ini digunakan sebanyak 30 ekor mencit yang diberi asap rokok selama 12 minggu, 15 ekor mencit diberi media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion dan sisanya tidak, selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologi melalui nilai mean linier intercept dan ekspresi active caspase 3 pada jaringan paru hewan coba yang dipapar asap rokok. Dengan uji in vitro sel fibroalveolar yang telah diberi media terkondisi sel punca mesenkimal dan diberi ekstrak asap rokok dinilai menggunakan MTT asay dan konsentrasi VEGF A.Hasil: Media terkondisi sel punca mesenkimal menghambat kerusakan paru yang dikonfirmasi dengan mLi yang rendah, selanjutnya menghambat terjadinya apoptosis sel paru yang dikonfirmasi dengan rendahnya tingkat caspase-3 (p=0.00). selanjutnya secara In-vitro menjelaskan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion mendorong proliferasi sel fibroalveolar (MTT assay; p=0.00), efek anti apoptosis dengan VEGF (VEGF pada media terkondisi sel punca mesenkimal =1082.06 pg/ml; grup kontrol= 261.027 pg/ml)Kesimpulan: Media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion berpotensi menghambat kerusakan paru akibat asap rokok pada mencit dengan menghambat apoptosis sel dengan merangsang VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56)Kata kunci: Media terkondisi sel punca smesenkimal, apoptosis, asap rokok.

The Effect of Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell Conditioned Media (MSC-CM) on Cigarette Smoke Induced Lung Damage

(an experimental study in mice)AbstractBackground: Cigarette smoking causes pulmonary inflammation and apoptosi simplicated in COPD. MSC secreting factors plays crucial role in tissue regeneration. Using MSC conditioned media (MSC-CM) might be an alternativeto MSC transplantation. Conditioned media was obtained from hypoxic 3D culture of amniotic membrane MSC. This study aimed to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke lung damage. The aim of this study is to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke induced lung damageMethods: Research was conducted in 5 months from February to Juni 2015 and under ethical clearance approval. To accomplish this study, 30 mice were exposed to cigarrete smoke for 12 weeks, 15 mice followed by MSC-CM administration and others with unconditioned media, mean linier intercept (mLi) and Caspase-3 were measured from lung histophatology. In vitro study using fibroalveolar cell exposed to cigarette smoke exctract (2%CSE) followed with MSC-CM was conducted to confirm effect of MSC-CM by MTT assay and VEGF level measurement.Result: This research revealed that MSC-CM inhibit lung damage confirmed with significantly lower mLi, while inhibit pulmonary cell apoptosis with significantly lower Caspase-3 level in mice administered with MSC-CM (p=0.00). In vitro study provides the evidence that MSC-CM promote fibroalveolar proliferation (MTT assay; p=0.00), while mediates anti-apoptosis effect which partly depends on up regulating of VEGF (VEGF level of MSC-CM group=1082.06 pg/ml; control group 261.027 pg/ml)Conclusion: MSC-CM has therapeutic potential in cigarette smoke induced lung damage in mice by inhibiting cell apoptosis as well as upregulating VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56)Keywords: Cigarette smoke, apoptosis, stem cell conditioned media

Page 2: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016250

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

PENDAHULUAN

Pajanan asap rokok menyebabkan kerusakan jaringan paru melalui mekanisme stress oksidatif, infla­masi menetap, degradasi matriks ekstraseluler oleh akti vitas protease, apoptosis, serta perbaikan abnormal jaringan paru yang bermuara pada terjadinya penyakit paru obstruksi kronik (PPOK).1 Penyakit paru obstruksi kronik adalah salah satu penyebab kematian utama karena merokok dan telah menjadi masalah kesehatan global.2

Stres oksidatif menyebabkan apoptosis sel epi­tel alveolar dan emfisema melalui blokade reseptor vascular endothelial growth factor-A (VEGF­A).3 Tera pi terkini PPOK meliputi terapi suportif dan belum terdapat bukti yang cukup mengenai terapi regenerasi untuk memperbaiki emfisema.2 Schweitzer dkk1 me nun­jukkan penurunan infiltrasi mediator inflamasi dan peru ­bahan emfisematous dengan transplantasi sel punca mesenkimal (SPM) jaringan adiposit dan didapatkan perbaikan endotel paru dengan pemberian media terkondisi sel punca mesenkimal pada jaringan paru tikus model yang dirusak dengan asap rokok. Hal ter sebut menunjukkan bahwa efek perbaikan sel punca mesen­kimal mungkin dimediasi oleh mekanisme parakrin.4

