LAPORANPRAKTIKUMGENETIKAMOLEKULAR

DNAREKOMBINASI

KHAIRULANAMP051090031/BTK

BIOTEKNOLOGISEKOLAHPASCASARJANA

INSTITUTPERTANIANBOGOR2009

0

DNA REKOMBINASI Pendahuluan Plasmid

Plasmid adalah salah satu vektor yang biasa digunakan dalam proses pengklonan gen.

Vektor adalah pembawa molekul DNA di dalam proses pengklonan gen. Plasmid adalah

molekul DNA utas ganda sirkuler (tak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam

sitoplasma, dan dapat melakukan replikasi secara autonom. Karakteristik yang penting dari

plasmid adalah dapat melakukan replikasi, terdapat di luar kromosom, dan secara genetik dapat

ditransfer dengan stabil. Plasmid ini terdapat baik secara alami, maupun sudah mengalami

modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan di dalam manipulasi genetik. Satu sel dapat

mengandung lebih dari satu kopi plasmid.

Plasmid berukuran 1 300 kb, sehingga dapat dibedakan dengan mudah dari

kromosom bakteri yang berukuran 3000 5000 kb. Plasmid yang terlibat dalam proses

konjugasi (plasmid F) biasanya berukuran besar. Untuk replikasi plasmid dapat berada dalam

keadaan terpisah dari kromosom (non-integratif) dan terintegrasi dalam kromosom bakteri

(episom).

Plasmid terdapat di dalam sitoplasma organisme prokaryot dan eukaryot sederhana

uniseluler. Selain terdapat dalam bakteri, plasmid juga terdapat pada Saccharomyces

cerevisiae (plasmid 2 um). Plasmid dapat dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi oleh

gen yang dikandungnya, yaitu : (i) Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yang bertanggung

jawab terhadap proses konjugasi; (ii) Plasmid R (resistensi) mengandung gen resistensi

terhadap antibiotic atau logam berat; dan (iii) Plasmid yang mengandung gen penyandi toksin

dan bakteriosin seperti ColE1 dari E.coli; (iv) Plasmid degradatif yang mempunyai kemampuan

untuk melakukan metabolisme molekul organic seperti toluene (TOL dari Pseudomonas putida);

(v) Plasmid virulensi yang bertanggung jawab terhadap patogenitas dari sel inang (pTi pada

Agrobacterium tumefaciens)

Praktikum ini bertujuan agar praktikan mengerti prinsip dan cara mengisolasi plasmid

dan memisahkannya dari insertnya, dan mengetahui cara visualisasi plasmid dengan metode

elektroforesis.

1

Elektroforesis

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara

langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun

gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat

divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr),

kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet

sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga

molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul

bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari

kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii)

prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan

molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat

media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi.

Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya.

Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi

sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan

elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA

bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub

positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan

loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu

berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam well,

iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat

digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol

blue dan xylene cyanol.

Restriksi

Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu

sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah enzim

yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti diketahui, di dalam

Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu

enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul

2

DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan memotong

sugar phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur

dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua

jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai gunting untuk

memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang

merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar

phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan

spesifik di dalam molekul DNA. Urutan yang spesifik tersebut pada umumnya terdiri dari 4 6

pasang basa dan bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki

urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5 3.

Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-tempat

tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan

memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari

deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung

rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas

molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang

tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong

pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3) menggantung dengan

beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara

spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif.

Enzim restriksi banyak diisolasi dalam bakteri dimana enzim tersebut memotong atau

memisahkan, DNA asing bakteriofage sebelum DNA bakteriofage menyerbu ke dalam dinding

sel bakteri host untuk memproduksi fage-fage yang baru. Sel bakteri resisten karena DNA

mereka dimodifikasi secara kimia, terutama dengan penambahan gugus metil untuk melindungi

situs pengenalan dari restriksi endonuklease sehingga mereka tidak dapat dipotong. Enzim

restriksi dinamakan berdasarkan organisme dari mana enzim tersebut diisolasi. Sebagai contoh

Eco RI yang diisolasi dari Escherichia coli RY13: Eco berasal dari huruf pertama nama genus

dan dua huruf pertama nama spesies; R adalah tipe strain dan I adalah enzim pertama dari tipe

tersebut. Selain itu juga terdapat BamHI enzim pertama yang diisolasi dari Bacillus

amyloliquefaciens strain H, Sau3A merupakan enzim yang diisolasi dari Staphylococcus aureus

strain 3A, TaqI dari Thermus aquaticus, HinfI merupakan enzim pertama yang diisolasi dari

Haemophilus influenzae tipe Rf, dan lain-lain.

