2

ekstrak mikroalga sebagai inhibitor RNAhelikase virus japanese encephalitis danmengetahui tingkat toksisitasnya.

TINJAUAN PUSTAKA

Japanese Encephalitis Virus (JEV)Japanese encephalitis virus (JEV) adalah

suatu virus yang dibungkus oleh proteinenvelope (E) yang memiliki satu atau dua sisiaktif yang terglikosilasi (Chambers et al.1991). Glikosilasi pada protein E sangatpenting untuk konformasi alami dari epitopprotein tersebut (Lad et al. 2000). Virus inimemiliki diameter sekitar 50 nm, dantermasuk dalam famili Flaviviridae. Virus inimerupakan virus RNA positif, dengan genomRNA utas tunggal dan panjang sekitar 11 kb.Genom RNA tersebut ditranslasikan ke dalamprekursor poliprotein tunggal yangselanjutnya diproses untuk menghasilkan tigaprotein struktural C (capsid), M (matrix), danE (envelope) yang membentuk viral kapsiddan glikoprotein, serta tujuh protein nonstruktural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,NS4B, dan NS5) yang bertanggung jawabdalam replikasi viral genomnya. Poliproteintersebut tersusun sebagai berikut: NH2-C-PrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH. Pembungkus intinya berdiametersekitar 30 nm terdiri atas kapsid dan genomRNA yang dikelilingi oleh suatu lipida lapisganda tempat pembungkus viral dan proteinmembran terikat (Gambar 1) (Borowski et al.2001). Virus japanese encephalitis termasukfamili virus Flaviviridae. Famili Flaviviridaeterdiri atas tiga genus, yaitu genus flavivirus,pestivirus, dan hepacivirus. Genus flavivirusterdiri atas lebih dari 70 jenis virus yang padaumumnya ditularkan melalui perantaraannyamuk atau arthropoda. Genus flavivirusdiantaranya adalah virus demam berdarah(DENV), Japanese Encephalitis Virus (JEV),Tick-Borne encephalitis virus (TBEV),Yellow Fever Virus (YFV), West Nile Virus(WNV), Murray Valley Encephalitis Virus(MVEV), dan St. Louis Encephalitis Virus(SLEV).

Gambar 1 Struktur virus japaneseencephalitis (Miller 2003).

Flavivirus merupakan patogen yang sangatpenting dan bertanggungjawab terhadapbanyak penyakit pada manusia dan hewan,dan menyebabkan banyak kematian (Ray &Shi 2006).

Infeksi flavivirus YFV dan DENV dapatmenyebabkan demam berdarah dan ensefalitisserta kerusakan saraf otak (pada JEV, TBEV,WNV, SLEV, dan MVEV). Pada umumnyaflavivirus yang paling mematikan yaitu JEV,YFV, TBEV, dan DENV yang memilikitingkat mortalitas antara 5-30% (Ray & Shi2006).

Protein-protein non struktural dalamgenom virus berperan dalam proses replikasivirus. NS1 yang berinteraksi dengan NS4Adibutuhkan untuk replikasi RNA (Lindenbach& Rice 1997; Lindenbach & Rice 1999).NS2A yang bersifat hidrofobik berfungsidalam perakitan virion dan pelepasan partikelvirus yang infeksius. NS2B membentuk suatukompleks dengan NS3 dan diperlukan sebagaikofaktor bagi fungsi serin protease dari NS3(Chambers et al. 1991; Chambers et al. 1993;Falgout et al. 1993). Fungsi dari membranyang berasosiasi antara NS4A dan NS4Bsampai saat ini belum diketahui. NS5 berperandalam aktivitas RNA-dependent RNApolymerase (RdRp) dan metiltransferase. NS3adalah suatu protein multifungsi yangberperan dalam aktivitas enzimatik dari serinprotease dengan adanya NS2B, nukleotidatrifosfatase (NTPase), dan RNA helikase(Bartelma et al. 2002; Borowski et al. 2001;Li et al. 1999). Serin protease, NTPase, danRNA helikase merupakan enzim yang sangatpenting karena berperan dalam prosesreplikasi virus (Levin & Patel 1999; Borowskiet al. 2003).

