transkripsi translasi manipulasi ekspresi gen pcr …

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA3132 Manipulasi Ekspresi Gen 1

TRANSKRIPSI – TRANSLASI

MANIPULASI EKSPRESI GEN

PCR – ISOLASI – AMPLIFIKASI FRAGMEN DNA

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

PUSTAKA

1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular Biotechnology: Principles

and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington DC,

halaman 121-159 and 163-187

2. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis, Blackwell Publ. Oxford,

halaman 277 - 300

Sekolah Farmasi ITB Manipulation of gene expression 2

Sekolah Farmasi ITB Manipulasi Ekspresi Gen 3

Tujuan Topik

1. Mampu menjelaskan masing-masing proses transkripsi dan translasi

DAN komponennya

2. Mampu membedakan proses transkripsi dan translasi

3. Mampu menjelaskan tentang regulasi ekspresi gen dan penerapannya

pada produksi protein rekombinan

4. Mampu menjelaskan PCR dan aplikasinya dalam mengisolasi dan

mengamplifikasi fragmen DNA serta mengidentifikasi fragmen DNA


TRANSKRIPSI, TRANSLASI & EKSPRESI GEN

Sekolah Farmasi ITB Asam Nukleat, Protein, Aliran info genetik 5

Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi

Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop

Inisiasi

transkripsi

(+1)

Coding sequence/CDS = Open reading frame/ORF

(from start to stop codon)

terminator

5’

3’

3’

5’

RBS

Kodon start

Kodon stop

STRUKTUR GEN PROKARIOT

(Konstitutif-tidak diregulasi)

Promotor

Sekolah Farmasi ITB Asam Nukleat, Protein, Aliran info genetik 6

Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi,situs aktivator, operator

Komponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop

Inisiasi

transkripsi

Coding sequence/CDS = Open reading frame/ORF

(from start to stop codon)

terminator

5’

3’

3’

5’

RBS

Kodon start

Kodon stop

STRUKTUR GEN PROKARIOT

(Diregulasi)

Promotor

operator

Situs

aktivator

Sekolah Farmasi ITB Aliran info genetik 7

STRUKTUR GEN EUKARIOT


TRANSKRIPSI

TRANSKRIPSI


www.khanacademy.org


Apa komponen

TRANSKRIPSI???

DNA ? RNA ? PROTEIN ?

TRANSKRIPSI- TRANSLASI


www.khanacademy.org


TRANSLASI

Sekolah Farmasi ITBAsam Nukleat, Protein, Aliran info genetik

13

Translasi


Apa komponen

TRANSLASI???

DNA ? RNA ? PROTEIN ?

Sekolah Farmasi ITBAsam Nukleat, Protein, Aliran info genetik

15

Kodon stop Kodon start

EKSPRESI GEN


promotor

Inisiasi transkripsi

kerangka baca terbuka (open

reading frame = ORF) /

coding sequence = CDS

terminator

3’RBS

kodon start kodon stop3’ 5’

5’operator

situs aktivator

DNA

RNA

PROTEIN

Inisiasi transkripsi

3’RBS

kodon start kodon stop

5’

-CN-

Produk gen → protein / RNA (final = rRNA & tRNA)

Regulasi ekspresi gen

• Ekspresi gen secara alami :

– Tidak diregulasi (konstitutif) → jumlah yang diekspresikan selalu sama dalam

setiap kondisi (ex = housekeeping gene)

– Diregulasi → jumlah yang diekspresikan berbeda tergantung kondisi tertentu

(keberadaan regulator & sinyal di lingkungan)

• Ekspresi gen dapat dimanipulasi untuk mendapatkan protein

rekombinan dalam jumlah banyak


PROMOTOR KUAT – PROMOTOR LEMAH

EFISIENSI TRANSKIRPSI = JUMLAH mRNA PER SATUAN WAKTU

PROMOTOR YANG DIREGULASI


REGULASI EKSPRESI DNA SISIPAN PADA VEKTOR EKSPRESI

• PENGGUNAAN PROMOTOR KUAT

• PROTEIN REKOMBINAN YANG DIHASILKAN DAPAT TOKSIK TERHADAP SEL

• BAGAIMANA CARANYA:

– EKSPRESI GEN PERLU DIREGULASI

– PENGGUNAAN PROMOTOR YANG DIREGULASI

21


CONTOH HASIL OVERPRODUKSI DAN PURIFIKASI

1 2 3 4 5 6 7 8

94 kDa

67

43

30

20

1 = PROTEIN MARKER

2 DAN 6 = PROTEIN TOTAL (TIDAK DIINDUKSI)

3,4,5 = PROTEIN TOTAL (DIINDUKSI IPTG)

7, 8 = PROTEIN HASIL PEMURNIAN


Regulasi ekspresi gen

OF

F


Regulasi ekspresi gen (TERINDUKSI)

O

N


REPRESOR & INDUSER

• REPRESOR MENGHALANGI TRANSKRIPSI DENGAN MENGENALI OPERATOR →MENCEGAH RNA POLIMERASE BERIKATAN DENGAN PROMOTOR

• INDUSER (IPTG) BERIKATAN DENGAN REPRESOR → KONFORMASI REPRESOR BERUBAH → REPRESOR LEPAS DARI OPERATOR → RNA POLIMERASE DAPAT MENGKATALISIS TRANSKRIPSI

• HARUS DAPAT MEMBEDAKAN REPRESOR (PROTEIN) DAN INDUSER (BUKAN PROTEIN, TURUNAN GULA)

26


KOMPONEN TRANSKRIPSI

Komponen

transkripsi ?

Komponen

regulasi

transkripsi ?

DNA ?

PROTEIN ?

Aplikasi Promotor pada Vektor

untuk Produksi Protein rekombinan


ALAMI APLIKASI

Plac OORF

gen target

Protein Target

Sistem/Kaset Ekspresi (pada vektor)


promotor operator RBS ATG MCS STOP codon terminator

Kaset ekspresi

SD= shine dalgarno = RBS)

Komponen transkripsi ?

Komponen translasi ?


TRANSKRIPSI/TRANSLASI/

REGULASI EKSPRESI GEN

PERTANYAAN ?

PCR – isolasi dan amplifikasi Fragmen DNA (identifikasi)


PCR

Thermocycler

SIKLUS PCR


POLIMERISASI

PCR = polymerase chain reaction

• PCR → replikasi secara in vitro


Komponen

replikasi ?Komponen

PCR ?


PCR & Amplifikasi

Fragmen DNA


PCR & Isolasi

Fragmen DNA

Spesifisitas

Primer !

PCR → ISOLASI & AMPLIFIKASI FRAGMEN DNA (identifikasi)


PCR → IDENTIFIKASI FRAGMEN DNA


BAGAIMANA

PRINSIPNYA

?


PERTANYAAN

?

transkripsi translasi manipulasi ekspresi gen pcr …

Documents