Satu unit aktivitas enzim restriksi didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat

memotong 1 ug DNA fage selama 1 jam dalam kondisi buffer yang optimum pada suhu 37o C.

3

Elusi Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik

karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan

dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan

fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan

fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim

restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose.

Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose

yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel

agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan

buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.

Sekarang telah banyak perangkat (kit) yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari gel

agarose, antara lain : GFXTM PCR DNA dan Gel Band Purification Kit dari Amersham

Pharmacia Biotech. Pada praktikum ini dilakukan isolasi DNA dari gel agarose dengan

menggunakan metode yang relatif sederhana dan murah. Selain itu juga akan digunakan kit

dari gel agarose dengan GFXTM PCR DNA dan Gel Band Purification Kit dari Amersham

Pharmacia Biotech untuk memberi gambaran tentang penggunaan kit, walaupun dalam

pelaksanaan praktikum ini kit yang digunakan adalah produk lain, namun prosedurnya memiliki

kemiripan.

Ligasi

Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA

lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan.

Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan

cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast

Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors

dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase

adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah dipotong dengan enzim

restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian

yang sesuai dengan bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling

berkomplemen. Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli,

diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah

4

terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh E.coli sendiri.

Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang

menghubungkan nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua

enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan

pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang mempunyai ujung tidak

rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan ujung rata (blunt end). Enzim ligase

mengkatalisasi pembentukan ikatan kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida

yang berdekatan, yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5 phosphate bebas

dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3gugus hidroksil. Enzim ligase tidak

membedakan DNA-DNA dari organisme yang berbeda. Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari

organisme yang berbeda pun dapat digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian

menjadi satu molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA rekombinan ini tidak

dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya di dalam sel inang. Proses ini

disebut sebagai transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005).

Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan

yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung

tidak rata (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T

berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang

mempunyai ujung rata (blunt end) dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain

yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik

menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi

tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

Transformasi

Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA,

baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mula-mula

diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu

bakteri dapat melepaskan fragmen DNA-nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan

masuk ke dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut

biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel

lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya

gen tra.

5

Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap

ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika transformasi yang

dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten

ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada media yang mengandung ampisilin.

Bahan dan Cara Kerja Isolasi DNA plasmid

Satu koloni bakteri E. coli yang mengandung plasmid ditumbuhkan dalam 2 ml media LB

(bacto tryptone 10g/l, bacto-yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l) yang mengandung 100 mg/l

ampisilin di dalam shaker (250 rpm) pada suhu 37C selama semalam. Kemudian 1,5 ml kultur

dipindahkan ke dalam tabung 1,5 ml lalu diendapkan dengan sentrifugasi 10.000rpm (Tomy

MRX-150) 4C selama 10 menit. Lalu endapan bakteri disuspensikan ke dalam 100 ul buffer

suspensi sel (Tris HCl pH 7.5 +EDTA) dan di-vortex. Kemudian ditambah 200 ul buffer lisis

(0.2M NaOH, 1% SDS). Suspensi dihomogenkan dengan membolak-balik tabung (6-8kali) lalu

didiamkan 3 menit. Bufer netralisasi (1,32M Na-asetat pH 4,8) ditambahkan sebanyak 300 ul

dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi 10.000

rpm 4C selama 10 menit. Supernatan ditransfer ke tabung yang baru kemudian dilakukan

ekstraksi dengan PCI (fenol-kloroform-isoamil alkohol) untuk memisahkan lipid-protein dengan

DNA. Fase air (supernatan) yang mengandung DNA di tambah RNase dan diinkubasi pada 37C

semalam. Kemudian DNA diendapkan dengan penambahan Na-asetat pH 5,2 dan etanol

absolut. Setelah diinkubasi pada 30C selama 2 jam, dilakukan sentrifugasi 10.000rpm 4C

selama 10 menit. Pelet dibilas dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali 10.000rpm

selama 10 menit pada 4C. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan. Selanjutnya pelet

dilarutkan ke dalam TE (Tris-HCl pH 8 10 mM, EDTA 1 mM).