Japanese Encephalitis Virus (JEV) adalahpenyakit epidemik ensefalitis yang disebabkanoleh virus yang paling banyak terjadi di dunia,sebanyak 50.000 kasus dengan 15.000 orangmeninggal per tahunnya. Galur JEV prototipeNakayama pertama kali diisolasi pada tahun1935. Kasus epidemis dan sporadis dari JEVbanyak terjadi di daerah yang mempunyaiempat iklim dan di daerah tropis di Asia,diantaranya Kamboja, China, Indonesia, India,Jepang, Malaysia, Myanmar, Nepal, SriLanka, Thailand, Vietnam, bagian tenggaraRusia, dan Australia (Hanna et al. 1996). JEVmenimbulkan penyakit akut dengan tanda-tanda infeksi seperti sakit kepala, demam,kejang, dan merupakan agen penyebabpenyakit radang saraf pusat seperti meningitisdan ensefalitis yang parah dengan tingkat

3

mortalitas antara 20-30% (Borowski et al.2001).

RNA HelikaseEnzim helikase adalah enzim yang terlibat

dalam hampir semua aspek metabolisme DNAdan RNA. Pengetahuan mekanisme kerja darienzim-enzim telah mengalami kemajuan,tetapi adanya resolusi yang terbatasmenyebabkan mekanisme rinci sepertipenataan ulang struktur asam nukleat hinggapengikatan dan hidrolisis ATP yang dilakukanpasangan enzim helikase ini tidak dapatdiketahui (Dumont et al. 2006). Fungsi enzimhelikase adalah untuk membuka utas gandaDNA atau RNA menjadi untai tunggal, danbergerak sepanjang untai nukleotida pada arah3’ menuju 5’ (Gambar 2). Seluruh helikasevirus memiliki aktivitas NTP/ATPase yangtergantung pada keberadaan NTP dan kationdivalen berupa Mg2+. Produk hidrolisis NTPpada setiap pengkajian helikase adalahNDP/ADP dan Pi (Fan et al. 2008).

Enzim helikase diperlukan untuk prosesreplikasi genom organisme tersebut. Enzimhelikase dapat dibagi menjadi DNA helikasedan RNA helikase, sesuai dengan genom yangdimiliki organisme tersebut. JEV yangmerupakan virus RNA memiliki RNAhelikase. Helikase bekerja secara katalitikmemisahkan untai ganda DNA atau RNAmenggunakan energi yang dihasilkan darihidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakantarget pencarian obat karena dibutuhkandalam replikasi virus. (Utama et al. 2000).

Gambar 2 Mekanisme kerja enzim RNAhelikase (Utama et al. 2000).

Aktivitas NTP/ATP helikase secara umumdistimulasikan oleh keberadaan asam nukleatuntai tunggal. Hal ini memungkinkan enzimberikatan dengan untai RNA dengan energiyang dihasilkan dari hidrolisis ATP untukmemisahkan ikatan hidrogen pasangan basadari struktur dupleks (Utama et al. 2000).

Ikatan asam nukleat dapat menginduksikonformasi protein yang terkarakterisasidengan pengembangan situs aktif dari domainNTP/ATPase dari NTP/ATP. AktivitasNTP/ATPase tidak dapat distimulasi padakadar garam tinggi. Hal ini disebabkankondisi kekuatan ionik kuat asam nukleattidak dapat terikat dengan enzim dan enzimmembentuk konformasi untuk pelepasanuntaian. Mekanisme kerja enzim RNA atauDNA helikase adalah pertama-tama helikaseakan mengikat untai RNA atau DNA utasganda pada ujung 3’, selanjunya ATP akanberikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atauDNA helikase tersebut. Gugus ATP akandihidrolisis oleh enzim RNA atau DNAhelikase menjadi ADP dan fosfat inorganik.Proses hidrolisis ini akan terlepas energi yangkemudian digunakan oleh enzim RNA atauDNA helikase untuk menguraikan utas gandaRNA atau DNA menjadi utas tunggal RNAatau DNA (Utama et al. 2000).

Enzim helikase dapat mengurai RNA atauDNA utas ganda melalui pemutusan ikatanhidrogen yang mengikat kedua utas tersebut.Reaksi ini berhubungan dengan hidrolisisATP, dimana energi yang dilepaskan selamahidrolisis ATP dibutuhkan dalam prosespenguraian RNA atau DNA (Shuman 1992;Wagner et al. 1998).