Selaput amnion merupakan salah satu sumber sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan fetal. Selaput amnion telah menjadi sumber sel punca pilihan karena pengambilan sampel yang mudah, tidak dibatasi kendala etik, potensi diferensiasi lebih baik daripada sel punca jaringan dewasa, serta toleransi imunologis yang lebih baik sehingga mudah dan aman untuk ditransplantasikan.5,6

Penelitian mengenai pengaruh media terkondisi sel punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion yang dihasilkan melalui metode biakan 3 dimensi kondisi hipoksia pada hewan model yang dipapar asap rokok untuk menginduksi kerusakan jaringan paru belum pernah dilakukan. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis jaringan paru akibat pajanan asap rokok melalui upregulasi VEGF A yang sejalan dengan peningkatan viabilitas dan proliferasi sel fibroalveolar. Penelitian ini menunjukkan kemampuan

media terkondisi sel punca mesenkimal mencegah apoptosis jaringan paru mencit (mus musculus) galur Balb-c yang dipapar dengan asap rokok. Uji in-vivo menunjukkan bahwa pada kelompok II yang diberi media terkondisi sel punca mesenkimal didapatkan nilai mLi sebagai penanda kerusakan alveolar yang lebih rendah dan ekspresi active caspase-3 sebagai penanda apoptosis yang lebih rendah. Uji in-vitro menunjukkan bahwa pada biakan sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% bersama media terkondisi sel punca mesenkimal memiliki viabilitas dan tingkat proliferasi sel yang lebih tinggi dengan kadar VEGF­A 4 kali lebih tinggi.7

METODE

Cell line yang berasal dari biakan SPM selaput amnion P­1 yang dikembangkan oleh Laqif.7 di thawing untuk dibiakkan kembali dalam media tumbuh (alpha MEM (Gibco), 1% NEAA 100x(Gibco), 1% penstrep (10.000U/10.000ug/ml), 1% fungizone 250ug/ml, dan 10% fetal bovine serum (Gibco) pada inkubator dengan CO2 5% dan 370C. Subkultur sel punca dilakukan pada biakan sel yang telah mencapai konfluensi 70%. Subkultur dilakukan dengan metode tripsinasi hangat. Sel punca mesenkimal selaput am nion P­2 dilakukan purifikasi dengan imunomagnetik sorting. Biakan sel punca dilabel dengan antibodi microbeads anti human CD105 kemudian dilewatkan dalam kolom magnetik yang dipasang dalam magnetic stand untuk memperoleh biakan sel dengan CD105 positif sesuai

protokol yang dianjurkan oleh Myltenill Biotech.7

Uji diferensiasi dilakukan untuk memastikan

multipotensi dan kemampuan diferensiasi SPM. Sel punca mesenkimal P­3 dibiakkan dalam osteogenik media: 192ml media kultur, 10nM dexametason, 20nM beta gliserolfosfat, 50uM L-ascorbic acid; atau adipogenik media: 200ml media kultur, 0.5uM dexametason, 0.5uM IBMX, 50uM indometasin. Setelah 21 hari, biakan SPM diwarnai dengan alizarin red dan oil red. Biakan SPM P­3 dibiakkan dalam neurogenik media: 200ml media kultur, 5ng/ml all trans retinoid acid, untuk mengetahui kemampuan transdiferensiasi menjadi galur sel lain. Setelah 5 hari, biakan sel tersebut diwarnai dengan neural specific enolase (NSE).7

Page 3: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016 251

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

Media terkondisi sel punca mesenklimal dibuat dari biakan sel punca mesenkimal pasase-4 dengan modifikasi metode biakan badan embrioid sel punca dan biakan dalam stirred bioreaktor pada kondisi hipoksia (2.2% O2, 5%CO2, dan nitrogen balanced). Setelah 24 jam inkubasi, media terkondisi sel punca mesenkimal dikumpulkan kemudian difilter dengan millipore 45um dan disimpan dalam suhu ­20oC sampai digunakan.8