Analisis kemurnian DNA dan kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer

Suspensi DNA plasmid diencerkan dengan mengambil 1 ul dalam 99 ul H2O atau TE.

Suspensi DNA yang telah diencerkan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm

dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan ke dalam

konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml. Perbandingan nilai absorbansi 260

nm terhadap absorbansi 280 nm dihitung untuk mengetahui kemurnian DNA terhadap

kontaminan protein. Rasio OD260/OD 280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relative

murni dan terbebas dari kontaminan protein.

6

Analisis kualitatif dan kuantifikasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Gel agarose 1% dibuat dengan mensuspensikan agarose ke dalam buffer TAE 1x (Tris-

HCl pH 8,3 40 mM, asam asetat pekat 1,98 mM, EDTA 1 mM) atau TBE 1x (Tris-HCl 100 mM,

asam borat 83 mM, EDTA 1 mM), dipanaskan hingga jernih dengan microwave. Setelah suhu

tidak terlalu panas (60C), gel dicetak dengan menggunakan gel tray (cetakan gel) dan

dipasang sisir untuk membuat sumuran, lalu dibiarkan beku. Sisir dilepas kemudian gel

dipindah ke dalam electrophoresis chamber. Sebanyak 1-2 ul DNA dicampur dengan larutan

pewarna (loading dye; bromofenol biru 0,25%, xylene cyanol FF 0,25%, sukrosa 40%).

Kemudian sampel DNA tersebut serta penanda kuantitas (marker, yang dipotong dengan enzim HindIII) diaplikasikan pada gel agarosa. DNA dimigrasikan kemudian setelah selesai

migrasi, direndam dengan larutan etidium bromide, dan dilihat di atas UV setelah dicuci dengan

H2O. Jumlah DNA dianalisis dengan membandingkan antara pendaran pita DNA plasmid yang

dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas. Bentuk DNA plasmid ditentukan

dengan melihat jumlah pita di dalam gel.

Restriksi

Sebanyak 5-10 ug DNA plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen, 5 ul

larutan penyangga reaksi 10x (sesuai enzim yang digunakan), 1 ul enzim restriksi (10 unit/ul),

dan H2O hingga volume larutan menjadi 50 ul dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 500 ul

(dengan urutan: H2O, penyangga, DNA plasmid, enzim). Kemudian larutan diinkubasi selama 1

jam pada suhu 37C. Selesai inkubasi, dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim

telah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan/enzim restriksi

ditambahkan lagi. Bila telah terpotong, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan larutan

DNA pada suhu 65-70C. Selanjutnya, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan

ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.

Isolasi (Elusi) fragmen DNA plasmid dari gel agarosa

Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang

sesuai dengan yang diinginkan, pemotongan dilakukan di atas transilluminator UV. Potongan

gel dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dipotong potong atau dicacah. Buat corong

yang terbuat dari bagian eppendorf yang dasarnya telah dilubangi dan kemudian dilapisi

membran nylon hybond untuk menyaring gel. Basahi membran nylon dengan 50 ul larutan

penyangga elusi. Hasil cacahan gel dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran

nylon hybond. Tambahkan 150 ul larutan penyangga elusi. Sentrifugasikan pada kecepatan

7

15000 g selama 1 menit pada suhu ruang. Tambahkan 150 ul larutan penyangga elusi.

Sentrifugasikan pada kecepatan 15000 g selama 5 menit pada suhu ruang. Tambahkan 150 ul

larutan penyangga elusi. Ekstraksi cairannya dengan PCI sebanyak 1x volume supernatan.

Vorteks selama 1 menit. Sentrifugasikan pada kecepatan 15000 g selama 1 menit pada suhu

ruang. Ambil supernatan (fase atas dari hasil sentrifugasi). Endapkan dengan menambahkan

0.1 volume sodium asetat 3 M, pH 5 dan 2-3 volume etanol absolut). Bilas dengan etanol 70%.

Keringkan dengan vacuum. Suspensikan endapan dengan menambahkan 15 20 ul dH20.

Ligasi fragmen DNA (insert) dengan vektor

6 ul vektor P gen T easy dengan Gen 6 sebanyak 7 ul, T4 ligase sebanyak 0,4 ul,

buffer T4 ligase sebanyak 1,5 ul, dan dH2O hingga volume akhir mencapai 15 ul lalu diinkubasi

pada suhu 4 0C hingga akan dilakukan transformasi.

