laporan rapd hanni

8/17/2019 Laporan RAPD Hanni

1/15

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Informasi mengenai diversitas genetik digunakan sebagai dasar untuk

meningkatkan kualitas dan kuantitas jenis melalui seleksi. Pengetahuan mengenai

pola variabilitas genetik dari masing masing jenis akan membantu pengembangan

program persilangan (Kidd et al , 1974.

Penggunaan penanda molekuler !"P# pada tanaman antara lain untuk

menentukan keragaman genetik tanaman, mendapatkan hubungan kekerabatan

genetik $ang konsisten dengan keragaman taksonomi, dan dapat digunakan untuk

membedakan klon tanaman komersial $ang tidak dapat dibedakan se%ara morfologi

ataupun fenotipik. Penanda molekuler sangat bermanfaat untuk membantu

memper%epat dan mempermudah perbaikan kualitas tanaman melalui seleksi

(&$am, '1'.

Pada bidang pemuliaan tanaman, pemanfaatan terhadap beberapa jenis

tanaman hingga saat ini masih terbatas pada seleksi dan uji lapangan dengan

menggunakan karakter morfologi dan mendiskripsikan tanaman. Karakter

morfologi telah ban$ak dipergunakan , namun karakter morfologi memiliki kendala

$aitu adan$a faktor lingkungan sehingga perbedaan antar spesies berkerabat dekat

seringkali sulit dianalisis karena tidak memiliki sistem pengendalian genetik $ang

sederhana (&$am, '1'.

"dan$a kondisi geografis $ang beragam memperka$a keragaman genetik

suatu tanaman. Keragaman ini merupakan sumber plasma nutfah $ang besar

manfaatn$a terhadap program pemuliaan $ang diharapkan dapat menghasilkan

varietas $ang unggul. Pertimbangan bah)a sifat morfologi dipengaruhi olehlingkungan menjadi pertimbangan utama dalam melakukan identifikasi tingkat gen

$ang dianggap lebih stabil. Keragaman genetik merupakan variasi gen dalam satu

spesies baik diantara populasi*populasi $ang terpisah se%ara geografis maupun

diantara individu*individu dalam satu populasi. "dan$a keanekaragaman morfologi

erat kaitann$a dengan keanekaragaman genetik (&ijapati et al '+. leh karena

itu, perlu dilakukan praktikum mengenai isolasi #-" genom dan aplikasi teknik


2/15


3/15

1. Waktu dan Temat

Praktikum ini dilakukan di ;aboratorium iorin Pusat "ntar /niversitas IP,

pada tanggal '7 ktober '16.

2. Alat dan Ba!an

"lat $ang digunakan dalam praktikum !"P# adalah mortar2pestle,

mikropipet, mikro tip, mi%rotube sentrifuge, inkubator, sentrifuge, va%um dr$,

spektrophotometer, elektroforesis gel agarosa, mesin thermo%$%ler untuk P! dan

/< transiluminator dilengkapi dengan gel do%.

ahan $ang digunakan adalah 1 sampel daun nanas, li=uid nitrogen, buffer

0", I (Cloroform Isoamilalkohol , PI ( Phenol Chloroform Isoamilalkohol ,

ethanol, -a"% p> 6,', dd>', !-"se, agarose, buffer 0", loading buffer ,

tidhium bromide, master mi? P!, primer P" (', :, 4 dan 1:. Sequence primer

P"' (0@@"@0@, P": ("@0"@" dan P"4 ("@"".

". #ara $erja

". 1. I%&la%' Gen&m Tanaman

#aun tanaman nanas ( Ananas sp. seban$ak ',' %m dipotong ke%il untuk

digerus sampai halus menggunakan pestle dan mortar dengan ditambah larutan

nitrogen %air. &erbuk daun nanas dimasukkan ke tabung eppendorf $ang telah diisi

3 μl larutan buffer 0" (' ? 'A P


4/15

µg

ml

1. rpm pada suhu 4 ℃ selama 1 menit. &upernatan dibuang dan tabung

$ang berisi pelet dikeringkan dengan vakum. Pellet $ang berada pada tabung

ditambahi dengan ' μl dd>' dan !nase seban$ak : μl dan dihomogenkan

dengan spin down. 0abung diinkubasi pada suhu :7 ℃ selama 1 menit.