Penelitian dilakukan di LPPT unit IV UGM berdasarkan ethical clearance yang diterbitkan oleh panitia kelaikan etik UGM. Sebanyak 30 mencit galur Balb-c dengan berat badan 20­30 gram diasapi dengan rokok 5 batang/hari selama 12 minggu. Mencit dibagi menjadi 2 kelompok yang masing­masing terdiri dari 15 mencit. Mencit pada kelompok I diberi suntikan DMEM 30ul iv, sedangkan kelompok II diberi suntikan 30ul MT SPM iv. Penyuntikan dilakukan pada minggu kedua sampai ke­12, satu jam sebelum pengasapan. Pengambilan jaringan paru dilakukan pada hari ke­90 untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi.7

Potongan longitudinal jaringan paru diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE) untuk analisis mean linier intercept (mLi) dan dengan antibodi anti caspase-3 sebagai penanda apoptosis. Analisis mLi dilakukan ber­dasarkan protokol yang dikembangkan oleh Masaru Suzuki M dkk.8 dengan modifikasi menggunakan soft-ware Image J. Penghitungan intercept dilakukan pada 20 lapang pandang (per besaran 200x) secara acak dalam setiap potongan jaringan paru. Intercept yang dihitung adalah jarak antara dinding alveolar, sedang­kan gambaran dengan bronkus, pembuluh darah, dan ruang alveolar yang terkompresi dieksklusikan dari penghitungan.8

Ekspresi active caspase-3 ditentukan secara otomatis dengan software Image J dengan menentukan resolusi pixel tertentu sesuai dengan intensitas eks­presi positif yang telah ditentukan oleh ahli Patologi Anatomi. Ekspresi active caspase-3 (+) dinyatakan sebagai persentase intensitas warna dalam pixel yang membandingkan ekspresi sel (+) dengan total seluruh sel dalam area perhitungan.7

Preparasi ekstrak asap rokok dilakukan ber­dasarkan metode yang di kembangkan oleh Sun

Yong Kim dkk.9 40 ml asap rokok yang berasal dari rokok filter yang mengandung 8,5mg tar dan 0,9mg nikotin dialirkan melalui spuit injeksi steril ukuran 50ml ke dalam 10ml DMEM tanpa serum sambil diagitasi. Ekstrak asap rokok tersebut disterilisasi menggunakan filter millipore 0.22um dan merupakan ekstrak dengan konsentrasi 100%.10

Isolasi jaringan fibroblas dilakukan dengan metode eksplan dan dibiakkan dengan media kultur DMEM, 10% bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone dalam inkubator CO2 5% dan suhu 370C. Isolasi dan biakan sel epitel alveolar dilakukan berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Robert dkk10 dan dimodifikasi di laboratorium. Sel epitel alveolar dibiakkan dengan media kultur: DMEM­HamF12, 10% fetal bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1% L glutamin, 10ng/ml EGF dalam inkubator CO2 5% dan suhu 370C. Subkultur dilakukan pada biakan sel dengan konfluensi 70­80% dengan metode tripsinasi hangat. Kokultur dilakukan dengan membiakkan sel fibroblas bersama dengan sel epitel alveolar P­3 dalam media: DMEM­HamF12, 10% fetal bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1%NEAA, 1% L-glutamin, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml EGF.10

Uji in-vitro dilakukan pada biakan ko kultur yang telah diinkubasi selama 24 jam. Biakan sel fibroalveolar dibagi menjadi 2 kelompok, Kelompok I diberi ekstrak asap rokok 2% dalam DMEM + 1% FBS, sedangkan kelompok II diberi ekstrak asap rokok 2% dalam media terkondisi sel punca mesenkimal dan diinkubasi selama 24 jam. Biakan sel fibroalveolar dalam piring mikro bersumur 96 digunakan untuk uji proliferasi sel dengan MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide) assay. MTT assay((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) assay pada penelitian ini dilakukan untuk mengukur jumlah sel yang viabel dan proliferasi sel dengan reagen Thiazolyl blue tetrazolium bromide berdasarkan protokol yang diberikan oleh Sigma.7­10

Supernatan biakan sel tersebut dikumpulkan untuk mengetahui sitokin yang dilepaskan dalam

Page 4: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016252

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

media dengan uji ELISA. Dalam uji ELISA ini akan

dilakukan pemeriksaan VEGF­A. Uji ELISA dilakukan

berdasarkan protokol yang diberikan oleh reagen

VEGF­A ELISA kit (RayBio). Kadar VEGF supernatan

pada masing­masing kelompok dihitung menggunakan

rumus regresi yang diperoleh dari larutan standar yang

ditentukan dengan software curve expert 1.4.

