laporan praktikum mikroba

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI β-1,3-GLUKANASE DARI BACILLUS LICHEMIFORMIS STRAIN HSA3-1a

NAMA : RIFA’ATUL MAHMUDAH M.

NIM : H 311 08 272

KELOMPOK : II (DUA)

HARI/TGL PERC. : SENIN/29 NOVEMBER 2010

ASISTEN : NURLAIDA

LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR2010

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 10 Desember 2010

Asisten Praktikan

(NURLAIDA) (RIFA’ATUL MAHMUDAH M.)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Enzim merupakan biokatalisator atau katalisator organik yang dihasilkan

oleh sel. Enzim mengatur kecepatan dan kekhususan ribuan reaksi kimia yang

berlangsung di dalam sel. Walaupun enzim dibuat di dalam sel, tetapi untuk

bertindak sebagai katalis tidak harus berada di dalam sel. Reaksi yang

dikendalikan oleh enzim antara lain ialah respirasi, pertumbuhan dan

perkembangan, kontraksi otot, fotosintesis, fiksasi, nitrogen, dan pencernaan.

Teknologi produksi enzim perlu menggunakan mahluk hidup (agen biologi

mulai dari organisme tingkat rendah seperti bakteri, jamur, fungi, dan ragi hingga

ke tingkat tinggi seperti tanaman, binatang, dan manusia) sebagai ”pabrik

pemroses” yang layak secara ekonomi. Enzim-enzim yang secara ekonomi telah

masuk pasar kebanyakan berasal dari golongan enzim-enzim hidrolitik, yang

masih diproduksi secara konvensional dan belum optimal atau diimport dari

negara luar.

Enzim-enzim hidrolitik yang banyak digunakan adalah golongan

karbohidrase (seperti α-amilase, β-amilase, glukoamilase, α-glukosidase,

βglukosidase, pullulanase, glukose isomerase, invertase, laktase, selulase,

sellobiase, β-glukanase, xilanase, hemiselulase, lakase, dan pektinase), golongan

protease (seperti protease asam, protease netral, dan protease basa), dan golongan

lipase.

Dalam percobaan ini berusaha untuk mengisolasi jenis enzim β-1,3-

glukanase dari mikroba penghasil enzim ekstraseluler yaitu isolate dari Bacillus

Lichemisformis. Adapun produksi enzim dari mikroba ini dilakukan karena

memiliki keunggulan dari pada isolasi melalui produksi non enzim yaitu produksi

enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruang yang relatif terbatas,

waktu produksi singkat, tempat produksi di mana saja, mudah dikontrol, dan lain-

lain. Atas dasar inilah maka dilakukan percobaan ini.

1.1. Maksud dan Tujuan Percobaan

1.1.1. Maksud Percobaan

Untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi enzim dari mikroba.

1.2.2. Tujuan Percobaan

Untuk mengetahui teknik isolasi enzim β-1,3-Glukanase dari mikroba

Bacillus Lichemiformis Strain HSA3-1a.

1.3. Prinsip Percobaan

Mengisolasi enzim β-1,3-Glukanase dari mikroba Bacillus Lichemiformis

Strain HSA3-1a dalam suatu medium padat dengan cara menginokulasi pada agar

cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran kultur mikroba di atas agar

pada kondisi optimum yaitu suhu 55 oC dan pH 7.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Enzim adalah katalis. Enzim menurunkan energi pengaktifan suatu proses

dengan jalan menempatkan seluruh gugus reaktif dalam orientasi yang tepat serta

membantu berlangsungnya reaksi bersama gugus-gugus asam dan basa. Pada

beberapa kasus, enzim menstabilkan (berikatan hingga tercapai keefektifan)

keadaan transisi suatu reaksi (Bresnik, 2003).

Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang

terjadi dalam sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108

sampai 1011 kali lebih cepat apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi

enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, di samping itu

mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka

enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada

yang membutuhkan enenrgi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan

energi atau mengeluarkan energi (eksergonik) (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).

Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memenuhi persyaratan

untuk pertumbuhannya. Beberapa persyaratan media pertumbuhan mikroba antara

lain kandungan nutrisi dalam media, pH, suhu, dan tidak tercemar (tidak terpolusi)

oleh toksin, dan lain-lain (Nurwantoro dan Djarijah, 1997).

Enzim β-1,3-glukanase dari filtrat kultur Trichoderma harzianum BIO

10671 telah berjaya dimurnikan dengan 80 % aseton, diikuti kromatografi

penukaran ion menggunakan Neobar AQ dan pemfokusan kromatografi

menggunakan kolum Mono P HR 5/20. Dua β-1,3-glukanase berukuran 32 kDa

dan 66 kDa telah dimurnikan dan ditunjukkan pada SDS-PAGE. pH aptimum bagi

aktivitas enzim ini ialah pada pH 4,5 dan aktivitas maksimum diserap pada 45°C.

Manakala aktivitas enzim dihalangi 20 – 45 % oleh 20mM Zn2+, Ca2+, C02+, Mi+,

Cu2+, Mn2+ dan Fe2+. Aktivitas hidrolisis β-1,3-glukanase tertinggi didapati pada

laminarin disebabkan persamaan ikatan β -glikosidik dan diikuti masing-masing

pada pustulan, glukan dan selulosa (Mustafa dkk, 2005).

Apabila suatu sel mikroba (misalnya, bakteri) ditumbuhkan pada suatu

medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba tersebut akan

mengadakan multiplikasi secara aseksual dengan pembelahan sel menjadi dua sel

vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses tersebut berlangsung terus-menerus

selama nutrisi, energi, dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi syarat

tumbuh (Nurwantoro dan Djarijah, 1997).

Prinsip perhitungan cawan yaitu, jika sel mikroba yang masih hidup

ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang

biak dan akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa

menggunakan mikroskop. Metode hitung cawan merupakan metode atau cara

yang paling sensitive untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan

berikut (Fardiaz, 1989):

1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus

3. Dapat digunkan untuk isolasi dan identifikasi mikroba

Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan

mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut (Fardiaz, 1989):

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya,

karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni

2. Medium dan kondisi yang berbeda dapat menghasilkan silai yang berbeda

3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan

membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar

4. Memerlukan persipan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan

koloni dapat dihitung.

Untuk metode tuang, inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu

sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan

juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi

sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni (Fardiaz, 1989).

Faktor-faktor yang mempengaruhi kehidupan dan pertumbuhan

mikroorganisme (Buckle dkk, 1987) adalah:

1. Suplai zat gizi

Seperti halnya makhluk lain, mikroorganisme juga membutuhkan suplai

makanan yang akan menjadi sumber energi dan menyediakan unsur-unsur kimia

dasar untuk pertumbuhan sel. Unsure-unsur dasar tersebut adalah karbon,

nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, magnesium, zat besi dan sejumlah

kecil logam lainnya.

2. Waktu

Waktu antara masing-masing pembelahan sel berbeda-beda tergantung

dari spesies dan kondisi lingkungannya.

3. Suhu

Suhu adalah salah satu factor lingkungan terpenting yang mempengaruhi

kehidupan dan pertumbuhan organisme. Suhu dapat mempengaruhi

mikroorganisme dalam dua cara yang berlawanan.

a. Apabila suhu naik, kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat.

Sebaliknya apabila suhu turun, kecepatan metabolisme juga turun dan

pertumbuhan diperlambat.

b. Apabila suhu naik atau turun, tingkat pertumbuhan mungkin terhenti,

komponen sel menjadi tidak aktif dan sel-sel dapat mati.

4. Nilai pH

Setiap organisme mempunyai kisaran nilai pH di mana pertumbuhan

masih memungkinkan dan masing-masing biasanya mempunyai pH optimum.