Pembuatan bakteri kompeten

Satu koloni bakteri E. coli (DH5) diinokulasikan dengan menggunakan tusuk gigi steril ke dalam tabung reaksi berisi 2 ml media LB cair yang mengandung ampisilin. Bakteri

diinkubasi selama satu malam pada suhu 37C di dalam penggoyang (environmental shaker)

pada 200-250 rpm. Kemudian 100 ul biakan bakteri ditumbuhkan di dalam 10 ml LB atau SOB

pada kondisi lingkungan yang sama dengan sebelumnya selama 2-3 jam hingga OD600 = 0,4-

0,5. Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri lalu dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan

diinkubasikan di dalam es selama 10 menit. Lalu dilakukan sentrifugasi pada 4000 g (3000 rpm)

dengan swinging bucket rotor, 4C, selama 10 menit. Cairan dibuang dan endapan bakteri

disuspensikan dengan hati-hati dalam 16,5 ml TB (transformation buffer; 3 g Pipes 10 mM, 2,2

g CaCl2.2H2O, 18,2 g KCl 250 mM, 10,9 g MnCl2.4H2O 55 mM, 950 ml H2O, pH diatur 6.7

dengan KOH dan ditambah H2O hingga 1 l). Suspensi bakteri disimpan dalam es selama 10

menit kemudian disentrifus pada 3000 rpm (swinging bucket rotor), 4C, selama 10 menit.

Cairan dibuang, lalu endapannya disuspensikan dengan hati-hati dalam 1,4 ml TB. Kemudian

ditambahkan 100 ul DMSO dan segera disimpan dalam es selama 10 menit. Dalam keadaan

dingin (4C), 50 ul suspensi bakteri dimasukkan ke eppendorf dan disimpan dalam nitrogen cair.

Setelah beku, disimpan dalam freezer -70C.

8

Pengecekan hasil ligasi dengan transformasi

Sebanyak 10 ul (50-100 ng) DNA plasmid dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang

berisi 50 ul sel bakteri kompeten yang tepat mencair. Setelah dihomogenkan, suspensi bakteri

dipanaskan pada 42C (heat shock) selama 45 detik dan segera dimasukkan kembali ke dalam

es. Suspensi didiamkan dalam es selama 5 menit. Tabung eppendorf dipindahkan ke suhu

ruang lalu ditambah dengan 100 ul media cair 2xYT. Eppendorf diinkubasikan di alat

penggoyang pada 250 rpm, suhu 37C selama 30 menit-1 jam. Setelah inkubasi, suspensi

bakteri diinokulasikan secara merata di atas media LB padat yang mengandung ampisilin.

Sterilisasi batang kaca dilakukan dengan mencelupkan ke dalam alkohol kemudian

membakarnya dengan api Bunsen dan didinginkan. Untuk menyeleksi adanya sisipan di dalam

plasmid yang mengandung gen lacZ, ditambahkan 0,1 M IPTG (10 ul/cawan) dan 2% X-gal (50

ul/cawan) pada permukaan medium. Cawan diinkubasi pada incubator pada suhu 37C dengan

meletakkan cawan petri pada posisi terbalik (media di bagian atas). Bakteri yang mengandung

plasmid yang tersisipi fragmen pada situs pengklonan di daerah lacZ akan membentuk koloni

berwarna putih, sedang bakteri yang mengandung plasmid yang tidak tersisipi fragmen akan

menghasilkan koloni berwarna biru. Bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak akan

membentuk koloni.

Hasil dan Pembahasan Isolasi DNA Plasmid

Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga

tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi DNA, 3.

Pengendapan DNA.

Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS +

NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate)

merupakan deterjen yang berperan untuk melisis

dinding atau membran sel yang terdiri dari lipid

(fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa berfungsi

untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain

menjadi single strain). Terjadinya proses lisis ditandai

dengan terbentuknya lendir.

Gambar 1. Lisis dinding dan membran sel bakteri

9

Gambar 2. Ekstraksi DNA dengan PCI

Pada suspensi ekstrak sel sebelum

ekstraksi terdapat senyawa DNA

plasmid, RNA, Protein, Senyawa

Organik dan Komponen Lipid.