Perbedaan rerata nilai mLi, ekspresi active

caspase-3, serta viabilitas dan tingkat proliferasi sel

dianalisis menggunakan uji t tidak berpasangan dengan

software SPSS 19.0 Nilai signifikansi, p<0.05 digunakan

untuk menentukan kemaknaan hasil uji statistik.

HASIL

Sel punca mesenkimal selaput amnion yang

digunakan dalam penelitian ini merupakan cell line

P­1 yang telah dikembangkan oleh Laqif7 dengan

penanda permukaan CD44 dan CD105 (+) >95%

serta CD45 dan CD34 (­)<2%.

Uji diferensiasi dilakukan pada biakan sel punca

P­3 yang telah disorting dengan metode MACS menggu­

nakan antibodi anti CD105 untuk menjamin plastisitas

sel. Gambar berikut menunjukkan hasil uji difersensiasi

SPM menjadi sel osteoblas, adiposit, dan neuron.

a b c

Gambar 1. Gambar (a) biakan sel setelahthawing, viabilitas 94% (b) biakan sel 24 jam setelah ditanam dengan kepadatan 60% (c) biakan sel 48 jam setelah ditanam dengan kepadatan 70­80%. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x

a b c

Gambar 2. Uji diferensiasi sel punca mesenkimal. (A) sel osteoblas dengan pewarnaan alizarin red (B) sel adiposit dengan pewarnaan oil red (C) sel neuron dengan pewarnaan NSE. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x.

Media terkondisi diperoleh dari biakan badan

embrioid 3D dalam stirred bioreaktor sederhana pada

kondisi hipoksia dengan 2.2% O2, 5% CO2, dan nitrogen

balance. Teknik ini memungkinkan aliran oksigen, nut­

rien, dan hasil metabolisme yang menyerupai kondisi

in-vivo. Pada teknik ini didapatkan peningkatan via­

bilitas dan proliferasi sel yang ditunjukkan dengan

peningkatan diameter koloni 3D setelah 24 jam seperti pada gambar berikut

a b

Gambar 3. Gambaran badan embrioid 3D. (A) koloni badan embrioid 3D pada piring mikro berdasar bulat (B) Koloni badan embrioid 3D dalam stirred bioreaktor­hipoksia setelah 24 jam. Terlihat diameter 1.5x lebih besar daripada koloni sebelum dibiakkan dalam stirred bioreaktor­hipoksia. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x

Uji in vivo dilakukan pada hewan coba mencit

(Mus musculus) jantan galur Balb-c yang berusia

10 minggu. Rata­rata berat badan mencit sebelum

perlakuan pada kelompok I adalah 26.55 ± 2.73 gram

dan pada kelompok II adalah 28.56 ± 1.46 gram.

Pada akhir penelitian didapatkan rata­rata berat

badan mencit kelompok I sebesar 37.07 ± 3.49 gram

dan kelompok II sebesar 35.64 ± 2.83 gram. Jaringan

paru pada kedua kelompok diambil setelah 90 hari

perlakuan dan dilakukan pewarnaan menggunakan

HE. Berikut adalah gambaran sediaan histopatologi

jaringan paru yang telah diwarnai dengan HE.

Gambar 4. Gambaran histopatologi jaringan paru dengan pewarnaan HE (pelebaran ruang alveolar; infiltrasi sel radang). (A) Kelompok I, terlihat pelebaran ruang alveolar dan inflitrasi sel radang (B) Kelompok II, terlihat pelebaran ruang alveolar dan infiltrasi sel radang lebih ringan daripada kelompok I. Diamati dengan mikroskop perbesaran 200x.