Enzim helikase juga dapat berperan dalamfungsi selular lainnya seperti membantuproses translasi, mengkoordinasipembentukan poliprotein, memutus interaksiRNA-protein, serta menyusun RNA di dalampembungkus viral (Lam & Frick 2006). Enzimhelikase juga memiliki aktivitas ikatan RNA(RNA binding) dan ATPase (RNA-stimulatedATPase), dan kedua aktivitas ini berpengaruhterhadap aktivitas RNA helikase. Enzim inimenjadi target yang potensial untukpenemuan obat antivirus karena penemuaninhibitor RNA helikase dapat dilakukandengan penemuan inhibitor terhadap aktivitasRNA binding atau ATPase (Utama et al.2000). Beberapa penelitian tentang mutasi danpenghambatan terhadap NS3 diperlukan untukpropagasi virus, sehingga pengembanganinhibitor efektif dari enzim helikase japaneseencephalitis virus adalah bagian pentingdalam strategi antiviral.

4

MikroalgaMikroalga adalah mikroorganisme

fotosintetik dengan morfologi sel yangbervariasi, baik uniseluler maupunmultiseluler (membentuk koloni kecil).Sebagian besar mikroalga tumbuh secarafototrofik, meskipun tidak sedikit jenis yangmampu tumbuh secara heterotrofik. Gangganghijau-biru prokariotik (Cyanobacteria) jugatermasuk dalam kelompok mikroalga (Becker1994). Mikroalga sudah hidup sejak 3.6 jutatahun lalu dalam siklus fotosintesis alamiah.Mikroalga banyak ditemukan pada perairandarat maupun laut, ukuran diameter antara 3-30 μm, tanpa akar, batang, dan daun. Biasanyaditemukan hidup secara individual ataupunberkelompok. Mikroalga bergerak secara pasifdengan mengikuti arus air. Morfologi selnyasangat bervariasi, baik bersel tunggal maupunbersel banyak, Mikroalga juga memilikibentuk yang bervariasi seperti filamen ataulembaran, spiral, dan bulat (Borowitzka &Lesley 1988).

Mikroalga terbagi menjadi 11 kelompok,yaitu Cyanophyta (alga hijau-biru),Prochlorophyta (bright-green algae),Glaucophyta (alga air tawar mikroskopis),Rhodophyta (alga merah), Heterokontophyta(alga coklat keemasan yang hidupnyamotil/bergerak aktif), Haptophyta (alga yangmemiliki organel unik bernama haptonema),Cryptophyta (alga yang termasuk dalamkelompok uniseluler yang unik dan tidakmemiliki kedekatan dengan kelompok algalainnya), Dinophyta (suatu kelompok besaralga perairan yang berflagella), Euglenophyta(organisme yang motil dan memiliki 1-3flagella di bagian anteriornya),Chlorarachniophyta (kelompok kecil algayang biasanya ditemukan di laut tropis), danChlorophyta (alga hijau) (Van Den Hoek et al.2002).

Biomassa mikroalga mengandungberbagai macam komposisi kimia, misalnyaprotein, karbohidrat, pigmen (klorofil dankarotenoid), asam amino, lipid, danhidrokarbon. Mikroalga mempunyaikemampuan untuk mensintesis semua asamamino, baik esensial maupun non esensial.Karbohidrat yang dihasilkan dapat ditemukandalam bentuk pati, glukosa, gula, danpolisakarida lainnya. Kandungan lipid darimikroalga sangat bervariasi berkisar antara1%-90%. Lemak mikroalga pada umumnyaterdiri dari asam lemak tidak jenuh, sepertilinoleat, asam eikosapentanoat, dan asamdokosaheksanoat. Mikroalga mengandunglemak dalam jumlah yang besar terutama

asam arakidonat (AA) yang mencapai 36%dari total asam lemak dan sejumlah asameikosapentaenoat (EPA). Lemak mikroalgajuga kaya akan asam lemak politidakjenuh(PUFA) dengan 4 atau lebih ikatan rangkap.Asam lemak yang sering dijumpai yaitu asamekosapantenoat (EPA, C20:5) dan asamdokosaheksanoat (DHA, C22:6). Mikroalgamenghasilkan beberapa vitamin penting,seperti vitamin A, B1, B2, B6, B12, C, E,nikotinamida, biotin, asam folat, dan asampantotenat. Pigmen yang dihasilkan meliputiklorofil (0.5% sampai 1% dari berat kering),karotenoid (0.1% sampai 14% dari beratkering), dan fikobiliprotein (Becker 1994).

