BAB IPENDAHULUAN

Analisis kuantitatif mikroorganisme pada suatu sediaan farmasi, makanan, minuman dan kosmetik penting dilakukan untuk mengetahui mutu suatu sediaan dari bahan farmasi. Dalam analisis kuantitatif tersebut terdapat beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah mikroorganisme di dalam suatu bahan atau sediaan farmasi, makanan, minuman, dan kosmetika. Pemeriksaan terhadap bakteri yang dicurigai sebagai pencemar makanan terbagi menjadi 3 bagian, yaitu uji patogen dan toksin yang dihasilkan, uji kelompok organisme, dan uji terhadap indikator keberadaan mikroorganisme. Ketiga pemeriksaan ini biasanya diberlakukan oleh industri makanan dan bahan pengawas makanan yang bertujuan untuk menilai potensi keberadaan bakteri patogen dan toksin yang dihasilkannya, keberadaan bakteri pembusuk, perkiraan besaran kandungan bakteri, dan penyimpanan serta kecocokan makanan atau zat yang terkandung dengan tujuan tertentu. Terdapatnya cemaran mikroorganisme dalam perbekalan farmasi dan makanan kemungkinan disebabkan oleh cara pengolahan yang tidak bersih atau higienis, cara pengepakan yang kurang baik, dan cara penyimpanan yang tidak baik. Sedangkan sumber-sumber asal yang memungkinkan terjadinya cemaran mikrobiologi pada produk tersebut adalah dari udara, air, tanah, peralatan yang digunakan pada waktu pengolahan ataupun petugas yang melakukan pengolahan. Analisis mikrobiologi pada makanan merupakan bagian dari pelaksanaan keamanan mikroba dalam rantai makanan. Kriteria proses higienis untuk kebanyakan bahan makanan termasuk pengujian untuk total viable count (TVC) dan Escherichia coli. TVC memberikan ide kuantitatif untuk menghadirkan mikroorganisme aerob mesophilic dari hewan asli (ISO 4833, 2003). Hal ini menjadi kriteria yang penting untuk mengevaluasi kualitas mikroba dalam berbagai macam makanan dan juga tingkat kesegaran pada makanan. Mula-mula, pada abad 19, E.coli dikenal sebagai indikator yang baik untuk kontaminasi faecal. E.coli pada umumnya merupakan flora normal yang terdapat di dalam pencernaan manusia dan hewan. Hanya spesies pada kelompok coliform yang dapat ditemukan pada saluran intestinal manusia dan hewan berdarah panas, memberikan angka yang besar (109 CFU g-1) di dalam feses. Beberapa strains yang dikembangkan memiliki kemampuan yang menyebabkan penyakit pada gastrointestinal, saluran urin, atau sistem saraf pusat pada kebanyakan manusia. Mayoritas seluruh dunia pada kasus penyakit seperti ini disebabkan karena strain dari serotype O15:H7, yaitu enterehemorrhagic E.coli (EHEC). Hal tersebut dapat membentuk koloni pada saluran usus manusia dan menyebabkan diare, hemorrhagic colitis, dan sindrom hemolytic-uremic. Kedua kontrol, baik pembuat dan penyelenggara bisnis makanan individual menggunakan analisis mikrobiologi dengan tujuan monitoring kualitas mikrobiologi pada bahan baku dan penyelesaian produk, serta status mikrobiologi pada prosedur pembuatan. Pengujian pemenuhan atau penilaian dari Hazard Analysis Critical Kontrol Points (HACCP) sebagai strategi penyelenggara, dimana analisis mikrobiologi penting untuk dilakukan. Metode standarisasi (metode ISO) dinyatakan sebagai metode referensi analisis untuk kontrol resmi. Metode standarisasi ini didasarkan pada metode konvensional standar kultur mikrobiologi yang secara luas digunakan untuk analisis makanan di laboratorium. Teknik ini menghadirkan beberapa kesulitan, seperti subyektivitas dalam interpretasi beberapa pengujian biokimia maupun morfologi dan kemungkinan interferensi pada matriks, khususnya ketika menunjukkan kontaminasi pada level yang tinggi. Sebagai tambahan, karakterisasi dengan biaya yang mahal pada metode tersebut, keduanya berhubungan dengan tenaga kerja dan persediaan serta keseluruhan, dimana membutuhkan waktu yang panjang untuk mendapatkan hasil yang pasti (dari 3 hingga 7 hari). Alasan ini yang membawa untuk mengembangkan dan memperbaiki metode alternatif mikrobiologi untuk analisis. Seperti metode alternatif yang lebih cepat dan mudah untuk dilakukan, sesuai untuk metode referensi dan beberapa dapat dilakukan secara otomatis. Oleh karena itu, prasyarat untuk penjualan dan penggunaan berbagai macam metode alternatif memberikan bukti bahwa hal ini menghasilkan kesetaraan apabila sesuai dengan metode referensi. Penyediaan metode alternatif, industri makanan dan minuman, pelayanan kesehatan masyarakat dan pembuatan lainnya yang membutuhkan protokol keadaan yang dapat diandalkan untuk validasi seperti metode alternatif.Pada konteks ini, MBS srl telah dikembangkan sebagai metode alternatif, yang disebut sebagai metode Micro Biological Survey (MBS). Metode ini merupakan sistem cepat kolorimetri untuk mendeteksi dan memillih perhitungan bakteri yang terdapat pada makanan, air dan lingkungan sampel. Metode MBS menggunakan kit analisis yang dapat dibuang, reaksi pada vial yang siap digunakan untuk analisis cepat mikrobiologi. Analisis ini didasarkan pada perubahan warna dalam isi vial yang disebabkan karena adanya bakteri. Analisis ini dapat dilaksanakan tanpa personel yang terlatih dan dimanapun ketika dibutuhkan, tanpa membutuhkan alat instrument lain. Metode MBS mengukur mengukur aktivitas katalitik dari enzim redoks yang merupakan jalur metabolik utama pada bakteri, dimana terjadi korelasi antara aktivitas enzim yang diamati dan angka dari sel yang hidup pada sampel. Waktu yang dibutuhkan untuk terjadi perubahan warna merupakan hubungan terbalik pada log konsentrasi bakteri, seperti reaksi enzimatik, angka yang lebih baik pada bakteri, dan perubahan warna yang cepat. Tujuan dari studi ini adalah validasi primer pada metode MBS sesuai pedoman ISO 4833 (2003) untuk kedua pengujian yaitu TVC dan E.coli.

