LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

UJI FISIOLOGIS MIKROBA

Pelaksanaan Praktikum : 24 November 2010

Dosen Pembimbing :

1. Dr. Ni’matuzahroh

2. Fatimah, S.Si, M.Kes

3. Nita Citrasari, S.Si., M. T.

Oleh :

1. Ati Maulin (080911001)

2. Febri Eko W. (080911010)

3. Zefanya Hesa S. L. (080911024)

4. Nuril Ayu A. (080911039)

5. Nazar Fahmi A.S. (080911048)

DEPARTEMEN BIOLOGI

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI LINGKUNGAN

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA

2010

BAB I

1.1 TUJUAN

Mengamati secara langsung maupun tidak langsung produk kegiatan

enzimatik bakteri.

BAB II

2.1 DASAR TEORI

Mikroorganisme yang berbentuk bakteri mampu berada di berbagai tempat

baik melalui udara, bercampur dalam padatan dan berpindah tempat mengikuti

aliran air atau melekat pada benda-benda yang cocok untuk tumbuh dan

berkembang. Bakteri tumbuh dan berkembang pada lingkungan karena adanya

nutrien yang tersedia, suhu yang sesuai, keasaman atau kebasaan (pH) tempat

tumbuh, kandungan udara dan kelembaban udara.

Mikroorganisme menempel pada suatu permukaan melalui beberapa tahap,

yaitu melekat pada permukaan lalu membentuk koloni kemudian tumbuh

membentuk koloni yang lebih besar. Jenis mikroorganisme selain bakteri juga

terdapat jamur/kapang dan khamir, yang tersebar di lingkungan. Untuk

mengetahui spesies suatu biakan mikroorganisme, perlu dilakukan identifikasi.

Tahap pertama melakukan identifikasi adalah pengenalan ciri-ciri morfologi

mikroorganisme tersebut. Pengamatan morfologi dilakukan secara makrokosmis

maupun mikrokosmis.

Mikroba di lingkungan pada umumnya berada dalam populasi campuran

yang sulit ditemukan , dimana mikroba dijumpai sebagai spesies tunggal. Untuk

itu dibutuhkan metode isolasi agar dapat mencirikan dan mengidentifikasi suatu

mikroorganisme tertentu. Pertama kali harus dapat dipisahkan dari

mikroorganisme lainnya yang dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan

menjadi biakan murni. Terdapat dua metode untuk memperoleh biakan murni

yaitu teknik cawan gores dan cawan tuang. Kedua teknik ini berdasarkan pada

pengenceran organisme sehingga dapat dipisahkan hanya spesies tertentu berada

sebagai sel tunggal. Dengan demikian dapat diperoleh ciri-ciri kultural,

morfologis, fisiologis, maupun serologis.

Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak

serupa. Karena itu, ciri fisiologis atau biokimia merupakan kriteria yang sangat

penting dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan

fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan

spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Sehingga mengenal beberapa macam uji

fisiologis sehingga dapat dipergunakan untuk mengidentifikasi organisme tak

dikenal dalam kegiatan berikutnya.

Enam dari 13 uji yang akan dilakukan merupakan reaksi biooksidasi, yaitu

reaksi-reaksi enzimatik yang berkaitan dengan respirasi dan fermentasi. Keenam

uji tersebut adalah fermentasi gula dalam tabung Durham, fermentasi asam

campuran (uji metal merah), fermentasi butanadiol (uji voges proskauer),

produksi katalase, reduksi nitrat, dan uji oksidase. Tiga uji berikutnya yaitu

hidrolisis triptofan (uji indol), hidrolisis urea, dan hidrolisis pati, merupakan

reaksi hidrolisis yang disebabkan oleh enzim-enzim ekstraseluler. Sedangkan uji-

uji lainnya merupakan uji yang secara rutin juga seringkali diperlukan untuk

membantu usaha identifikasi.

Pada uji fermentasi asam campuran (uji metal merah), jika berwarna merah

menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada E.coli. Sedangkan jika

berwarna kuning atau orange menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada

E. aerogenes. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen MR/VP broth

dan memproduksi asam laktat, asam asetat dan asam formiat (formic acid).