5. Aktivitas air

Semua organisme membutuhkan air untuk kehidupannya. Air berperan

dalam reaksi metabolit dalam sel dan merupakan alat pengangkut zat-zat gizi atau

bahan limbah ke dalam dan ke luar sel. Semua kegiatan ini membutuhkan air

dalam bentuk cair dan apabila air tersebut mengalami kristalisasi dan membentuk

es atau terikat secara kimiawi dalam larutan gula atau garam, maka air tersebut

tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme. Jumlah air yang terdapat dalam

bahan pangan atau larutan dikenal sebagai aktivitas air (water activity = aw). air

murni mempunyai nilai aw = 1,0. Jenis mikroorganisme yang berbeda

membutuhkan jumlah air yang berbeda pula untuk pertumbuhannya.

6. Ketersediaan oksigen

Tidak seperti bentuk kehidupan lainnya, mikroorganisme berbeda nyata

dalam kebutuhan oksigen guna metabolismenya. Beberapa kelompok dapat

dibedakan sebagai:

a. Organisme aerobik, di mana tersedianya oksigen dan penggunaannya

dibutuhkan untuk pertumbuhan.

b. Organisme anaerobik, tidak dapat tumbuh dengan adanya oksigen dan bahkan

oksigen ini dapat meruapakan racun bagi organisme tersebut.

c. Organisme anaerobik fakultatif, di mana oksigen akan dipergunakan apabila

tersedia, organisme tetap dapat tumbuh dalam keadaan anaerobik.

d. Organisme mikroerofilik (microaerophilic organisms), yaitu mikroorganisme

yang lebih dapat tumbuh pada kadar oksigen yang lebih rendah daripada kadar

oksigen dalam atmosfer.

7. Faktor-faktor kimia

Telah diketahui banyak zat kimia yang dapat menghambat pertumbuhan

mikroorganisme atau membunuh mikroorganisme yang telah ada.

8. Radiasi

Sinar ultraviolet dengan panjang gelombang tertentu dan radiasi ionisasi

seperti sinar X dan sinar gamma dapat mudah terserap oleh sel mikroorganisme.

Sinar-sinar tersebut dapat mengganggu metabolisme sel dan umumnya dapat cepat

mematikan.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, E., dan Wootton, M., 1987, Ilmu Pangan, di terjemahkan oleh Nawangsari Sugiri, UI-Press, Jakarta.

Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, diterjemahkan oleh Hadian Kotong, Hipokrates, Jakarta.

Fardiaz, S., 1989, Analisis Mikrobiologi Pangan, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen Perguruan Tinggi Pusat Antar Universitas dan Gizi IPB, Bogor.

Mustafa, M., Ramli, S., Ithnin, N., Tohfan, N. F., 2005, Purification and Characterisation of β-1,3-glucanase from Trichoderma Harzianum BIO 10671, Jurnal Pertanian J. Trop. Agric. Sci., 28 (1), 23-31, (online) (http://psasir.upm.edu.my/3653/1/Purification_and_Characterisation_of_,B-l,3-giucanase_from.pdf), di akses tanggal 29 November 2010, pukul 07.12 WITA.

Nurwantoro dan Djarijah, A.S., 1997, Mikrobiologi Pangan Hewan-Nabati, Kanisus, Yogyakarta.

Poedjiadi, A. dan Supriyanti F. M. T., 2006, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi, UI-Press, Jakarta.

BAB III

METODE PERCOBAAN

1.1. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini, yaitu bakto agar 1,5 %,

yeast ekstrak 0,05 %, NaCl 0,1 %, pepton, 0,01 %, CMC 0,1 %, ammonium sulfat

0,7 %, K2HPO4, MgSO4.7H2O 0,01 %, akuades, alkohol, korek api, aluminium

foil, spiritus, sabun dan tissue roll.

1.2. Alat

Alat-alat yang digunakan pada percobaan kali ini, yaitu cawan petri,

erlenmeyer, ose, spoit 10 mL, batang pengaduk, sendok tanduk, botol semprot,

gelas ukur 100 mL, gelas kimia, kaki tiga, kawat kasa, neraca analitik, stirrer bar,

magnetik stirrer, autoclave, oven, spektronik 20 D+, kuvet, sentrifus dingin,

parafilm dan kertas pH indikator.