BAB IIBAHAN dan METODE

Analisis statistik kontaminasi buatan pada sampel air Perbandingan antara metode MBS kolorimetri dan metode perhitungan angka lempeng untuk mendeteksi dan perbedaan perhitungan dari TVC dan E. coli dalam kontaminasi buatan pada sampel air dilakukan menurut ISO/IEC 170 25 (2005) mengikuti standar internasional ISO/TR 13843 (2000), menggunakan metode referensi yang dideskripsikan oleh ISO 9998 (1991).

Strain BakteriSemua strain yang digunakan dalam analisis statistik adalah yang tersedia pada ATCC (American type Cultur Collection). Strain yang digunakan didalam analisis statistik antara lain Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Listeria Innocua (ATCC 33090), Escherichia coli (ATCC 25922), Escherichia coli O15:H7 (ATCC 35150), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), dan Enterococcus faecalis (ATCC 29212).Persiapan sampel dengan kontaminasi buatanSampel air steril yang dicemarkan dengan campuran diatas mengindikasikan mikroorganisme yang tumbuh setelah dilakukan kultur selama semalam dengan beberapa pengenceran dalam larutan steril saline hingga pengenceran 10-8. Sepuluh pengenceran yang berbeda dari sepuluh sampel yang berbeda dianalisis menggunakan kedua-duanya yaitu TVC dan E.coli. Setiap pengenceran yang diuji dilakukan replikasi sebanyak 2 kali dengan masing-masing matode MBS dan metode referensi perhitungan angka lempeng.