Kandungan senyawa kimia mikroalgatergantung pada spesies dan kondisipengulturan. Pertumbuhan mikroalgadipengaruhi oleh beberapa faktor, sepertisalinitas, cahaya, suhu, derajat keasaman,nitrogen, karbondioksida, dan nutrien. Kisaransuhu 25oC-30oC merupakan kondisi umumbagi pertumbuhan mikroalga. Derajat salinitasbergantung pada tiap spesies mikroalga.Cahaya diperlukan bagi pertumbuhanmikroalga dan berperan dalam prosesmetabolisme sel seperti fotosintesis. Kisaranderajat keasaman (pH) bervariasi mulai daripH 6-8 (Borowitzka & Lesley 1988).

Mikroalga dapat dimanfaatkan sebagaibahan bakar nabati, kosmetik, antifouling,pewarna makanan alami, sumber makananbaru, dan dalam bidang kesehatan.Pemanfaatan mikroalga dalam bidangkesehatan meliputi antibakteri, antijamur, danantivirus. Mikroalga dapat digunakan sebagaiantibakteri pada bakteri Gram positif seperti S.aureus, maupun Gram negatif seperti E. colidan Bacillus substilis (Becker 1994).

Pada tahap budidaya, perkembangbiakanmikroalga meningkat 2.5 kali bila ke dalamkolam airnya dipasok CO2, dibandingkanhanya dengan aerasi atau suplai O2 (Boyer1986). Hal ini berarti bahwa kultivasimikroalga berpeluang mengatasi masalahlungkungan global karena selama ini CO2menjadi gas pencemar dominan yangmenyebabkan efek rumah kaca penyebabpemanasan global. Kultivasi mikroalgamemperhatikan kondisi fisika-kimia yangterdiri atas nutrisi/medium kultur, cahaya, pH,aerasi/pengadukan, suhu, dan salinitas(Borowitzka & Lesley 1988).

Pertumbuhan beberapa isolat mikroalgaperairan laut Batam, Pari, dan Ciater diamatidengan cara mengukur optical density (OD)pada panjang gelombang 680 nm. PengukuranOD dilakukan pada panjang gelombang 680

5

nm karena sampel mikroalga berwarna hijaudan panjang gelombang yang spesifik untukwarna tersebut adalah kisaran 680 nm. Dasarpemakaian spektrofotometer ini adalah untukmengukur kerapatan optik dari suatu zat yangberwarna (Borowitzka & Lesley 1988).

Lima fase pertumbuhan mikroalga, yaitufase lag, fase logaritma atau eksponensial, fasestasioner, fase transisional, dan fase death(kematian). Fase lag ditandai dengan ukuransel meningkat, namun kepadatan belumbertambah; kultur mulai menyerap nutrienyang terdapat pada medium kultur. Faselogaritma atau eksponensial mempunyai cirisel bereproduksi dengan cepat. Pada fasestasioner jumlah atau kepadatan populasikultur stabil, reproduksi seimbang dengankematian. Fase transisional ditandai denganlaju pertumbuhan populasi kultur menurun.Pada fase death (kematian) kepadatan selmenurun, laju kematian sel melebihi lajupertumbuhan sel (Gambar 3) (Borowitzka &Lesley 1988).

Media tumbuh mikroalga merupakanmedia yang berisi komponen-komponen yangdibutuhkan untuk pertumbuhannya. Mikroalgadapat hidup dan bereplikasi karena adanyabermacam-macam substrat yang terdiri atasnatrium, kalium, magnesium, kalsium, danunsur logam lain seperti besi, seng, tembaga,dan kobalt yang terdapat dalam media. Mediatumbuh mikroalga yang digunakan dalampenelitian ini termasuk media cair yaitu mediaIMK (IMK-Ciater dan IMK-Sea Water (SW))yang terdiri atas larutan yang mengandungbermacam-macam substrat yang dibutuhkanmikroalga tersebut (Borowitzka & Lesley1988).