Page 5: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016 253

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

Analisis kerusakan jaringan paru dilakukan dengan analisis mLi. Rata­rata mLi pada kelompok satu didapatkan 693.43 ± 30.1 um, sedangkan pada kelompok II 480.74 ± 38.0 um. Pada penelitian ini didapatkan perbedaan nilai mLi yang bermakna secara statistik antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan 212.67. Nilai mLi pada kelompok I didapatkan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok II yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat kerusakan paru yang dipapar asap rokok.

Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan imuno­histokimia dengan antibodi anti mouse active caspase-3 untuk mengetahui tingkat apoptosis jaringan paru pada kedua kelompok. Berikut merupakan gambaran sediaan histopatologi yang diwarnai antibodi anti mouse active caspase-3.

Gambar 5. Gambaran histopatologi jaringan paru dengan pewar­naan imunohistokimia antibodi anti mouse active caspase-3 (active caspase­3 positif). (A) Kelompok I (B) Kelompok II. Diamati dengan mikroskop perbesaran 200x.

Rata­rata ekspresi active caspase-3 pada kelompok satu didapatkan 0.033 ± 0.09 %, sedangkan pada kelompok II 0.0045 ± 0.001%. Pada penelitian ini didapatkan perbedaan ekspresi active caspase-3 yang bermakna secara statistik antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan 0.0285. Pada penelitian ini didapatkan ekspresi active caspase-3 pada kelompok I lebih tinggi secara bermakna daripada kelompok II yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis.

Biakan fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok bersama MT SPM menunjukkan konfluensi sel yang lebih banyak dengan gambaran morfologi yang lebih intak. Sedangkan biakan fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok dalam 1% FBS mengalami apoptosis dan kerusakan struktur sel yang ditandai dengan bentuk sitoplasma sel ireguler

Gambar 6. Ko­kultur sel fibroalveolar (A) Kelompok I: sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam DMEM 1% FBS (B) Kelompok II: sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam MT SPM.

Rata­rata viabilitas dan tingkat proliferasi sel kelompok satu didapatkan 58.0 ± 1.31%, sedangkan pada kelompok II 89.6 ± 7.9%. Pada penelitian ini didapatkan perbedaan viabilitas dan tingkat proliferasi sel yang bermakna secara statistik antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan 31.63. Pada penelitian ini didapatkan via bilitas dan tingkat proliferasi sel pada kelompok II lebih tinggi secara bermakna daripada kelompok I yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis dan menjaga viabilitas serta meningkatkan kemampuan proliferasi sel fibroalveolar in-vitro.

Berdasarkan persamaan regresi larutan standar, diperoleh kadar VEGF­A pada kelompok I 261.027 pg/ml dan pada kelompok II 1082.06 pg/ml. Kadar VEGF­A kelompok II didapatkan 4.2 kali lebih tinggi (CI 95%) daripada kelompok I sejalan dengan tingkat proliferasi dan viabilitas sel yang lebih tinggi serta ekspresi active caspase-3 pada jaringan paru mencit yang lebih rendah daripada kelompok II. Hal tersebut mengindikasikan bahwa pengaruh MT SPM dalam meningkatkan proliferasi dan viabilitas sel fibroalveolar serta menghambat apoptosis jaringan paru yang dirusak dengan ekstrak asap rokok yang dimediasi oleh upregulasi VEGF­A.

PEMBAHASAN

Beberapa penelitian menyebutkan bahwa efek regenerasi sel punca tidak dimediasi oleh kemampuan diferensiasi sel punca untuk memperbaiki jaringan yang rusak, melainkan oleh kemampuan sel punca untuk mensekresikan metabolit bioaktif. Faktor­faktor yang disekresikan oleh sel punca meliputi growth factor dan sitokin (secretome), exosome, dan mikrovesikel yang