Prosedur metode MBS kolorimetriProsedur analisis untuk metode MBS kolorimetri kuantitatif merupakan dasar dari pemeriksaaan kolorimetri, menggunakan indikator redoks sebagai perubahan bagian oxidoreduktif didalam reaksi. Untuk analisis menggunakan metode MBS, siap untuk digunakan vial MBS, sterilisasi dan mengandung reagen yang digunakan untuk analisis. Dua macam perbedaan dari vial yang digunakan yaitu vial untuk analisis TVC dan vial untuk analisis E.coli. untuk melaksanakan analisis, 10 mL air destilasi steril dan 1 mL dari sampel ditambahkan ke vial yang satu atau jenis yang lain, tergantung dari tipe analisis yang dilakukan. Selanjutnya, dilakukan inkubasi vial pada suhu 30C untuk TVC dan 44C untuk E.coli. TVC yang dideteksi dan dihitung menggunakan MBS didefinisikan sebagai mikroorganisme aerob yang mampu untuk tumbuh didalam medium yang lengkap. E.coli didefinisikan sesuai dengan pedoman European Directive 91/492/CEE, sebagai coliform thermophilic yang memproduksi indol dari triptofan setelah inkubasi 442C selama 24 jam. Warna mula-mula adalah biru untuk vial TVC dan kemerahan untuk vial E.coli, dengan adanya mikroorganisme, warna pada vial akan berubah menjadi warna kuning yang mengindikasikan hasil positif. Waktu untuk perubahan warna menjadi kuning merupakan hubungan terbalik pada kandungan bakteri dalam sampel analisis. Warna awal yang tetap setelah 24 jam mengindikasikan hasil negatif (tidak terdapat mikroorganisme). Konfirmasi pengujian E.coli dilakukan melalui beberapa tetes reagen Kovacs (isoamil-alkohol, p-dimetilaminobenzaldehid, asam hidroklorat pekat) setelah perubahan warna terjadi dari kemerahan menjadi kuning pada vial MBS E.coli. Pengembangan membentuk cincin merah dinyatakan sebagai produksi indol.Metode Referensi ISO 9998 (1991)100 mikroliter dari sampel yang berbeda ditempatkan pada Tryptic Soy Agar untuk TVC dan Tryptone Bile X-Glukoronida Agar untuk E.coli. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 30C untuk TVC dan 44C untuk E.coli. selama perhitungan TVC, seluruh koloni terlihat setelah 24 jam dan 36 jam pada TSA dianggap positif sementara selama perhitungan E.coli hanya koloni yang berwarna biru pada TBX yang dianggap positif. Untuk analisis statistik, hanya yang memberi hasil positif dan mengandung koloni kurang dari 300 yang digunakan.

Analisis StatistikAnalisis statistik dilakukan sesuai pedoman pada ISO/TR 13843 (2000). Analisis varians satu arah dan analisis varians dua arah dilakukan untuk menentukan penilaian umum dari presisi pada metode kolorimetri yang digunakan dibandingkan dengan metode referensi perhitungan lempeng. Reliabilitas diperhitungkan menggunakan analisis statistik yaitu Coefficient of Variation (CV). Ketidakpastian diperhitungkan menggunakan analisis statistik uji chi-square (X2).

Validasi primerValidasi primer dari metode MBS untuk TVC dan E.coli pada sampel makanan dibuat sesuai dengan pedoman ISO 16140 (2003).

Strains BakteriSemua strain yang digunakan dalam validasi ini tersedia pada ATCC (American Type Culture Collection). Strain yang digunakan pada validasi ini antara lain E.coli (ATCC 25992), E.coli O157 : H7 (ATCC 35150), C.freundii (ATCC 43864), K.pneumoniae (ATCC 13883), E.cloacae (ATCC 13047), E.sakazakii (ATCC 51329), S.enteridis (ATCC 13076), dan S.typhimurium (ATCC 14028), Y.enterocolitica (ATCC 19543), B.cereus (ATCC 11778), B.stearothermophilus (ATCC 24567), B.subtilis (ATCC 6633), L.innocua (ATCC 33090), L.ivanovii (ATCC 19119), L.monocytogenes (ATCC 7644), S.aureus (ATCC 12600), S.epidermidis (ATCC 12228), S.lentus (ATCC 29070), P.aeruginosa (ATCC 27853), R.equi (ATCC 31543), E.faecalis (ATCC 29212), L.delbrueckii subsp.lactis (ATCC 12315), C.perfringens (ATCC 13124), A.niger (ATCC 9642) dan S.cerevisiae (ATCC 9763).Persiapan sampel dengan kontaminasi buatanSampel air steril yang dicemarkan dengan campuran diatas mengindikasikan mikroorganisme yang tumbuh setelah dilakukan kultur selama semalam dengan beberapa pengenceran dalam larutan steril saline hingga pengenceran 10-8. Untuk menguji kesetaraan antara metode MBS dan metode referensi pada sampel dilakukan pengujian secara bersamaan.