Pada uji fermentasi butanadiol (uji Voges-Proskauer), jika berwarna merah

menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada Klebsiella, Enterobacter,

Hafnia, Serratia. Sedangkan jika berwarna kuning menghasilkan negatif (-) dan

biasanya terjadi pada E. coli. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen

MR/VP broth, α-naftol 5%, etil alkohol absolute serta KOH 40% dan

memproduksi asetoin (asetil-metil-karboniol).

Pada uji hidrolisis triptofan (uji indol), jika terbentuk cincin merah

menghasilkan positif (+) dan biasanya terjadi pada E.coli. Sedangkan jika tidak

ada cincin merah menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada K.

pneumoniae. Uji fermentasi ini mempunyai enzim triptofanase (untuk hidrolisis

dan deaminasi triptofan) serta menggunakan media dan reagen Tryptophan broth,

reagen Kovac, dan reagen Ehrlich. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan

amonia.

Pada uji penggunaan sitrat, jika berwarna biru menghasilkan positif (+) dan

biasanya terjadi pada E.aerogenes. Sedangkan jika berwarna hijau menghasilkan

negatif (-) dan biasanya terjadi pada E. coli. Biasanya pada uji ini mampu

memakai natrium sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan garam

ammonium anorganis sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Uji ini menggunakan

media dan reagen Medium Sitrat Simmons. Uji ini memproduksi indol, asam

piruvat dan amonia.

Pada uji hidrolisis hidrolisis urea, jika berwarna merah menghasilkan positif

(+) dan biasanya terjadi pada Proteus. Sedangkan jika berwarna kuning

menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada E. coli. Uji fermentasi ini

mempunyai enzim urease serta menggunakan media dan reagen Stuart’s urea

broth dan Christensen’s urea agar. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan

amonia.

Pada uji fermentasi karbohidrat, jika berwarna kuning menghasilkan positif

(+), hal ini karena memfermentasi karbohidrat yang diuji. Sedangkan jika

berwarna merah menghasilkan negatif (-) dan hal ini tidak memfermentasi

karbohidrat yang diuji. Uji fermentasi ini menggunakan media dan reagen

Buffered Carbohydrate Broth media dan indikator phenol red. Memiliki

mekanisme dari fermentasi karbohidrat memproduksi asam dan terjadi

perubahan indikator phenol red dari merah menjadi kuning.

Pada uji reduksi nitrat, jika berwarna merah dalam waktu ≤ 30 detik

menghasilkan positif (+) karena mereduksi nitrat menjadi nitrit, biasanya terjadi

pada E.coli. Sedangkan jika berwarna warna selain merah (misalnya kuning)

menghasilkan negatif (-) dan biasanya terjadi pada Acinetobacter baumannii. Uji

ini menggunakan media dan reagen nitrate broth atau nitrate agar (slant), reagen

A, dan reagen B. Uji ini memproduksi indol, asam piruvat dan amonia.

BAB III

3.1 ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. Alkohol

2. Kertas plumbun asetat

3. Jarum oseloop dan tusuk

4. Bunsen

5. Korek api

6. Tabung Durham

Bahan :

1. Media Simon Sitrat

2. Media Laktosa Broth dengan tabung durham

3. Kertas Bactident oksidase kit

4. Media TSIA

5. Media SIM

6. Cawan agar petri

7. Air akuades

8. Bakteri Bacillus subtilis

3.2 PROSEDUR KERJA

1) Pada semua tabung dan cawan yang akan diinokulasi, dibubuhkan dengan

nama praktikan, nomor kegiatan, tanggal, serta nama organisme yang

digunakan sebagai inokulum.

2) Mengambil Bacillus subtilis dengan menggunakan jarum inokulasi kemudian

mencampurkannya dengan air akuades sambil diaduk.

3) Menginokulasikan bakteri Bacillus subtilis yang sudah dicampurkan dengan air

akuades pada media yang telah disiapkan seperti media TSIA, media SIM,

cawan agar petri, media sitrat agar, dan biakan kaldu glukosa dalam tabung

Durham dan pada kertas Bactident oksidase kit.