Ekstraksi dilakukan dengan adanya

penambahan PCI (Phenol-Chloroform-

Isoamyl Alcohol) dimana Phenol-

Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan

dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase

dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di

tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang

berat jenisnya besar.

Proses ekstraksi diakhiri dengan

adanya proses pengendapan DNA

menggunakan sodium acetat dan

alcohol. Larutan DNA terkonsentrasi

dan ketika disentrifugasi DNA akan

mengendap.

Gambar 3. Pemurnian DNA dengan Etanol

Pada praktikum kali ini dilakukan perbedaan prosedur terhadap tiga sampel larutan

DNA. Prosedur pertama adalah semua prosedur dilakukan yaitu adanya penambahan RNA ase

dan penambahan PCI. Prosedur kedua adalah adanya penambahan RNA ase tetapi ekstraksi

dengan PCI tidak dilakukan. Sedangkan prosedur ketiga adalah sampel DNA dimana keduanya

tidak ditambahkan baik RNA ase dan PCI. Penambahan RNA ase dilakukan dengan tujuan

untuk mendapatkan DNA murni tanpa adanya RNA.

10

Analisis kemurnian DNA dan kuantifikasi DNA dengan spektrofotometer

Kuantitas DNA dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer. Pengukuran

menggunakan spektrofotometer dilakukan dengan cara mengencerkan suspensi DNA plasmid

dan membaca absorbansinya pada panjang gelombang 256 nm (pada umumnya 260 nm). TE

atau H2O sebagai larutan pengencer dibaca sebagai blanko dan digunakan sebagai faktor

koreksi. Nilai absorbansi sampel (DNA) setelah dikoreksi oleh blanko, dikonversikan ke dalam

konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 mg DNA utas ganda tiap l (50 mg/l). Kualitas DNA dapat

dihitung dengan mengubah panjang gelombang yang digunakan untuk membaca absorbansi

dari 260 nm lalu 280 nm. Perbandingan nilai absorbansi 260 nm terhadap absorbansi 280 nm

mencerminkan kemurnian DNA terhadap kontaminasi protein. DNA tersebut dianggap murni

dan bebas dari kontaminasi protein jika nilai rasio OD260/OD280 terletak antara 1.8 sampai

dengan 2.0. Dengan metode spektrofotometri diperoleh data sebagai berikut :

Tabel1.NilaiabsorbansilarutanDNApadapanjanggelombang260dan280

Abs 260 Abs 280 Abs 260/ Abs 280 konsentrasi mg/L

6.1 0.367 0.201 1.83 12845

6.2 0.247 0.131 1.88 8645

6.3 0.276 0.141 1.95 9660

Pada percobaan praktikum kali ini diketahui bahwa dengan penambahan PCI ataupun tidak,

dengan penambahan RNA ase atau tidak, DNA tidak terkontaminasi protein bila dilihat dari hasil

spektrofotometri, sehingga DNA tiap prosedur bisa dianggap murni. Dari konsentrasi yang

diperoleh didapat bahwa DNA dengan ektraksi menggunakan PCI dan penambahan RNA ase

lebih besar dari pada kedua prosedur lainnya.

Analisis kualitatif dan kuantifikasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa

Analisis menggunakan gel agarose dilakukan dengan melakukan elektroforesis DNA

sampel bersama dengan DNA penanda kuantitas. DNA penanda kuantitas pada umumnya

berupa DNA lambda utuh yang pada praktikum kali ini diberikan dengan konsentrasi 10 ng/5 ul,

20 ng/5 ul, 40 ng/5 ul. Elektroforesis dilakukan sampai larutan pewarna menjauhi well. Untuk

kuantifikasi, jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk

DNA. Jarak migrasi yang ditempuh harus jauh dari well. Hal ini karena akan terjadi pemisahan

DNA berdasarkan berat dan bentuk DNA. Berikut adalah foto hasil elektroforesis dari 3

prosedur yang berbeda.

11

Hasil elektroforesis dapat dilihat pa gambar di baw

F

E

D

C

B

A

marker 10 20 40 6.1 6.2 6.3 5.1 5.2 5.3 4.1 4.2 4.3

Gambar 3. Hasil Elektrophoresis Isolasi Plasmid pada 1% Agarose gel.