Page 6: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016254

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

ditemukan dalam media tumbuh dan disebut sebagai

media terkondisi sel punca.11

Sel punca mesenkimal selaput amnion P­3

digunakan untuk membuat media terkondisi dengan teknik badan embrioid 3D pada stirred bioreaktor dalam kondisi hipoksia. Penggunaan sel pada P­3 sejalan dengan penelitian yang menyebutkan bahwa pada tingkatan ini sel bersifat lebih stabil dengan stabilitas kromosom yang baik.12 Penelitian menyebutkan bahwa metode biakan sel punca dalam kondisi hipoksia dapat meningkatkan pluripotensi, kemampuan diferensiasi sel punca, stabilitas genetik, dan meningkatkan ber­bagai sitokin dan growth factor dalam media terkondisi sel punca. Pada penelitian ini, biakan badan embrioid 3D dalam stirred bioreaktor meningkatkan jumlah dan viabilitas sel yang ditunjukkan dengan pertam­bahan diameter badan embrioid. Hal ini sesuai dengan penelitian yang menunjukkan bahwa biakan 3D meningkatkan jumlah sel dan viabilitas bila di­ban dingkan dengan biakan monolayer sehingga jumlah growth factor yang disekresikan lebih banyak. Penggunaan bioreaktor memungkinkan aliran nutrisi, oksigen, dan metabolit sel yang menyerupai ling­

kungan mikro dalam tubuh.13

Kerusakan jaringan paru pada penelitian

ini di tunjukkan dengan nilai mLi. Nilai mLi pada kelompok I didapatkan lebih tinggi secara signifikan daripada kelompok II yang diinjeksi media terkondisi yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat kerusakan jaringan paru. Penelitian melaporkan bahwa pemberian SPM intrapulmonal dapat memperbaiki kerusakan jaringan paru akibat pajanan asap rokok melalui penurunan sitokin pro inflamasi seperti TNFα, IL­1β, MCP­1, IL­6, MMP­9, dan MMP12, peningkatan aktivasi VEGF, VEGFR, dan

TGFβ1 yang sejalan dengan penurunan apoptosis.14,15

Pajanan asap rokok meningkatkan ekspresi

cleaved caspase­3 pada sel alveolar tipe II yang bermuara pada terjadinya apoptosis. Jalur apoptosis ekstrinsik maupun intrinsik menyebabkan fragmentasi DNA yang bermuara pada apoptosis melalui aktivasi cleaved caspase-3.16 Salah satu penyebab apoptosis sel epitel paru adalah penurunan ekspresi VEGF

yang menyebabkan kematian sel endotel alveolar. Gangguan mikrosirkulasi akibat kerusakan sel endotel menyebabkan kematian sel pneumosit. Apoptosis sel epitel alveolar merupakan mekanisme penting yang terlibat dalam kerusakan dinding alveolar yang

bermuara pada terjadinya emfisema.17,18

Ekspresi active caspase-3 pada kelompok I

didapatkan lebih tinggi secara signifikan dibandingkan dengan kelompok II yang diinjeksi MT SPM yang menunjukkan kemampuan media terkondisi dalam menghambat apoptosis pada jaringan paru yang dipapar asap rokok. Hal ini sejalan dengan penelitian yang menyebutkan bahwa transplantasi sel punca mesenkimal sum­sum tulang dapat memperbaiki emfisema akibat pajanan asap rokok. Pada penelitian tersebut tidak didapatkan engraftment sel punca pada jaringan paru tikus setelah 2 bulan yang menunjukkan bahwa sel punca memperbaiki emfisema melalui mekanisme parakrin yang dimediasi oleh sekresi

metabolit bioaktif.14

Penelitian menunjukkan bahwa peningkatan

apoptosis pada PPOK tidak diimbangi dengan pening­katan kapasitas proliferasi.19 Kerusakan paru pada emfisema ditentukan oleh kemampuan proliferasi sel alveolar yang mengikuti apoptosis sel alveolar.20 Uji in-vitro pada sel fibroalveolar paru dilakukan untuk mengetahui mekanisme yang mungkin terlibat dalam pengaruh MT SPM terhadap perbaikan jaringan paru mencit yang dipapar asap rokok. Pada penelitian ini didapatkan tingkat proliferasi sel fibroalveolar paru yang lebih tinggi secara signifikan pada kelompok II dibandingkan dengan kelompok I melalui uji MTT assay. Hasil tersebut sejalan dengan penelitian yang menunjukkan kemampuan sel punca sum­sum tulang dalam meningkatkan survival dan proliferasi biakan sel fibroblas paru yang dirusak dengan ekstrak asap

rokok.1

Penelitian menyebutkan bahwa sel punca

mampu menginduksi aktivasi jalur Akt yang merupakan sinyal penting dalam survival dan proliferasi sel. Selain itu, SPM dapat menekan apoptosis sel alveolar melalui modifikasi ekspresi protein apoptosis dan antiapoptosis. Penelitian melaporkan bahwa SPM