". 2. Detek%' DNA menggunakan Gel Agar&%a

"da tidakn$a #-" genom tanaman nanas diketahui dengan elektroforesis,

$aitu menjalankan #-" genom hasil isolasi pada gel agarose 1A. &eban$ak 6Dl

#-" genom ditambahi 1Dl loading d$e sampai ter%ampur. ampuran dimasukkan

ke dalam sumur agarosa 1A (,: gram agarose dalam : ml buffer 0" ( Tris

Acetic EDTA 1E. #-" lambda digunakan sebagai marker.

lektroforesis dilakukan selama : menit pada 1


5/15

&ampel $ang digunakan adalah #-" genom tanaman nanas dari hasil Isolasi.

"mplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer P" ', : dan 4 (pada masing2

masing sampel menggunakan mesin thermo%$%ler. "nalisis P! !"P# dilakukan

dengan total 1? reaksi seban$ak 1 Dl. P! mi dibuat dan %ampuran

dihomogenkan kemudian dimasukkan ke dalam mesin thermo%$%ler.

0abel 1. Komposisi P! mi B

Komposisi P! 1 ? 11 ?

0emplate 1 ngG Dl 1 Dl 11 Dl

5aster mi? 6 Dl 66 Dl

Primer P" ', :, 4 ,6 Dl 6,6 Dl

#d>' :,6 Dl :+.6 Dl

Primer P" 1, P" ', P" :1 %uptube 9 Dl Gprimer P" 1 H 1 Dl (total 1 %uptube

1 %uptube 9 Dl Gprimer P" ' H 1 Dl (total 1 %uptube &pin

1 %uptube 9 Dl Gprimer P" : H 1 Dl (total 1 %uptube

Proses reaksi P! dengan menggunakan alat Thermo c!cler seban$ak 4 siklus.

0abel '. Proses amplifikasi #-" dengan teknik P!

-o

.

0ahap &uhu aktu &iklus

1 Pre denaturasi 94 6 menit 1

' #enaturasi 94 1 menit 4

: "nnealing :' : menit 4

4 ?tension 7' ' menit 4

6 Post e?tension 7' 7 menit 1

3 ooling '6 1 menit 1

&etelah proses amplifikasi #-" selesai dilanjutkan dengan proses

elektroforesis. >asil amplifikasi divisualisasikan menggunakan elektroforesis

horiontal dengan gel agarose 1 A ()Gv dalam buffer 1? 0". @el agarose

kemudian direndam dalam larutan tr, sehingga pola pita dapat dilihat di ba)ah

sinar ultraviolet.

". . Anal'%'% data ,APD

/kuran fragmen ditentukan dengan membandingkan terhadap standar 1 Kb

"adder . "nalisis !"P# dengan menggunakan program -0&J&p% (-umeral

0a?onom$ and 5ultivariate "nal$sis &$stem versi '.'. "nalisis similaritas


6/15

dilakukan dengan melihat profil pita #-" hasil elektroforesis pada gel agarose.

>asil analisis !"P# $ang diskoring dengn %ara nilai (jika tidak ada pita dan nilai

1 (jika ada pita pada tingkat migrasi $ang sama. /ntuk melihat koefisen kesamaan

genetik antar sampel nenas berdasarkan !"P# diolah dengan menggunakan

prosedur &I5/"; dan plot tree dengan prosedur Clustering menggunakan

&">-L/P@5".

HA)IL DAN PEMBAHA)AN

1. I%&la%' DNA Tanaman Nana%/ Uj' $uant'('ka%' DNA/ dan Anal'%a dengan

Gel Agar&%aPada praktikum ini, dilakukan isolasi #-" genom terhadap tanaman nanas.

