AKT

FAKU

TIVITAS

ULTAS MA

S ANTIOKMERA

MUHA

PROGRATEMATI

INSTITU

KSIDASIAH (Piper

AMMAD

RAM STUDIKA DAN I

UT PERTABOGO

2008

I EKSTRAr crocatum

ALFARA

DI BIOKIMILMU PEN

ANIAN BOGOR 8

AK DAUm)

ABI

MIA NGETAHUGOR

UN SIRIH

UAN ALAM

M

ABSTRAK

MUHAMMAD ALFARABI. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum). Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan POPI ASRI KURNIATIN.

Salah satu penyebab diabetes mellitus adanya senyawa radikal bebas yang menyerang lipid membran sel pankreas. Oleh karena itu, daun sirih merah yang telah diketahui sebagai antidiabetes perlu diketahui aktivitas antioksidasinya. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antioksidasi daun sirih merah dan dibandingkan dengan vitamin E 200 ppm. Metode yang digunakan adalah metode TBA dengan cara mengukur konsentrasi malondialdehida (MDA) sebagai salah satu produk autooksidasi asam linoleat. MDA bereaksi dengan asam tiobarbiturat membentuk warna merah muda dan diukur absorbannya pada panjang gelombang 532 nm. Hasil penelitian ini menunjukkan bobot jenis dari ekstrak daun sirih merah adalah 1.021 g/mL. Waktu inkubasi optimum asam linoleat diperoleh saat hari ke-9. Ekstrak daun sirih merah dengan konsentrasi 2, 10, dan 20 mg rebusan/10 mL larutan memiliki aktivitas antioksidasi yang tidak berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E 200 ppm, sedangkan konsentrasi 100 dan 200 mg rebusan/10 mL larutan berbeda nyata. Simpulan penelitian ini bahwa ekstrak daun sirih merah memiliki aktivitas antioksidasi dan semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih merah (200 mg rebusan/10 mL larutan), aktivitas antioksidasinya lebih tinggi dibandingkan vitamin E 200 ppm.

ABSTRACT

MUHAMMAD ALFARABI. Antioxidant activity The Leaf Extract of Sirih Merah (Piper crocatum). Under the direction of MEGA SAFITHRI and POPI ASRI KURNIATIN.

Diabetes mellitus can be caused by the existency of free radical which attacks membrane lipid of pancreatic cells. Previous research showed that the leaf extract of sirih merah have an activity as antidiabetic. Therefore, its activity as antioxidant have been known. The main target of this research is to find out the antioxidant activity of leaf extract of sirih merah and to compare it with vitamin E 200 ppm. This research used TBA method which measured the malondialdehyde (MDA) concentration as one product of linoleic acid autooxidation. Reaction of MDA with thiobarbituric acid made a complex colour and was measured at 532 nm wavelength. The result of this research showed that density of the leaf extract of sirih merah was 1.021 g/mL. Optimum incubated time of linoleic acid was 9 days. The leaf extract concentrations of sirih merah at 2, 10, 20 mg boiled water/10 mL solution were not significantly (α = 0.05) different with vitamin E, while the leaf extract concentration of sirih merah at 100 and 200 mg boiled water/10 mL solution were significantly (α = 0.05) different with vitamin E. Conclusion of the research shows that the leaf extract of sirih merah has antioxidant activity.

AKTIVITAS ANTIOKSIDASI EKSTRAK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum)

MUHAMMAD ALFARABI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2008

Judul : Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) Nama : Muhammad Alfarabi NIM : G44104006

Disetujui

Mega Safithri, S.Si, M.Si Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt. Ketua Anggota