4) Pada media TSIA dengan cara jarum oseloop dimasukkan ke dalam campuran

bakteri dan air akuades kemudian melakukan inokulasi streak (gores) di atas

permukaan media.

5) Pada media sitrat agar dengan cara jarum tusuk dimasukkan ke dalam

campuran bakteri dan air akuades kemudian ditusuk sekali secara tegak lurus

ke dalam sitrat agar, setelah itu melakukan inokulasi streak (gores) di atas

permukaan media (jarum oseloop sudah dimasukkan ke dalam campuran

bakteri dan air akuades).

6) Pada media SIM dengan cara jarum tusuk dimasukkan ke dalam campuran

bakteri dan air akuades kemudian ditusuk sekali secara tegak lurus ke dalam

media.

7) Pada cawan agar petri dengan cara menentukan tiga titik tertentu untuk

meletekkan bakteri

8) Pada biakan kaldu glukosa dalam tabung Durham dengan cara jarum oseloop

dimasukkan ke dalam campuran bakteri dan air akuades kemudian diaduk

hingga rata dalam biakan tersebut.

9) Setelah itu mengisolasi dan menginkubasi media-media tersebut selama ± 24

jam dan mengamati apa yang telah terjadi.

BAB IV

4.1 DATA HASIL PENGAMATAN

Mikroba yang diuji

Uji Fisiologis Menurut Jenis Media

TSIASIM

agar

Simmon’s

Citrate AgarPati Oksidase

Lactose

Broth

Candida albicans- + - + - -

Saccharomyces

cereviceae+ - - - - -

Pseudomonas putida - - - + + -

Bacillus subtilis - + - + - -

Acinetobacter + - - + + -

Sthapylococcus

aureus+ - - - - -

E.coli + + + + + +

4.2 PEMBAHASAN

1. Fermentasi Campuran Gula

Uji ini menggunakan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) zat yang

diujikan yaitu sukrosa, dekstrosa dan laktosa. Uji positif pada uji ini ditandai

dengan perubahan warna yang terjadi menjadi berwarna kuning karena fermentasi

sukrosa, dekstrosa dan laktosa menurunkan pH sehingga media menjadi berwarna

kuning.

Pada hasil TSIA yang menunjukkan hasil positif yaitu pada

Saccharomyces cereviceae, Acinetobacter, Sthapylococcus aureus, dan E.coli.

Mikroba inilah yang dapat memfermentasikan sukrosa, dekstrosa dan laktosa.

Mikroba tersebut memfermentasikan gula yang ada sehingga menyebabkan

penurunan pada pH media yang ditandai dengan perubahan warna menjadi

kuning.

Pada hasil TSIA yang menunjukkan hasil negatif yaitu pada Candida

albicans, Pseudomonas putida, dan Bacillus subtilis . Mikroba – mikroba ini

tidak dapat memfermentasi media TSIA.

2. Uji Motilitas

Uji motilitas ini digunakan untuk megetahui apakah mikroba tersebut

dapat bergerak atau tidak. Dalam uji ini digunakan media SIM (Sulfite Indole

Motility). Bergeraknya mikroba dikarenakan adanya flagella yang dapat

digunakan untuk bergerak. Pergerakan mikroba dapat diamati pada hasil tusukan

yang ada pada tabung berisi media SIM. Jika tusukan lebih keruh dan terdapat

garis – garis seperti akar dapat diduga bahwa mikroba tersebut motil/ dapat

bergerak.

Selain itu terjadinya perubahan warna hitam juga menjadi indicator bahwa

mikroba yang ada pada media bersifat motil. Warna hitam tersebut menunjukkan

bahwa mikroba menghasilkan hidogen sulfida (H2S) hasil hidrolisis asam amino

yang mengandung unsure S.

Hasil pengamatan dari media SIM yang ada uji positif didapatkan pada

tabung yang berisi mikroba : Candida albicans, Bacillus subtilis, dan E.coli. Pada

tabung yang berisi Candida albicans terdapat garis yang melebar dari tempat

penusukan, pada Bacillus subtilis terjadi kekeruhan disekitar tempat penusukan

dan pada E.coli terjadi perubahan warna media menjadi hitam.