Isolasi #-" nanas diambil dari bagian daun tanaman tersebut selanjutn$a isolasi

dilakukan melalui beberapa tahapan $aitu pelisisan sel dengan metode 0",

presipitasi, pen%u%ian, pemurnian, dan resuspensi. &e%ara tahapan tersebut

dilakukan dengan penambahan sen$a)a kimia. >asil isolasi #-" nanas disebut

isolat $ang digunakan untuk analisa keragaman.

#-" tanaman nanas $ang telah diisolasi, kemudian di %ek kuantitasn$a

dengan metode spektrofotometri untuk mengetahui kemurnian dan konsentrasin$a.

Prinsip metode spektrofotometri adalah menghitung nilai absorbansi pada "'3 dan

"'+. Kemurnian #-" didapat dari perbandingan antara nilai absorbansi "'3G "'+,

dan konsentrasi #-" didapatkan dengan mengalikan nilai absorbansi "'3 dengan

faktor pengen%eran serta mengonversikann$a kedalam nanogram (ng dengan

mengalikan nilai # "'3 $aitu 6 ng.

0abel :. >asil kuantifikasi #-" genom tanaman nanas dengan metode

spektrofotometri

)amle 02 023 $emurn'an $&n%entra%' +ng45l-

1 .1'7 .9: 1.:36 ++9

' .11 .7: 1.:+: 77

: .169 .11 1.446 111:

4 .9 .7: 1.':' 3:

6 .1+ .+1 1.::: 763

3 .14' .111 1.'79 994

7 .1'7 .91 1.:96 ++9


7/15


8/15

5arka !"P# dapat dilakukan dengan mengamplifikasi #-" se%ara random

primer. Primer $ang digunakan pada teknik !"P# ini menggunakan sekuen a%ak

primer dengan 1 pasangan basa untuk menemukan segmen #-" genom untuk

mengungkapkan Polimorfisme. Kun%i metode !"P# bah)a primer $ang

digunakan adalah primer dengan urutan a%ak, primer tidak spesifik untuk gen

tertentu atau dengan urutan tertentu dan mengikat #-" komplemenn$a dari

berma%am2ma%am spe%imen #-". Primer $ang digunakan tunggal dan

menganealing tempat pelekatan primer ( priming site dengan arah $ang berla)anan

untuk terjadin$a amplifikasi. (Kumar and @urusubramanian, '11.


9/15

@ambar '. lektroforegram hasil amplifikasi primer P" ', : dan 4 pada #-" nanas.

5B marker 1 kb ladder, 121 sampel nanas.

erdasarkan hasil elektroforegram, didapatkan 1' total fragmen #-". Pita2

pita #-" $ang teramplifikasi terletak pada posisi antara '6 bp dan : pb.

8umlah fragmen #-" $ang diproduksi untuk setiap primer berkisar antara 1 hingga

+ (@ambar '. Pada primer P" : dan 4 menghasilkan masing2masing + fragmen

#-". 8umlah pita polimorfis terban$ak terdapat pada primer P" : dan 4 $aitu

masing2masing seban$ak +. &edangkan untuk primer P" ' han$a memiliki 3

fragmenG lokus, dan terdapat ' pita monomorfik.

@ambar ' merupakan hasil visualisasi pita #-" dengan metode !"P#.

Polimorfisme !"P# merupakan hasil dari beberapa peristi)a, $aitu i insersi

fragmen #-" $ang besar diantara tempat penempelan primer $ang melebihi

kemampuan P! sehingga tidak ada fragmen $ang terdeteksi, ii insersi atau delesi

ke%il utas #-" $ang men$ebabkan perubahan ukuran fragmen amplifikasi, (iii

delesi salah satu tempat penempelan primer sehingga mengakibatkan hilangn$a

fragmen atau meningkatn$a ukuran fragmen, (iv substitusi satu nukleotida pada

satu atau dua tempat sasaran primer $ang mempengaruhi proses annealing, $ang

berakibat pada ada atau tidakn$a polimorfisme atau merubah ukuran fragmen.