Diketahui

Dr. drh. Hasim, DEA

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji dan syukur kehadirat Allah SWT karena atas rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah berjudul Potensi Antioksidan Ekstrak Daun Sirih Merah disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Maret 2008 hingga Mei 2008 di Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Mega Safithri, S.Si, M.Si dan Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt yang telah memberikan bimbingan dan saran selama berlangsungnya penelitian dan dalam penyusunan karya ilmiah. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada seluruh staf Laboratorium Biokimia terutama Pak Arya, Ibu Iis, Ibu Merry, Pak Nana, Pak Yadi, dan Eka atas bantuan teknisnya. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada ayah, ibu, dan adik atas doa dan kasih sayangnya serta kepada Arulo, Laela, Mitha, Udin, Tyas, Intan, Rangga, Kurtadji, Fitri, Aji, Hikmah Camp, Waras, Karim, dan Mas Joeyzt atas kerja samanya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2008

Muhammad Alfarabi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Juni 1986 dari ayah MZ Iqbal Moenaf dan ibu Dewi R. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.

Tahun 2004 penulis menyelesaikan sekolah menengah umum dari SMU Negeri 47 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan terdaftar sebagai mahasiswa pada program studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis melakukan praktik lapangan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Plasma Nutfah, Pemuliaan dan Perbenihan, Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) dari bulan Juli sampai Agustus 2007. Judul praktik lapangan penulis adalah Pertumbuhan Tanaman Nilam (Pogostemon cablin) Dengan Variasi Pengenceran Media Dasar Kultur Jaringan.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA Sirih Merah ......................................................................................................... 1 Radikal Bebas ..................................................................................................... 2 Antioksidan ........................................................................................................ 3 Analisis Aktivitas Antioksidan ........................................................................... 3

BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan ................................................................................................... 4 Metode Penelitian ............................................................................................... 4

HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................. 6 Penentuan waktu inkubasi asam linoleat ............................................................ 6 Aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ................................................. 7

SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................... 8

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 9

LAMPIRAN .......................................................................................................... 11

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Tanaman sirih merah (Piper crocatum) ............................................................... 2

2 Beberapa senyawa antioksidan eksogenous ......................................................... 3

3 Reaksi malondialdehida dengan asam tiobarbiturat dan struktur TMP ............... 4

4 Lipid peroksidasi .................................................................................................. 6

5 Kurva kadar MDA terhadap waktu ...................................................................... 7

6 Kadar MDA ekstrak daun sirih merah ................................................................. 8

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Tahapan umum penelitian .................................................................................. 12

2 Ekstraksi daun sirih merah ................................................................................. 12

3 Bobot jenis larutan ekstrak sirih merah .............................................................. 12

4 Pembuatan kurva standar TMP .......................................................................... 13

5 Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat ............................................ 13

6 Analisis aktivitas antioksidasi ............................................................................ 14

7 Perhitungan bobot jenis ...................................................................................... 14

8 Perhitungan pembuatan konsentrasi ................................................................... 14

9 Hasil absorban larutan standar dan kurva standar .............................................. 15

10 Hasil absorban waktu inkubasi optimum asam linoleat ................................... 15

11 Konsentrasi MDA dan daya hambat ekstrak daun sirih merah ........................ 16

12 Analisis statistik waktu inkubasi optimum dan aktivitas antioksidasi ............. 17

13 Hasil-hasil inkubasi optimum asam linoleat, aktivitas antioksidan, dan kurva standar .................................................................................................... 18

1

PENDAHULUAN

Radikal bebas merupakan senyawa yang reaktif karena mempunyai elektron yang tidak berpasangan. Senyawa ini dapat berasal dari hasil metabolisme, polutan pabrik, asap, makanan, dan sinar UV. Bila jumlah senyawa ini banyak terdapat di dalam tubuh, maka akan dapat mengoksidasi senyawa lemak, merusak protein, dan DNA (Murray 2003). Kondisi tersebut dapat menyebabkan berbagai macam penyakit seperti kanker, jantung koroner, stroke, dan diabetes mellitus. Oleh karena itu diperlukan senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas, yaitu antioksidan.