1.3. Prosedur Percobaan

1.3.1. Medium Padat

Mula-mula ditimbang bakto agar 1,5 gram, yeast ekstrak 0,05 gram, NaCl

0,1 gram, pepton 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan neraca

analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu, campuran dilarutkan

dengan 100 mL akuades. Setelah tercampur, larutan distirrer sampai tercampur

sempurna lalu dipanaskan menggunakan spiritus sampai mendidih. Setelah

mendidih, larutan dimasukkan dalam autoclave setelah 30 menit, lalu dituang

kedalam cawan petri yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dicuci bersih,

dibungkus kertas dan dimasukkan kedalam oven. Larutan dituang di dalam enkas

lalu dibungkus parafilm dan didiamkan selama 1 hari. Kemudian dibuat 4 kuadran

pada cawan petri.

1.3.2.Peremajaan Mikroba

Setelah terbentuk medium padat, digoreskan bakteri Bacillus pada medium

tersebut. Mula-mula, ose dicelupkan dalam etanol lalu dibakar menggunakan

spiritus sampai membara. Dalam keadaan membara, ose ditempelkan pada

medium padat lalu digoreskan pada bakteri kemudian digoreskan kembali pada

medium padat dan jangan sampai mengenai bagian yang telah ditempelkan tadi.

Lakukan berulang-ulang sampai kuadran keempat. Setelah itu, dibungkus kembali

dengan parafilm dan dimasukkan kedalam inkubator pada suhu 50 0C.

1.3.3. Inokulum

Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak 0,05 gram,

ammonium sulfat 0,7 gram, pepton 0,01 gram, NaCl 0,1 gram, K2HPO4

0,01 gram, MgSO4.7H2O 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan

neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dalam

100 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Setelah

tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30 menit,

larutan dimasukkan ke dalam enkas dan dicelupkan bakteri sebanyak 3 ose.

Bakteri yang telah terbentuk pada medium padat di ambil menggunakan ose yang

sebelumnya dicelupkan pada etanol dan dipanaskan dengan spiritus sampai

membara. Setelah bakteri digores dengan ose, kemudian dicelupkan pada larutan

inokulum. Setelah itu, di shaker selama 1 hari.

1.3.4. Medium Produksi

Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak

0,045 gram, ammonium sulfat 0,63 gram, pepton 0,009 gram, NaCl 0,09 gram,

K2HPO4 0,009 gram, MgSO4.7H2O 0,009 gram, dan CMC 0,09 gram dengan

menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu

dilarutkan dalam 90 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna.

Setelah tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30

menit, larutan dimasukkan ke dalam enkas dan di tambahkan 10 mL larutan

inokulum yang sebelumnya telah distirrer selama 1 hari. Setelah tercampur, di

ambil 30 mL dari medium produksi dan dimasukkan kedalam botol, lalu

dimasukkan kedalam lemari es, kemudian 70 mL dari larutan tersebut di shaker

selama 72 jam.

1.3.5.Pengukuran Uji Aktivitas β-1,3-Glukanase

Dua larutan yang memiliki perlakuan berbeda, diukur pHnya menggunakan

kertas pH, kemudian di ukur absorbannya menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 660 nm dan diukur dengan menggunakan sentifus dingin

(4 0C) selama 30 menit. Setelah itu, di amati perubahan yang terjadi.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

1.4. Hasil Pengamatan

Tabel

No Waktu Fermentasi (jam) pH Optical Density (660 nm)

1 0 7 0,042

2 72 8 0,756

1.5. Pembahasan

Enzim β-1,3-glukanase secara luas ditemukan pada sebagian besar

bakteri, jamur, dan tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan pada aktivitas hidrolitik

dari β-1,3-glukanase dan hubungannya dengan infeksi pathogen, β-1,3-glukanase

dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme pertahanan melawan

pathogen. Percobaan ini difokuskan pada isolasi enzim dari mikroba, dalam hal

ini digunakan isolate Bacillus lichemiformis sebagai penghasil enzim -1,3-

glukanase.