Persiapan perbedaan tingkat kontaminasi dari sampel makanan yang terkontaminasi secara alamiLima jenis makanan yang berbeda dipilih untuk validasi, antara lain keju, daging putih, daging merah, sayur, dan buah. Hanya sampel yang terkontaminasi secara alami yang dipilih untuk percobaan ini. Makanan bayi dari tipe bahan makanan yang sama digunakan sebagai kontrol negatif, karenda dipastikan tidak terkontaminasi. Lima tingkat perbedaan dari kontaminasi alami pada sampel yang terkontaminan diukur mengikuti : 100.5 g dari sampel yang terkontaminasi secara alami dilakukan homogenisasi dalam 90 mL air pepton sesuai pedoman ISO 16140 (2003). Kemudian, homogenisasi dilakukan inkubasi pada waktu yang berbeda dan suhu yang berbeda pada tingkat kontaminasi yang berbeda. Untuk menguji kesetaraan antara metode MBS dan metode referensi, sampel dilakukan pengujian bersamaan.

Metode ReferensiMetode referensi untuk TVC dihitung angka lempeng menggunakan Plate Count Agar setelah 72 jam sesuai pedoman ISO 4833 (2003). Untuk E.coli dihitung angka lempeng menggunakan Tryptone Bile X-GLUC Agar (TBX) setelah 24 jam sesuai pedoman ISO 16649-2 (2001).

Analisis DataAnalisis data dilakukan menurut ISO 16140 (2003). Untuk validasi pada metode MBS dianalisis menggunakan tiga metode : linearitas, akurasi, dan selektivitas. Linearitas metode dinilai melalui analisis korelasi menggunakan plot dari konsentrasi bakteri (yang diukur sebagai CFU mL-1) melalui waktu terjadinya perubahan warna. Akurasi dinilai melalui analisis korelasi menggunakan plot dari konsentrasi bakteri (yang diukur sebagai log CFU mL-1) didapatkan menggunakan metode referensi dan metode alternatif MBS. Selektivitas dari metode MBS untuk E.coli diamati melalui perbandingan metode MBS dengan metode referensi, keduanya pada sampel yang mengandung kontaminasi buatan dan sampel yang terkontaminasi secara alami.

BAB IVHASIL dan DISKUSI

HASILAnalisis statistik pada sampel air yang mengandung kontaminasi buatan Diawali dengan penggunaan air steril untuk menghindari gangguan kimia yang disebabkan karena matriks organik. Dalam metode kolorimetri MBS, perubahan warna awal pada vial dari biru untuk TVC dan kemerahan untuk E.coli ke warna kuning yang mengindikasikan hasil positif, yaitu adanya mikroorganisme. Waktu dimana terjadi perubahan warna merupakan hubungan terbalik dengan kandungan bakteri yang terdapat pada sampel analisis (gambar 1a, b). Analisis statistik untuk metode MBS pada TVC dan pada vial E.coli dilakukan sesuai pedoman ISO/TR13843 (2000) menggunakan metode referensi yaitu metode perhitungan lempeng ISO 9998 (1991) pada sepuluh pengenceran yang berbeda dari sepuluh sampel yang berbeda. Reliabilitas metode MBS melalui keterbatasan pengoperasiannya sebanding dengan metode referensi untuk angka lempeng pada konsentrasi diantara 1 x 107 dan