Antioksidan adalah senyawa yang dapat melengkapi kekurangan elektron pada senyawa radikal bebas sehingga senyawa tersebut stabil. Sumber antioksidan ini dapat berasal dari dalam tubuh (endogen) atau luar tubuh (eksogen). Senyawa antioksidan eksogen dapat berupa senyawa bioaktif yang banyak terdapat di tumbuhan. Senyawa-senyawa tersebut dapat berupa golongan flavonoid, alkaloid, tanin, dan glikosida. Oleh karena itu, tumbuhan dapat dijadikan sebagai sumber antioksidan alami. Penggunaan tumbuhan sebagai senyawa antioksidan secara tradisional sudah banyak dilakukan oleh masyarakat karena lebih praktis, murah, dan relatif aman. Salah satu tumbuhan Indonesia yang dapat memiliki potensi untuk menangkal radikal-radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh adalah sirih merah.

Sirih merah (Piper crocatum) merupakan jenis sirih yang merambat dan banyak tumbuh di daerah tropis khususnya Indonesia. Sirih jenis ini sebelumnya terkenal sebagai tanaman hias, kemudian berubah menjadi tanaman obat sejak diperkenalkan oleh produsen obat di Bulnyaherjo (Duryatmo 2005). Kegunaannya di masyarakat selain antiseptik, daun sirih merah dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien dengan cara memakan daunnya (Sudewo 2005).

Secara ilmiah, daun sirih merah memiliki potensi antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005). Keadaan hiperglikemia ini dapat terkait dengan adanya gangguan kerja enzim di dalam tubuh yang berfungsi sebagai antioksidan oleh senyawa radikal bebas sehingga jumlah radikal bebas di dalam tubuh meningkat yang mengakibatkan terjadinya oksidasi lipid di membran sel pankreas (Suryawanshi 2006). Keadaan tersebut menyebabkan pankreas tidak optimal mensekresikan insulin. Menurut Safithri dan

Fahma (2005), daun sirih merah mengandung senyawa bioaktif flavonoid, alkaloid, dan tanin dalam ekstrak air. Oleh sebab itu, daun sirih merah dapat berpotensi membentuk efek antioksidasi karena senyawa-senyawa flavonoid, tanin, alkaloid, dan glikosida dapat memberikan efek antioksidasi (Aqil 2006). Berdasarkan data ilmiah tersebut, daun sirih merah perlu diteliti aktivitas antioksidasinya karena penelitian mengenai aktivitas antioksidasi daun sirih merah secara in vitro di Indonesia masih belum dilakukan.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah secara in vitro menggunakan metode TBA dan membandingkan dengan vitamin E. Hipotesis penelitian ini adalah ekstrak daun sirih merah berpotensi sebagai antioksidan melalui penghambatan oksidasi asam linoleat secara in vitro dan aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah lebih besar dibandingkan dengan vitamin E. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai potensi antioksidasi daun sirih merah secara in vitro dan dapat dijadikan dasar pengembangan produk fitofarmaka sirih merah sebagai antioksidan.

TINJAUAN PUSTAKA

Sirih Merah (Piper crocatum)

Tumbuhan sirih dikenal sebagai antiseptik sejak 600 SM. Sirih termasuk famili Piperaceae yang merambat dan bersandar di batang pohon lain (Duryatmo 2005). Salah satu jenis sirih adalah sirih merah. Klasifikasi ilmiah dari sirih merah ini adalah divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Monochlamydeae, bangsa Piperales, suku Piperaceae, genus Piper, spesies Piper crocatum. Sirih merah tumbuh menjalar seperti sirih hijau, batangnya bersulur dan beruas dengan jarak buku 5-10 cm dengan setiap buku tumbuh bakal akar. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, mengkilap atau tidak berbulu, dan mempunyai warna yang khas yaitu permukaan atas hijau gelap berpadu dengan tulang daun berwarna merah hati keunguan, daun berasa pahit, berlendir, serta mempunyai bau tidak khas seperti sirih.

Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak kena sinar matahari. Jika terlalu sering kena sinar matahari maka warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram, kurang menarik dan batangnya cepat mengering karena sirih

2

merah akan tumbuh baik jika mendapatkan 60-75% cahaya matahari sehingga tempat tumbuh yang paling cocok untuk sirih merah adalah lingkungan berhawa dingin (Gambar 1).

Sirih merah (Piper crocatum) merupakan salah satu jenis sirih yang banyak dimanfaatkan sebagai tanaman hias pada tahun 1900-an namun sekarang mengalami perubahan fungsi menjadi tanaman obat sejak dikenalkan oleh Bambang Sudewo, seorang produsen tanaman obat di Bulnyahrejo (Duryatmo 2005). Daun sirih merah ini dapat digunakan untuk mengobati diabetes mellitus, maag, tekanan darah tinggi, asam urat, batu ginjal, dan ambeien. Selain itu sirih merah dapat digunakan secara bersama dengan tanaman obat lainnya untuk mengobati penyakit (Sudewo 2005). Secara ilmiah, air rebusan daun sirih merah dengan dosis pemberian 20 g/kg bobot badan dapat sebagai antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005), tidak memiliki efek toksik (Salim 2006), dapat memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006), dan memiliki potensi sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006).

Gambar 1 Tanaman sirih merah

Radikal Bebas

Radikal bebas adalah molekul yang kehilangan elektron sehingga molekul tersebut tidak stabil dan sangat reaktif berusaha mengambil elektron dari molekul atau sel lain. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh seperti hasil oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di mitokondria, oksidasi ion-ion logam transisi, atau melalui ischemik. Selain itu, radikal bebas dapat berasal dari luar tubuh seperti asap rokok, asap kendaraan bermotor, hasil penyinaran sinar ultra violet, bahan kimia dalam makanan, dan polutan lainnya.

Contoh akibat adanya radikal bebas dari luar tubuh adalah lemak yang memproduksi asam butanoat, berbau tengik setelah bereaksi dengan udara. Selain itu, sinar UV B merangsang melanosit memproduksi melanin berlebihan dalam kulit, yang tidak hanya membuat kulit lebih gelap, melainkan juga berbintik hitam. Sinar UV A merusak kulit dengan menembus lapisan basal yang menimbulkan kerutan (Gitawati 1995).

Beberapa kerusakan di dalam tubuh yang dapat timbul akibat serangan radikal bebas dari luar tubuh antara lain kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran sel terutama penyusun membran sel berupa asam lemak. Kerusakan tersebut akan menyebabkan penyakit yang umumnya bersifat kronis, yaitu dibutuhkan waktu bertahun-tahun untuk penyakit tersebut menjadi nyata (terjadi akumulasi dalam tubuh).

Radikal bebas yang biasa terdapat di dalam tubuh dan dapat merusak berasal dari turunan oksigen reaktif. Contoh oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2`), hidroksil (`OH), peroksil (ROO`), hidrogen peroksida (H2O2), singlet oksigen (O`), oksida nitrit (NO`), peroksinitrit (ONOO`) dan asam hipoklorit (HOCl) (Murray 2003).

Sumber radikal bebas, baik dari dalam maupun luar tubuh terjadi melalui tahap-tahap mekanisme reaksi dan menimbulkan reaksi berantai sehingga radikal bebas yang terbentuk semakin banyak. Tahap pertama adalah pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir (terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak reaktif (Hart 1983). Mekanisme reaksinya dapat dituliskan sebagai berikut : Inisiasi RH + OH R+ + H2O Propagasi R+ + O2 ROO- ROO- + RH ROOH + R+ Terminasi ROO- + ROO- ROOR + O2 ROO- + R+ ROOR R+ + R+ RR

3

Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralisir radikal bebas dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh radikal bebas terhadap sel normal, protein, dan lemak dengan cara melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas sehingga senyawa radikal bebas tersebut stabil dan menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukkan radikal bebas. Berdasarkan sumbernya, antioksidan terbagi menjadi antioksidan dari dalam tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen).