Medium yang digunakan pada percobaan ini adalah medium padat karena

bakteri yang akan diremajakan dan diamati berupa pertumbuhan koloni. Medium

padat dibuat dengan komposisi yang sesuai dengan semua kebituhan unsur hara

yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbikan mikroba yang akan

diisolasi. Adapun komponen yang digunakan antara lain bakto agar sebagai

pemadat substrat dan komponen media lain, ammonium sulfat sebagai komponen

penyedian unsur nitrogen, yeast ekstrak sebagai sumber energi atau unsur karbon,

NaCl sebagai sumber mineral Na yang dibutuhkan untuk pertumbuhan, K2HPO4

sebagai garam yang mempertahankan pH media dalam keadaan netral,

MgSO4.7H2O sebagai sumber mineral dalam media. Keberadaan suatu substrat

dapat memacu suatu mikroorganisme untuk mensekresi metabolit sekundernya.

Media sebelum digunakan disterilkan dalam autoclave untuk mencegah

medium tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Sebelum media

dituangkan ke dalam cawan petri bagian mulut dari erlenmeyer dipanaskan dalam

nyala api lampu spritus dan pengerjaan dilakukan dalam keadaan aseptik sehingga

kontaminasi dan mikroba yang tidak diharapkan dapat dihindari.

Pada tahap peremajaan ini dilakukan dengan mengisolasi kembali biakan

murni isolate Bacillus Lichemiformis. Isolasi dilakukan dengan jarum ose. Jarum

ose yang akan digunakan sebelumnya dicelupkan dalam etanol 70 % dan

dipanaskan dalam nyala api hingga membara, supaya memastikan jarum ose bebas

dari mikroba atau dalam keadaan steril sehingga siap digunkan untuk

memindahkan biakan mikroba. Setelah dipanaskan ose diletakkan dalam medium,

sebagai tanda awal penggoresan. Bagian penggoresan pada cawan Petri dibagai

menjadi dua bagian, sehingga area penggoresan lebih luas dan mencegah bila

bagian tertentu tidak tumbuh. Jarum ose yang steril digunakan untuk mengambil

koloni mikroba pada biakan murni selanjutnya dinokulasi pada bagian mediu yang

baru dengan menggoreskan secara zig zag pada medium yang telah dibuat.

Penggoresan seara zig zag dimaksudkan agar pertumbuhan koloni yang baru bisa

menyebar sehingga kemungkinan tumbuhnya lebih besar oleh karena keberadaan

substrat yang cukup. Setiap langkah dalam tahap ini dilakukan secara aseptik agar

tidak terjadi kontaminasi, oleh karena itu setiap membuka dan menutup cawan

Petri harus dipanaskan dahulu dalam nyala api. Setelah digores media dimasukkan

dalam inkubator pada suhu 55 oC selama 3 hari, agar pengeraman mikroba dapat

dilakukan secara maksimal pada media tersebut dan juga karena karena isolate

Bacillus Lichemiformis merupakan mikroba termofilik yang optimum tumbuh

pada suhu tersebut.

Selanjutnya mikroba tersebut dipindahkan ke dalam medium produksi

untuk memperbesar ruang bagi mikroba untuk berkembang biak. Pada tahap

terakhir ialah pengukuran pH dan optical density dengan menggunakan

spektrofotometer 20 D+ untuk melihat pertumbuhan mikroba dan disentrifuge

untuk mengetahui sifat mikroba. Pengukuran absorbansi pada medium dengan

waktu fermentasi 0 jam ialah 0,042, sedangkan pada medium dengan waktu

fermentasi 72 jam ialah 0,756s. Hal ini menunjukkan bahwa semakin lama waktu

fermentasi, medium semakin keruh, yang menandakan mikroba yang tumbuh

semakin banyak. Mikroba tersebut adalah jenis mikroba ekstraseluler, hal ini

ditandai dengan larutnya tersebut dalam air.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari percobaan dapat disimpulkan bahwa enzim -1,3-glukanase dapat

diisolasi dari mikroba Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.

5.2 Saran

5.2.1 Untuk Percobaan

Agar pada percobaan selanjutnya waktu yang digunakan tidak terlalu

lama.

5.2.2 Untuk Laboratorium

Bahan-bahan dan alat yang akan digunakan dalam praktikum lebih

dilengkapi agar praktikan dapat memperoleh data yang akurat.

Lampiran : Foto Hasil Pengamatan