Pada prosedur pertama terdapat tiga tipe pita DNA yaitu plasmid berbentuk superheliks

(ccc = covalently closed circular) bermigrasi paling jauh dari well, pita DNA plasmid yang

berada di tengah berbentuk linear, sedangkan yang bermigrasi paling dekat dengan well adalah

pita DNA plasmid yang berbentuk open sirkuler. Semakin kompak suatu DNA maka akan

bermigrasi semakin cepat sehingga pada saat yang bersamaan akan bermigrasi lebih jauh

dibandingkan dengan bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak

dibandingkan dengan DNA plasmid dalam keadaan open sirkuler atau linier. Pada prosedur

ketiga, selain ketiga pita tersebut, ada pita lain setelahnya, pita ini adalah pita RNA karena pada

prosdur ketiga tidak ditambahkan RNA ase. Sedangkan pada prosedur kedua tidak terdapat

pita, mungkin disebabkan kurangnya konsentrasi DNA yang dielusi.

Kuantitas DNA sampel juga dapat diketahui dengan membandingkan pendaran pita

DNA sampel yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda kuantitas. Berdasarkan

gambar tersebut dapat dilihat bahwa pita-pita yang terbentuk apabila dibandingkan dengan pita

penanda kuantitas maka pita A 5 ng/5 ul, pita B 15 ng/5 ul, pita C 5 ng/5 ul dan apabila

dijumlahkan didapatkan 25 ng/5 ul atau 5 mg/l yang merupakan konsentrasi total dari prosedur

pertama. Pada prosedur ketiga diperoleh, pita D 40 ng/5 ul, pita E 15 ng/5 ul, pita F 45 ng/5 ul,

maka total diperoleh 100 ng/5 ul atau 20 mg/l, konsentrasi ini lebih sedikit apabila dibandingkan

dengan hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode spektrofotometri dimana prosedur

12

pertama menghasilkan DNA dengan konsentrasi 12845 mg/l dan prosedur ketiga sebesar 9660

mg/l. Dari hasil pada percobaan ini maka larutan DNA yang diperoleh dengan menggunakan

prosedur ketiga dijadikan sebagai larutan yang akan direstriksi karena DNA yang dihasilkan

konsentrasinya lebih banyak dibandingkan dengan prosedur lainnya berdasarkan DNA penanda

kuantitas.

DNA adalah sesuatu yang tidak terlihat di dalam gel, sehingga perlu penambahan

Ethidium Bromida yang pada umumnya digunakan untuk membuat pita DNA terlihat. Molekul

Ethidium Bromida berinterkalasi di antara basa menyebabkan DNA berfluorosescens ketika gel

dieluminasi dengan sinar ultraviolet akan tetapi proses tersebut akan sulit apabila proses

destaining tidak dilakukan. Proses destaining ini dilakukan setelah proses staining yaitu dengan

membilas gel agarose dengan akuades. Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan Etidium

bromida yang terperangkap di dalam gel sehingga ketika dieluminasi oleh sinar UV hanya pita

DNA yang terlihat karena DNA berikatan dengan Etidium Bromida melalui ikatan hidrohen.

Restriksi Hasil pemotongan DNA plasmid dengan beberapa enzim restriksi menghasilkan pita-

pita dengan ukuran basa yang berbeda dan unik sesuai dengan enzim restriksinya

masing-masing. pada praktikum diperoleh pita-pita hasil elektroforesis DNA plasmid

yang telah direstriksi.

marker Eco RI marker Hind III Sac I Xha I Sal I Hind III Eco RI Sal I A B

13

Gambar 4. Hasil elektroforesis restriksi plasmid menggunakan beberapa enzim restriksi

Dengan mengukur jarak migrasi pita-pita pada sumur marker maka diperoleh

persamaan yang akan digunakan untuk menentukan ukuran basa dari DNA plasmid

yang telah dipotong oleh enzim restriksi tertentu yang juga dengan menggunakan jarak

migrasi sebagai penuntun. Dari hasil penghitungan secara manual menggunakan alat

ukur penggaris, maka diperoleh data sebagai berikut:

bp logbp jarak(cm)

10000 4.00 2.48000 3.90 2.66000 3.77 2.95000 3.69 3.14000 3.60 3.33000 3.47 3.62500 3.39 3.82000 3.30 4.11500 3.17 4.51000 3.00 5.1750 2.87 5.5500 2.69 5.9250 2.39 6.5

bp log bp jarak (cm)

10000 4.00 2.8 8000 3.90 2.95 6000 3.77 3.25 5000 3.69 3.4 4000 3.60 3.65 3000 3.47 3.95 2500 3.39 4.2 2000 3.30 4.5 1500 3.17 5 1000 3.00 5.6

750 2.87 6.1 500 2.69 6.7 250 2.39 7.5

Gambar5.Grafikperbandinganjarakmigrasimarker1kbladderdenganlogbpukuranplasmiddarimarker1kbladder,fotoAGambar4.

