transkripsi translasi manipulasi ekspresi gen pcr …
Post on 02-Apr-2022
21 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA3132 Manipulasi Ekspresi Gen 1
TRANSKRIPSI – TRANSLASI
MANIPULASI EKSPRESI GEN
PCR – ISOLASI – AMPLIFIKASI FRAGMEN DNA
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
PUSTAKA
1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington DC,
halaman 121-159 and 163-187
2. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, Blackwell Publ. Oxford,
halaman 277 - 300
Sekolah Farmasi ITB Manipulation of gene expression 2
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 3
Tujuan Topik
1. Mampu menjelaskan masing-masing proses transkripsi dan translasi
DAN komponennya
2. Mampu membedakan proses transkripsi dan translasi
3. Mampu menjelaskan tentang regulasi ekspresi gen dan penerapannya
pada produksi protein rekombinan
4. Mampu menjelaskan PCR dan aplikasinya dalam mengisolasi dan
mengamplifikasi fragmen DNA serta mengidentifikasi fragmen DNA
Sekolah Farmasi ITB Asam Nukleat, Protein, Aliran info genetik 5
Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi
Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop
Inisiasi
transkripsi
(+1)
Coding sequence/CDS = Open reading frame/ORF
(from start to stop codon)
terminator
5’
3’
3’
5’
RBS
Kodon start
Kodon stop
STRUKTUR GEN PROKARIOT
(Konstitutif-tidak diregulasi)
Promotor
Sekolah Farmasi ITB Asam Nukleat, Protein, Aliran info genetik 6
Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi,situs aktivator, operator
Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop
Inisiasi
transkripsi
Coding sequence/CDS = Open reading frame/ORF
(from start to stop codon)
terminator
5’
3’
3’
5’
RBS
Kodon start
Kodon stop
STRUKTUR GEN PROKARIOT
(Diregulasi)
Promotor
operator
Situs
aktivator
EKSPRESI GEN
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 17
promotor
Inisiasi transkripsi
kerangka baca terbuka (open
reading frame = ORF) /
coding sequence = CDS
terminator
3’RBS
kodon start kodon stop3’ 5’
5’operator
situs aktivator
DNA
RNA
PROTEIN
Inisiasi transkripsi
3’RBS
kodon start kodon stop
5’
-CN-
Produk gen → protein / RNA (final = rRNA & tRNA)
Regulasi ekspresi gen
• Ekspresi gen secara alami :
– Tidak diregulasi (konstitutif) → jumlah yang diekspresikan selalu sama dalam
setiap kondisi (ex = housekeeping gene)
– Diregulasi → jumlah yang diekspresikan berbeda tergantung kondisi tertentu
(keberadaan regulator & sinyal di lingkungan)
• Ekspresi gen dapat dimanipulasi untuk mendapatkan protein
rekombinan dalam jumlah banyak
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 18
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 21
REGULASI EKSPRESI DNA SISIPAN PADA VEKTOR EKSPRESI
• PENGGUNAAN PROMOTOR KUAT
• PROTEIN REKOMBINAN YANG DIHASILKAN DAPAT TOKSIK TERHADAP SEL
• BAGAIMANA CARANYA:
– EKSPRESI GEN PERLU DIREGULASI
– PENGGUNAAN PROMOTOR YANG DIREGULASI
21
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 22
CONTOH HASIL OVERPRODUKSI DAN PURIFIKASI
1 2 3 4 5 6 7 8
94 kDa
67
43
30
20
1 = PROTEIN MARKER
2 DAN 6 = PROTEIN TOTAL (TIDAK DIINDUKSI)
3,4,5 = PROTEIN TOTAL (DIINDUKSI IPTG)
7, 8 = PROTEIN HASIL PEMURNIAN
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 26
REPRESOR & INDUSER
• REPRESOR MENGHALANGI TRANSKRIPSI DENGAN MENGENALI OPERATOR →MENCEGAH RNA POLIMERASE BERIKATAN DENGAN PROMOTOR
• INDUSER (IPTG) BERIKATAN DENGAN REPRESOR → KONFORMASI REPRESOR BERUBAH → REPRESOR LEPAS DARI OPERATOR → RNA POLIMERASE DAPAT MENGKATALISIS TRANSKRIPSI
• HARUS DAPAT MEMBEDAKAN REPRESOR (PROTEIN) DAN INDUSER (BUKAN PROTEIN, TURUNAN GULA)
26
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 27
KOMPONEN TRANSKRIPSI
Komponen
transkripsi ?
Komponen
regulasi
transkripsi ?
DNA ?
PROTEIN ?
Aplikasi Promotor pada Vektor
untuk Produksi Protein rekombinan
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 28
ALAMI APLIKASI
Plac OORF
gen target
Protein Target
Sistem/Kaset Ekspresi (pada vektor)
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 29
promotor operator RBS ATG MCS STOP codon terminator
Kaset ekspresi
SD= shine dalgarno = RBS)
Komponen transkripsi ?
Komponen translasi ?
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 30
TRANSKRIPSI/TRANSLASI/
REGULASI EKSPRESI GEN
PERTANYAAN ?
PCR – isolasi dan amplifikasi Fragmen DNA (identifikasi)
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 31
PCR = polymerase chain reaction
• PCR → replikasi secara in vitro
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 35
Komponen
replikasi ?Komponen
PCR ?
PCR → ISOLASI & AMPLIFIKASI FRAGMEN DNA (identifikasi)
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 38
PCR → IDENTIFIKASI FRAGMEN DNA
Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 39
BAGAIMANA
PRINSIPNYA
?
top related