Candida albicans Bacillus subtilis E.coli

Sedangkan pada mikroba yang lain tidak terjadi perubahan pada media

SIM sehingga dapat diduga bahwa tidak adanya aktifitas motil dai mikroba.

3. Uji Penggunaan Sitrat

Uji penggunaan sitrat merupakan satu pengujian kelompok tes IMViC.

Pengujian ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme

menggunakan sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon dan energi. Sitrat

merupakam molekul organik yang dapat digunakan mikroba yang memproduksi

enzim sitrase.

Media yang digunakan yaitu Simmons sitrat agar yang mengandung sitrat

sebagai sumber karbon satu – satunya dan indicator pH bromtimol biru yang

menunjukkan warna hijau pada pH 6,9 dan warna biru pada pH 7,6. Mekanisme

yang terjadi seperti berikut :

Citrat permeaseNatrium sitrat Asam piruvat + Asam oksaloasetat + CO2

Citratase

Na+ + CO2 + H2O Na2CO3

Karena Na2CO3 bersifat alkali maka dapat meningkatkan pH sehingga

menunjukkan warna biru pada media.

Hasil pengamatan mennunjukkan hanya pada E.coli yang menunjukkan

adanya uji positif berwarna biru.

E.coli

Hal tersebut sangat bertentangan dengan literatur yang ada, seharusnya

E.coli tidak dapat menghasilkan enzim sitrase yang dapat memanfaatkan sumber

carbon dari sitrat. Perbedaan ini diduga adanya mikroba penghasil enzim sittase

seperti (Enterobacter aerogenes) yang tercampur pada saat melakukan percobaan

uji sitrat, kondisi tidak steril dapat menyebabkan peubahan warna pada media

sitrat.

Sedangkan pada pengujian mikroba yang lainnya hasil uji sitrat negative.

Media sitrat tidak menunjukkan perubahan warna apapun tetap berwarna hijau.

Dibawah ini hasil uji mikroba yang lainnya.

Sthapylococcus aureus Bacillus subtilis Candida albicans Acinetobacter

Pseudomonas putida

4. Uji Hidrolisis Pati

Uji hidrolisis pati bertujuan untuk mengetahui kemampuan mikroba

menghidrolisis pati. Uji positif yang bisa dilihat yaitu berubahnya warna menjadi

bening disekitar koloni mikroba yang ditumbuhkan. Dengan warna bening

tersebut menunjukan bahwa pati telah terhidrolisis menjadi sakarida yang lebih

sederhana seperti maltose dan glukosa sehingga larutan iodium tidak berwarna.

Reaksi yang terjadi yaitu:

Pati glukosa + maltosa Larutan iod tidak berwarna

Sedangkan uji negatif ditandai dengan terbentuknya warna hitam atau kebiru-

biruan disekitar daerah pertumbuhan bakteri setelah penambahan larutan iod, yang

menunjukkan keberadaan amilum/pati yang belum terhidrolisis.

Hasil pengamatan yang menunjukkan hasil positif hasil uji hidrolisis pati

yaitu pada Candida albicans, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis,

Acinetobacter, dan E.coli. Mikroba – mikroba tersebut menunjukkan hasil positif

yaitu warna bening pada daerah sekitar tumbuhnya koloni yang berarti bahwa

mikroba tersebut mampu menghidrolisis pati menjadi sakarida yang lebih

sederhana karena dapat menghasilkan enzim amilase.

Hail pada E.coli terdapat perbedaaan dengan literature. Seharusnya E.coli

tidak dapat menghidrolisis pati karena E.coli tidak dapat menghasilkan enzim

amilase. Hal tersebut dapat diduga karena kurang sterilnya pada saat

menginokulasikan biakan mikroba ke cawan petri sehingga ikut adanya mikroba

lain yang dapat menghidrolisis pati.