Gambar6.Grafikperbandinganjarakmigrasimarker1kbladderdenganlogbpukuranplasmiddarimarker1kbladder,fotoBGambar4.

Tabel2.Jarakmigrasimarker1kbladder,fotoAGambar

Tabel3.Jarakmigrasimarker1kbladder,fotoBGambar4.

4.

14

Dari persamaan diatas maka diperoleh ukuran plasmid dari masing-masing pita yang

direstriksi dari beberapa enzim tersebut, sebagai berikut:

Hind III + Eco RI: 3282 bp + 1238 bp + 1002 bp + 745 bp (total 6268 bp)

Sac I: 4606 bp + 1406 bp (total 6013 bp)

Xha I + Sal I: 3146 bp (total 6292 bp)

Sal I: 6197 bp (hanya memotong di satu tempat)

Hind III: 3727 bp + 1238 bp + 960 bp (total 5926 bp)

Eco RI: 3566 bp (memotong di dua tempat dimana ukuran plasmid hampir sama besar)

Apabila total ukuran plasmid diasumsikan sepanjang 6000 an bp, maka plasmid pada

percobaan restriksi ini, pemetaannya dapat digambarkan sebagai berikut:

Hind III, Eco RI

Hind III

Hind III

Eco RI

Xha I Sal I

Sac I

Sac I

Gambar 7. Pemetaan plasmid pada pemotongan dengan menggunakan beberapa enzim restriksi

Elusi Elusi dilakukan terhadap insert gen G dari kedelai dan vektor pGEM T-Easy

yang diperoleh dari praktikum restriksi plasmid. Elektroforesis hasil elusi perlu dilakukan

untuk mengetahui ada atau tidaknya hasil elusi dan untuk menentukan konsentrasi hasil

elusi. Konsentrasi DNA hasil elusi perlu diketahui untuk menghitung volume insert yang

akan ditambahkan pada proses ligasi berdasarkan perbandingan insert dan vektor.

Jumlah insert yang ditambahkan pada reaksi ligasi menentukan peluang berhasil atau

tidaknya proses ligasi antara insert dan vektor.

15

Gambar elektroforesis hasil elusi pada praktikum ini dapat dilihat pada gambar di

bawah ini:

marker 1 2 3 4 5 6

Gambar 8. Elusi gen G dari kedelai dan vektor pGEM T-Easy masing-masing kelompok

Ligasi

Ligasi adalah proses menghubungkan fragmen DNA yang berupa insert dan vektor

dengan menggunakan enzim ligase. Cara kerja dari enzim ligase adalah dengan

menghubungkan ujung 5P dan ujung 3OH dari fragmen lain. Pada proses ligasi, ada beberapa

kemungkinan yang dapat terjadi: 1. vektor menyambung pada vektor itu sendiri, 2. vektor

menyambung dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor), 3. vektor menyambung dengan

insert. Pada percobaan ini diharapkan yang terjadi adalah kemungkinan ketiga. Oleh karena itu

pada percobaan ini dilakukan efisiensi dengan menambahkan enzim kinase yaitu alkalin

fosfatase pada larutan vektor (belum dicampur dengan insert) untuk menghilangkan gugus P

pada 5P sehingga menjadi 5OH (defosforilasi) sehingga diasumsikan kemungkinan yang

pertama dan yang kedua tidak atau sedikit angka kejadiannya. Dengan berubahnya 5P menjadi

5OH, maka yang diharapkan terjadi vektor hanya berikatan dengan insert. 3OH pada vektor

akan menyambung pada 5P insert, akan tetapi 3OH insert tidak dapat menyambung ke vektor

karena 5P vektor telah berubah menjadi 5OH sehingga terjadi nick atau celah. Meskipun

terjadi celah, insert dan vektor tetap berikatan dan dapat ditransformasikan dimana celah ini

nanti akan diperbaiki di dalam sel apabila berhasil ditransformasikan.