&elanjutn$a ukuran pita $ang terbentuk dihitung ukuran fragmenn$a

menggunakan rumus regresi dan dibuat grafik logaritmikn$a. #ari tabel terlihat


10/15

bah)a pita2pita pada !"P# berdasarkan posisi lokusn$a mengahsilkan fragmen

#-" dengan ukuran $ang berbeda2beda sehingga mengakibatkan polimorfisme.

". Anal'%'% $ekera6atan Antar Ind'7'du dengan Marka ,APDPohon filogenik (dendogram kemudian dibuat berdasarkan metode /P@5"

(#nweighted Pair $roup %ethod with Aritmetic means dengan %ara menurunkan

dari matriks kemiripan genetikn$a. Pada mulan$a metode /P@5" digunakan

untuk tujuan taksonomi, akan tetapi sering pula digunakan untuk pembentukan

pohon filogenik dengan asumsi bah)a ke%epatan mutasi nukleotida atau subsitusi

asam amino mempun$ai laju evolusi $ang sama pada setiap garis keturunann$a

(Kumar et& al& 199:& &ehingga pohon filogenik berdasarkan metode /P@5"

menghasilkan akar pohon. &elain itu mudah dalam interpretasi dan aplikasin$a serta

mengurangi kesalahan2kesalahan stokastik akibat estimasi jarak genetik.

erdasarkan hasil amplifikasi P! selanjutn$a dilakukan skoring (tabel 4

terhadap pita #-" $ang mun%ul angka 1 (jika ada pitaC angka (jika tidak mun%ul

pita, dan dilanjutkan dengan analisis terhadap kekerabatan melalui program

-0&J&. >asil analisis sebagaimana $ang ditampilkan dalam bentuk pohon

kekerabatan pada @ambar :.

0abel 4. #ata biner berdasarkan skoring pita hasil amplifikasi sampel nanas

Kelompok P"2' P"2:

" @ # > I 8

Kel 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel : 1 1 1 1

Kel 4 1 1 1 1 1

Kel 6 1 1 1 1 1 1

Kel 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel + 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Kel 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Pembuatan pohon filogenik membutuhkan data berupa hasil skoring

elektroforegram hasil amplifikasi #-". &etiap pita #-" $ang terbentuk

berdasarkan marka !"P# menunjukan lokus. ;okus tersebut kemudian

diterjemahkan se%ara manual menjadi data biner. &etiap lokus dianggap me)akili

satu karakter dan diberi nilai berdasarkan ada tidakn$a suatu lokus.


11/15

>ubungan kekerabatan genetik antara satu individu dengan individu $ang lain

dapat diukur berdasarkan kesamaan dari sejumlah karakter. Kemiripan genetik antar

individu dalam suatu populasi dapat dianalisis berdasarkan nilai koefisien

kemiripan dan jarak genetik antara satu individu dengan individu $ang lain.

&emakin besar nilai derajat kemiripan genetik antar dua individu berarti semakin

besar kemiripan genetikn$a. &elain itu juga dapat dibuat pohon filogenetik untuk

mengetahui hubungan satu individu dengan individu $ang lain dalam bentuk

dendogram

@ambar : #endogram hasil !"P# menggunakan primer P" ', : dan 4 dari : jenis nanas (nanas 1, ' dan 4.

>asil dendogram !"P# menunjukkan bah)a dari 1 sampel nanas, terdapat

dua kelompok utama $aitu kelompok pertama terdiri atas nanas dari sampel 1 (", '

(, : (, 6 (, 3 (, 7 (@ dan + (>, 9 (I, dan 1 (8 dengan tingkat kemiripan

sekitar ,33. Kelompok kedua terdiri atas sampel nanas 4 (# $ang berdiri sendiri

dimana tingkat kemiripan dengan kelompok pertama sebesar ,3. >al ini

menunjukan bah)a sampe #-" kelompok 4 (# memiliki kekerabatan $ang paling

jauh dibandingkan sampel lainn$a (kelompok pertama $aitu dengan tingkat

kemiripan 3A.