5. Uji Oksidase

Uji oksidase digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya enzim

sitokrom oksidase. Dengan menggunakan kertas bactident oksidase kit pengujian

oksidase dapat dilakukan dengan mengambil mikroba yang akan di uji dan

meletakkan pada kertas bactident kit. Uji positif ditandai dengan adanya

perubahan warna menjadi warna ungu gelap, sedangkan uji negative tidak akan

menampakkan warna apapun/ tidak ada perubahan warna pada kertas.

Hasil positif ditunjukkan oleh biakan mikroba Pseudomonas putida,

Acinetobacter, dan E.coli. Pada uji oksidase ini terjadi perbedaan pada E.coli,

seharusnya E.coli tidak memberikan uji positif pada kertas uji karena E.coli tidak

mempunyai enzim sitokrom oksidase. Kemungkinan yang bisa diduga yaitu

biakan E.coli bukan merupakan kultur murni dari E.coli sehingga memberikan uji

positif pada kertas uji.

Uji positif ditunjukan kertas bagian atas yang berwarna ungu sedangkan uji

negative ditunjukkan pada kertas bagian bawah.

Reaksi yang terjadi pada uji oksidasi positif yaitu:

Cytochrome oksidase

Cytochrome c (reduced) + O2 Cytochrome c (oxidized) + H2O

Cytochrome c (oxidized) + oxidase reagent (reduced) Cytochrome c (reduced) + oxidase

reagent (oxidized) [ungu]

6. Uji Fermentasi Laktosa

Uji fermentasi laktosa digunakan untuk mengetahui mikroba yang dapat

memfermentasikan laktosa sehingga dapat membedakan antara mikroba yang

dapat memfermentasi laktosa dan tidak. Media yang digunakan dalam uji ini yaitu

laktosa broth yang berwarna kuning dengan tabung durham didalam media.

Tabung durham digunakan untuk mengetahui adanya gas hasil fermentasi dari

laktosa.

Uji fermentsi laktosa mendapatkan hasil uji positif hanya pada E.coli yang

ditandai dengan adanya gelembung udara pada tabung durham sedangkan pada

tabung yang lain tidak terdapat gelembung udara.

E.coli

Hal tersebut menunjukkan bahwa E.coli dapat memfermentasikan laktosa yang

terdapat pada media menjadi asam dan menghasilkan gas. Pada tabung yang berisi

mikroba lain tidak terjadi hasil uji yang positif. Hal tersebut dapat dikaranakan

mikroba yang dipakai tidak dapat memfermentasikan mikroba, atau terjadi

kesalahan dalam prosedur.

Gelembung udara

BAB V

KESIMPULAN

Uji fisiologis digunakan untuk mengetahiu kegiatan enzimatik mikroba baik

secara langsung maupun tidak langsung seperti:

1. Fermentasi laktosa, sukrosa, dan dextrose

Uji positif : Saccharomyces cereviceae, Acinetobacter, Sthapylococcus

aureus, dan E.coli

2. Penggunaan sitrat sebagai sumber carbon

Uji positif : E.coli

Literatur: E.coli (negative)

3. Hidrolisis Pati

Uji positif : Candida albicans, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, dan

Acinetobacter,

4. Oksidase

Uji positif : Pseudomonas putida dan Acinetobacter

5. Motilitas mikroba

Uji positif : Candida albicans, Bacillus subtilis, dan E.coli

Kesalahan dalam percobaan diduga karena kesalahan prosedur dan kurang

sterilnya dalam percobaan ataupun biakan.

Daftar Pustaka

Anonim. 2009. Uji-Uji Biokimiawi Enterobacteriaceae.

Anonim, 2006. SNI 01-2332.1-2006, Cara uji mikrobiologi – Bagian 1:

Penentuan coliform dan Eschericia coli pada produk perikanan. Standar

nasional Indonesia, Jakarta.

Alexander, Steve K. 2001. Microbiology a Photographic Atlas for the

Laborabory. Canada: Daryl Fox

Dwijoeseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang

Karliana, Itjeu. 2009. Identifikasi Mikroba Air Laut Di Ujung Grenggengan

Semenanjung Muria. Batan: Pusat Teknologi Reaktor dan Keselamatan

Nuklir.

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Universitas Muhamadiyah Malang:

Malang