Gambar 3 Kurva pertumbuhan mikroalga(Borowitzka & Lesley 1988).

Pada media tumbuh mikroalga dilakukanposes bubling (pemasukan udara ke dalammedia) dengan diberi air pump yang bertujuanagar mikroalga dalam keadaan selalutercampur dengan media (mikroalga tidakmengendap di dasar media), selain itu prosesbubling ini juga berfungsi sebagai sumberCO2 bagi pertumbuhan mikroalga(Borowitzka & Lesley 1988).

ToksisitasToksisitas merupakan suatu sifat relatif

dari senyawa kimia dan sejauh menyangkutdiri manusia secara langsung atau tidaklangsung. Toksisitas selalu menunjuk ke arahberbahaya atas mekanisme biologi tertentu.Uji toksikologi dapat dibagi menjadi duagolongan, golongan pertama terdiri atas ujitoksisitas akut, uji toksisitas subkronis, dan ujitoksisitas kronis. Uji ini merupakan ujitoksikologi yang dirancang untukmengevaluasi keseluruhan akibat umum suatusenyawa pada hewan eksperimental,sedangkan golongan yang kedua dari ujitoksikologi (terdiri atas uji potensi, ujiteratogenik, uji reproduksi, uji mutagenik, ujitumorigenisitas, dan uji perilaku) yangmerupakan uji yang dirancang untukmengevaluasi dengan rinci toksisitas spesifik.

Suatu senyawa kimia yang mampumenimbulkan akibat yang jelas, sepertimisalnya kematian organismenya, atau selhewan itu sepenuhnya sembuh dalam periodewaktu tertentu, maka dosis atau kadarsenyawa kimia itu dapat dipilih agar dapatmenimbulkan akibat tersebut. Derajattoksisitas dapat dibedakan menjadi sangattoksik (LC50 < 30 µg/mL), toksik (LC50 30-1000 μg/mL) dan tidak toksik (LC50 > 1000μg/mL) (Meyer et al. 1982).

Artemia salina LeachHewan uji yang digunakan dalam metode

BSLT ini adalah Artemia salina Leach.Artemia salina merupakan kelompok udang-udangan dari kelas Branchiopoda. Merekaberkerabat dekat dengan zooplankton lainseperti Copepoda dan Daphnia (kutu air). A.salina hidup di danau-danau garam (berairasin) yang ada di seluruh dunia. Udang initoleran terhadap selang salinitas yang sangatluas, mulai dari hampir tawar sampai jenuhgaram. Secara alamiah salinitas perairantempat mereka hidup sangat bervariasi,tergantung pada jumlah hujan dan penguapanyang terjadi. Kadar garam kurang dari 6 ppt(part per thausand), telur artemia akantenggelam sehingga telur tidak bisa menetas.

6

Kondisi ini terjadi apabila air tawar banyakmasuk ke dalam perairan pada musimpenghujan. Kadar garam lebih dari 25 ppt,telur akan tetap berada dakam kondisitersuspensi sehingga dapat menetas normal.

Secara taksonomi A. Salinadiklasifikasikan menjadi Kingdom (Animalia),filum (Arthropoda), kelas (Branchiopoda),ordo (Anostraca), famili (Artemiidae), genus(Artemia), dan spesies (Artemia salina).Siklus hidup A. salina dapat dimulai dariwaktu penetasan kista atau telur. Kista akanmenetas menjadi embrio setelah 15-20 jamdalam air dengan suhu 250C. Embrio ini masihakan tetap menempel pada kulit kista selamabeberapa jam. Embrio akan menyelesaikanperkembangannya kemudian berubah menjadinaupili yang sudah bisa berenang bebas padafase ini. Awalnya naupili akan berwarnajingga kecokelatan akibat masih mengandungkuning telur. Artemia yang baru menetas tidakakan makan karena mulut dan anusnya belumterbentuk dengan sempurna. Setelah 12 jammenetas, Artemia akan mengganti kulit danmemasuki tahap larva kedua. Dalam fase inimereka akan mulai makan dengan pakanberupa mikroalga, bakteri, dan detritusorganik lainnya. Naupili akan berganti kulitsebanyak 15 kali sebelum menjadi dewasadalam waktu 8 hari. Artemia dewasa rata-rataberukuran sekitar 8 mm, meskipun demikianpada kondisi yang tepat mereka dapatmencapai ukuran sampai dengan 20 mm.