Informasi lain $ang bisa diambil dari pohon filogenetik $ang dihasilkan pada

";P adalah memperlihatkan kemiripan genetik $ang paling tinggi (berkerabat

dekat adalah pada sampel 3 ( dan 7 (@ dengan tingkat kemiripan 1, $ang

berarti ' sampel nanas tersebut merupakan spesies $ang sama. /rutan selanjutn$a

sampel 1 (" dan 9 (I $aitu sekitar ,94. &ampel $ang tergolong dalam satu


12/15

kelompok memiliki pola pita $ang mirip. "dapun sampel $ang memiliki

kekerabatan terjauh adalah sampel nomor 4 (# dengan tingkat kemiripan ,3. .

Kisaran kekerabatan antara kedua kelompok nanas tersebut berkisar antara

.3 2 1.. >al ini menunjukkan bah)a keragaman antara nanas 121 %ukup

beragam. 5enurut livier et al&' (1996 nilai similaritas berkisar antara sampai

1, dan hubungan kekerabatan dekat apabila nilai similaritas mendekati 1.

5enurut >ardi$anto et al ('+ kemiripan genetik merupakan kebalikan

dari jarak genetik. 5akin ke%il nilai tingkat kemiripan, memiliki indikasi makin

jauhn$a kekerabatan genetik sampel $ang diuji. Informasi ini sangat berarti dalam

kegiatan pemuliaan di mana semakin jauh jarak genetik $ang dimiliki suatu sampel

dengan sampel $ang lain akan meningkatkan peluang mendapatkan keragaman

genetik. "pabila diaplikasikan dalam budida$a pemuliaan nanas, hal ini

menunjukkan bah)a antara nanas $ang diuji diatas tidak bisa digunakan dalam

persilangan karena memiliki tingkat keragaman $ang rendah.

Pola konstruksi pohon filogenik tersebut merupakan informasi $ang penting

untuk proses pemuliaan tanaman. 5elalui pola konstruksi $ang terlihat dapat

diketahui individu2individu $ang kekerabatann$a dekat dan $ang jauh, serta

keragaman genetikn$a. &ehingga hasil persilangan $ang bagus nantin$a akan

diperoleh dari persilangan antar individu $ang mempun$ai kemirpan genetik ke%il

atau berjarak genetik besar sehingga dapat mempertahankan keragaman genetik

$ang ada (&ukartini '+.

Kelebihan dari analisis menggunakan !"P# ini adalah han$a memerlukan

sejumlah ke%il dari genom #-" namun menghasilkan tingkat polimorfisme $ang

tinggi selain itu juga memfasilitasi analisis keragaman $ang lebih efektif pada

tanaman. !"P# men$ediakan informasi $ang dapat membantu menentukankekhasan spesies dan filogenetik hubungan pada tingkat molekuler (illiams et al .

199. 5enurut #emeke dan "dams (1994, prosedur !"P# lebih murah, lebih

%epat, membutuhkan sampel #-" lebih rendah (,626 ng, tidak memerlukan

radioisotop, dan tidak terlalu membutuhkan keahlian untuk pelaksanaann$a.

$E)IMPULAN

>asil analisis keragaman metode !"P# dengan menggunakan primer P" ',

:, 4 pada 1 jenis nanas memberikan hasil bah)a antara nanas 121 memiliki


13/15


14/15

&$am, !, @usti !&, dan 5uuni. '1'. @eneti% variation anal$sis of %ashe) trees

( Anacardium occidentale ; in &outheast &ula)esi using ";P. Agronomi 1('B

134217:.

elsh 8, 5%lelland 5. 199. ingerprinting genomes using P! )ith arbitrar$

primers. (ucleic Acid .es. 1+B 7'1:27'1+.

illiams, [email protected]., ".!.K. Kubelik, 8.;. ;ivak, 8.". !afalski, and &.


15/15

laporan rapd hanni

Documents