Page 7: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016 255

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

mampu menekan ekspresi gen apoptosis Bax dan menginduksi ekspresi gen antiapoptosis Bcl-2 pada hewan model emfisema yang diinduksi dengan papain. Selain itu, sel punca mesenkimal mampu menekan tingkat ekspresi cleaved caspase-3 pada sel alveolar yang mengindikasikan kemampuan SPM dalam menurunkan apoptosis sel alveolar pada emfisema.20 Metabolit bioaktif dalam media terkondisi sel punca mampu meningkatkan proliferasi sel dengan menghambat interaksi antara p21 dengan PCNA dan memacu pembentukan kompleks CDK4.9

Beberapa growth factor seperti FGF, EGF, dan VEGF berperan dalam menghambat apoptosis sel endotel dan sel alveolar melalui peningkatan ekspresi protein antiapoptosis Bcl-2 dan NOS melalui jalur Akt. VEGF merupakan growth factor yang bersifat pluripoten dan berperan penting dalam proliferasi sel endotel, perkembangan jaringan paru, dan beberapa kondisi patologis seperti PPOK, kanker paru, dan cedera paru akut. Penelitian menyebutkan bahwa pada pasien PPOK terjadi penurunan ekspresi VEGF­A dan VEGFR 2. Selain itu, inhibisi VEGF­A menginduksi apoptosis sel epitel alveolar yang bermuara pada terjadinya emfisema.15 Di lain pihak, penelitian menyebutkan bahwa pada PPOK terjadi peningkatan kadar VEGF, tetapi kadar tersebut tidak mencukupi untuk regenerasi sel alveolar paru. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran kadar VEGF­A yang disekresikan oleh biakan sel fibroalveolar yang dipapar ekstrak asap rokok dan diberi MT SPM untuk mengetahui peran VEGF dalam meningkatkan viabilitas dan proliferasi sel fibroalveolar yang sejalan dengan kemampuannya dalam menghambat apoptosis.

Kadar VEGF­A supernatan didapatkan lebih tinggi 4.2 kali pada kelompok II dibandingkan dengan kelompok I yang mengindikasikan bahwa upregulasi VEGF­A secara fungsional berperan dalam meningkatkan survival dan proliferasi sejalan dengan kemampuan dalam menghambat apoptosis sel fibroalveolar. Jin dkk19 menyatakan bahwa blokade jalur VEGF menyebabkan apoptosis sel alveolar dan penurunan interaksi VEGF­VEGF reseptor pada tingkat protein maupun mRNA ditemukan pada pasien perokok dengan emfisema. Transplantasi

SPM pada hewan model emfisema yang diinduksi dengan asap rokok menunjukkan kemampuan populasi sel tersebut dalam menghmbat apoptosis melalui stimulasi sekresi VEGF dan induksi VEGF reseptor 2 pada sel alveolar.19

Penelitian ini belum dapat menentukan sumber VEGF yang berperan secara fungsional. Pada penelitian ini kemungkinan VEGF yang ber peran dapat berasal dari kandungan VEGF MT SPM yang tinggi berkaitan dengan induksi HIF 1A yang dapat meningkatkan sekresi VEGF. Penelitian ini belum dapat menunjukkan pengaruh MT­SPM dalam memperbaiki kerusakan paru akibat asap rokok khususnya emfisema, Hal tersebut disebabkan oleh beberapa kekurangan dalam penelitian ini, antara lain; penggunaan hewan model pada penelitian ini belum dapat mewakili kompleksitas kerusakan paru akibat asap rokok khususnya PPOK dan masih dibutuhkan penelitian panjang dan lebih mendalam untuk aplikasi MT SPM pada uji klinis. Selain itu, rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini hanya dapat menunjukkan efek proteksi, tetapi belum dapat menunjukkan kemampuan MT­SPM dalam meregenerasi kerusakan jaringan paru yang dipapar asap rokok.