Kadar oksigen harus dijaga dengan baikuntuk pertumbuhan A. salina. A. salina akanberwarna kuning atau merah jambu denganmasukan oksigen yang baik. Warna ini bisaberubah menjadi kehijauan apabila merekabanyak mengonsumsi mikroalga. Apabilakadar oksigen dalam air rendah dan air banyakmengandung bahan organik, atau apabilasalinitas meningkat, A. salina akan memakanbakteria, detritus, dan sel-sel khamir (yeast).Kondisi ini akan menyebabkan Artemiamemproduksi hemoglobin sehingga tampakberwarna merah atau jingga. Apabila keadaanini terus berlanjut mereka akan mulaimemproduksi kista.

Kista A. salina dapat ditetaskan secaraoptimal apabila syarat-syarat yang diperlukandapat dipenuhi, yaitu salinitas antara 20-30ppt atau 1-2 sendok teh garam per liter airtawar. Suhu air (26-28)0C. Penyinaran selamapenetasan untuk merangsang proses. Aerasiyang cukup untuk menjaga oksigen terlarutsekitar 3 ppm. Nilai pH 8.0 atau lebih, apabilapH turun di bawah 7.0 dapat ditambahkanNa2CO3 untuk menaikkan pH. Kepadatan

kista sekitar 2 gram per liter. Penetasan dapatdilakukan pada semua jenis wadah.Dekapsulasi dapat meningkatkan persentasekeberhasilan penetasan sampai 10%.Dekapsulasi merupakan suatu proses untukmenghilangkan lapisan terluar dari kistaartemia yang ”keras” (korion). Di samping ituproses ini juga merupakan proses disinfeksiterhadap kontaminan seperti bakteri dan jamur(Meyer et al. 1982).

Elektroforesis Gel SDS PoliakrilamidElektroforesis gel Sodium Dodesil Sulfat(SDS) poliakrilamid adalah suatu teknik yangbanyak digunakan dalam bidang biokimia,forensik, genetika, dan biologi molekuleruntuk memisahkan protein sesuai denganmobilitas elektroforesis mereka (fungsi daripanjang rantai polipeptida atau bobotmolekul). Sampel elektroforesis gel SDSmemiliki muatan identik per satuan massaakibat pengikatan sampel dengan SDS dansampel elektroforesis tersebut di fraksinasiberdasarkan ukuran (Gam & Latiff 2005).

Prinsip elektroforesis gel SDSpoliakrilamid adalah protein yang akandianalisis dicampur dengan SDS yangmerupakan sebuah deterjen anionik. Sodiumdodesil sulfat mendenaturasi struktur tersier,sekunder dan ikatan non-disulfida.Elektroforesis gel SDS poliakrilamidmenerapkan muatan negatif untuk setiapprotein dalam proporsi dengan massanya.Pemanasan sampel pada suhu kurang lebih 60ºC mengguncang molekul dan membantu SDSuntuk mengikat. Penanda berupa pewarnadapat ditambahkan ke dalam larutan proteinuntuk memungkinkan eksperimen dapatmelacak migrasi protein melalui gel selamaelektroforesis dijalankan. Pewarna berukuranlebih kecil dibandingkan ukuran protein(Jovanovic et al. 2007).

Medan listrik diterapkan di seluruh gelyang menyebabkan protein bermuatan negatifbermigrasi menuju anoda. Setiap protein akanbergerak berbeda melalui matriks gel. Proteinyang berbobot molekul kecil akan lebihmudah melalui pori-pori pada gel, sedangkanprotein yang berbobot molekul lebih besarakan memiliki lebih banyak kesulitan untukmelewati pori-pori tersebut. Setelah waktuyang telah ditentukan protein akan bermigrasiberdasarkan ukuran; protein yang lebih kecilakan bermigrasi jauh di bawah gel, sedangkanyang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titikasal. Protein dapat dipisahkan berdasarkanukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff2005).