16

Gambar 9. Mekanisme Efisiensi Ligasi

Transformasi

E. coli dapat memasukkan DNA ekstrasel jika dinding selnya diubah sehingga DNA dapat

melewatinya dengan mudah. Sel dalam keadaan demikian disebut sel yang kompeten. Sel

dibuat kompeten dengan suatu proses yang menggunakan kalsium klorida dan heat shock

(kejutan panas). Sel yang berada pada tahap perumbuhan logaritmik lebih mudah untuk dibuat

kompeten daripada sel yang berada pada tahap pertumbuhan yang lain. Laju pertumbuhan

pada kultur bakteri tidaklah konstan. Pada beberapa jam pertama (lag phase), laju pertumbuhan

sangat lambat karena sedikitnya jumlah bakteri awal yang membelah. Fase ini diikuti fase

pertumbuhan logaritmik dimana terjadi laju pertumbuhan yang tinggi. Panjang waktu dari tiap-

tiap fase pertumbuhan dipengaruhi oleh suhu inkubasi. Sel yang digunakan sebaiknya dalam

fase logaritmik.

Gambar 10. Kurva yang menggambarkan fase-fase pertumbuhan bakteri; lag phase, log phase, stationary phase dan death phase.

17

Dari hasil transformasi dapat dilihat dengan munculnya koloni putih dan biru pada media

padat LA (Luria Bertani Agar) + 100 ug/ml Ampisilin + 100 ul 0,1 M IPTG + 20 ul 50 mg/ml X-

Gal. Kontrol positif yang berupa sel kompeten yang diinokulasikan pada media LA saja

ditumbuhi dengan koloni E. coli DH5 yang menunjukkan bahwa sel kompeten mampu tumbuh

di media LA dan tidak terjadi kontaminasi. Sedangkan pada kontrol negatif yang berupa sel

kompeten yang diinokulasikan pada media LA + Ampisilin tidak ditumbuhi E. coli DH5

menunjukkan bahwa sel kompeten yang belum disisipi oleh vektor PGEM T-Easy tidak dapat

tumbuh pada media yang mengandung Ampisilin. Hal ini terjadi karena E. coli DH5 tipe asli

tidak mempunyai gen resisten terhadap Ampisilin. Gen ini terdapat pada Vektor PGEM T-Easy

yang merupakan gen spesifik yang dapat membedakan antara host yang sudah ditransformasi

dan yang belum ditransformasi. Hanya E. coli DH5 yang telah disisipi DNA vektor yang dapat

hidup pada media LA + Ampisilin.

Jika kedua proses berlangsung sempurna, maka tumbuhnya koloni pada media dapat

dilihat seperti gambar berikut ini.

Gambar 11. Gambar Koloni Bakteri Hasil Transformasi

Pada gambar terlihat jelas terdapat koloni putih dan koloni biru. Koloni putih merupakan koloni

E. coli DH5 yang tersisipi vektor PGEM T-Easy + insert gen G dari kedelai, sedangkan koloni biru merupakan koloni E. coli DH5 yang mungkin tersisipi oleh vektor PGEM T-Easy

namun tidak tersisipi insert gen G dari kedelai, bisa terjadi karena kemungkinan-kemungkinan yang terjadi pada proses ligasi, seperti vektor menyambung pada vektor itu

sendiri atau vektor menyambung dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor).

Terbentuknya koloni putih-biru menggunakan prinsip kerja gen LacZ yang

mengekspresikan -galaktosidase. Pada vektor PGEM T-Easy terdapat Multiple Cloning Site

(MCS) yang di antaranya terdapat gen LacZ. Pada gen LacZ terdapat lokasi pemotongan

18

19

enzim-enzim restriksi tertentu. Insert gen G dari kedelai, jika dapat tersisipkan pada vektor, akan merusak gen LacZ sehingga gen tersebut tidak dapat terekspresikan. Ekspresi gen LacZ

ditunjukkan dengan terbentuknya enzim -galaktosidase yang dengan adanya inducer IPTG

akan mengurai substrat X-Gal sehingga terbentuk indol yang merubah warna koloni menjadi

biru. Rusaknya LacZ akibat tersisipi oleh insert gen G dari kedelai menyebabkan tidak terbentuknya enzim -galaktosidase, sehingga X-Gal tidak dapat terurai, indol tidak terbentuk,

dan koloni tetap berwarna putih.