KESIMPULAN

Media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi modalitas terapi dalam menghambat kerusakan jaringan paru akibat pajanan asap rokok. Penelitian ini menunjukkan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal yang dibuat dengan teknik 3D hipoksia dapat menghambat kerusakan dan apoptosis jaringan paru pada mencit yang dipapar asap rokok. Selain itu, media terkondisi sel punca mesenkimaldapat mempertahankan viabilitas dan tingkat proliferasi biakan sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok melalui upregulasi VEGF A.

DAFTAR PUSTAKA.

1. Huh JW, Kim SY, Lee JH. Bone marrow repair cigarette smoke­induced emphysema in rats. Am J Physiol lung Cell mol physiol. 2011;301:255­66.

Page 8: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput ...jurnalrespirologi.org/wp-content/uploads/2017/06/JRI-2016-36-4-249.pdf · sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016256

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

2. Barnes PJ. The cytokine network in asthma and COPD. The journal of clinical investigation. Am J Respir Cell Mol Biol. 2008;41:3546­56.

3. Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Stewart LT, Kasahara Y, Salvemini D. Oxidative stress and apoptosis interact and cause emphysema due to vascular endothelial growth factor receptor blockade. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003;29:88­97.

4. Schweitzer KS, Johnstone BH, Garrison J, Rush NI, Cooper S, Traktuev DO. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:215­25.

5. Niknejad H, Pierovi H, Jorjani M. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells and Materials. 2008;15:88­99.

6. Mihu CM, Ciuca DR, Soritau O. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from amniotic membrane. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 2009;50:73­7.

7. Laqif A. Kajian terapi media terkondisi sel punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion terhadap folikulogenesis pada kasus kegagalan ovarium prematur (penelitian pada hewan coba tikus sprague dawley). Disertasi program studi ilmu kedokteran dan kesehatan reproduksi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta; 2013.

8. Suzuki M, Betsuyuku T, Ito Y. Curcumin atte­nuates elastaseand cigarette smokeinduced pul monary emphysema in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:L614­62.

9. Kim SY, Lee JH, Kim HJ. Mesenchymal stem cell conditioned media recovers lung fibroblast from cigarette smoke induced damage. Am J Physiol lung cell mol physiol. 2012;302:891­908.

10. Robert FG and Leland GD. Isolation and culture of pulmonary alveolar epithelial type I and type II cells from rat lungs. Methods Mol Biol. 2013; 945:145­59.

11. Lane SW, Williams DA, Watt FM. Modulating the stem cell niche for tissue regeneration. Nature Biotechnology. 2014;32:1­9.

12. Rungarunlert S, Techakumphu M, Pirity MK, Dinnyes A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bio­reactors. WJSC. 2009;1:1­11.

13. Pawitan JA. Prospect of stem cell conditioned medium in regenerative medicine. BioMed Research International. 2014;96:14.

14. Zang X, Zheng H, Zhang H, Ma W, Wang F, Liu C, et al. Increased interleukin (IL)­8 and decreased IL­17 production in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) provoked by cigarette smoke. ELSEVIER. 2011;56:717­25.

15. Guan XL, Song L, Han FF, Cui ZL, Chen X, Guo XJ, et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke­damaged lung and pulmonary function partly via VEGF–VEGF receptors. Journal of Cellular Biochemistry. 2013;114:323­35.

16. Ahmed A, Thliveris JA, Shaw A, Sowa M, Gilchrist J, Scott JJE. Cigarette smoke induces apoptosis by activation of caspase­3 in isolated fetal rat lung type II alveolar epithelial cells in vitro. Open Journal of Respiratory Diseases. 2013;3:4­12.

17. Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene. 2003;22:8543­67.

18. Platiki M, Eleni T, Raytila P. Apoptotic mechanism in the pathogenesis of COPD. International journal of COPD. 2006;1:161­17.

19. Jin Z, Pan X, Zhou K, Bi H, Wang L, Yu L et al. Biological effects and mechanisms of action of mesenchymal stem cell therapy in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Inter na­tional Medical Research. 2015;43:303­10.

20. Rangasamay T, Misra V, Zhen L. Cigarette smoke induced emphysema in A/J mice associated with oxidative stress, apoptosis of lung cells, and global alteration of gene expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:888­900.