Antioksidan endogen contohnya seperti superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH.Prx). Enzim-enzim ini bekerja menetralkan senyawa-senyawa radikal bebas hasil metabolisme tubuh atau radikal bebas dari luar tubuh. Antioksidan eksogen contohnya berupa vitamin dan senyawa bioaktif dari tumbuhan, seperti α-tokoferol (vitamin E), beta karoten (vitamin A), dan asam askorbat (vitamin C) (Murray 2003).

Senyawa antioksidan eksogenous yang umum digunakan adalah vitamin E yang digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini. Vitamin ini diketahui berfungsi sebagai antioksidan terutama untuk asam lemak tak jenuh pada fosfolipid di membran sel (Linder 2006). Selain itu, vitamin E dapat melindungi kulit dari kerusakan dari sinar ultraviolet dengan mengurangi lipid peroksida dan degradasi DNA (Nakayama et al. 2003).

Beberapa mekanisme kerja dari senyawa antioksidan eksogenus saling membantu dengan senyawa antioksidan endogenus, seperti vitamin E akan menangkap radikal bebas tetapi vitamin E itu lalu berubah menjadi vitamin E radikal sehingga perlu pertolongan vitamin C. Setelah menangkap vitamin E radikal, vitamin C menjadi radikal juga. Akhirnya, barulah glutation yang mampu menetralkan vitamin C radikal menjadi senyawa netral tanpa menjadikan glutation turut radikal. Telah dilaporkan juga bahwa pemberian vitamin E yang dikombinasikan dengan selenium di kuda meningkatkan ketahanan sel darah merah dari stress peroksidasi dan meningkatkan aktifitas glutation peroksidase di limposit (Avellini et al. 1999). Selain itu senyawa turunan dari vitamin E juga dapat menurunkan radikal bebas yang terjadi akibat sinar UV (Jurkiewicz et al. 1995). Selain vitamin, senyawa antioksidan eksogenous dapat berasal dari esktrak tumbuhan berupa senyawa-senyawa bioaktif yang umumnya

merupakan hasil metabolit sekunder (Gambar 2).

Senyawa bioaktif tumbuhan yang memiliki efek antioksidasi dapat terdiri dari alkaloid, flavonoid, glikosida, dan tanin yang kemudian membentuk efek antioksidasi terhadap radikal bebas (Aqil et al. 2006). Senyawa-senyawa aktif tersebut banyak terdapat di bagian tumbuhan seperti akar, daun dan buah. Berdasarkan hasil penelitian Zin tahun 2002 yang menggunakan akar, daun, dan buah mengkudu yang mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, dan turunannya menghasilkan efek antioksidasi yang sama baiknya antara akar, daun, dan buah mengkudu di dalam pelarut etil asetat. Selain itu, makanan yang mengandung flavonoid dapat menjadi antioksidan untuk mencegah penyakit kanker dan jantung, seperti teh hijau dan anggur merah (Hans dan Heldt 2005). Menurut Duarte (2001), flavonoid dapat menurunkan tekanan darah dan menurunkan status oksidasi.

Gambar 2 Beberapa senyawa antioksidan

eksogenous

Analisis Aktivitas Antioksidasi

Radikal bebas dengan reaksi berantai lebih mudah menyerang asam lemak suatu membran sel terutama asam lemak tak jenuh, seperti asam linoleat, asam linolenat, dan asam arakidonat. Kerentanan asam lemak tak jenuh diserang radikal bebas karena mempunyai ikatan ganda yang mudah putus dibandingkan asam lemak jenuh dengan ikatan tunggalnya yang lebih stabil (Adawiyah et al 2001). Reaksi peroksidasi lipid menghasilkan suatu senyawa produk akhir malondialdehida (MDA). Senyawa MDA ini dapat dijadikan komponen yang diukur untuk

α-tokoferol

Isoflavon: Daidzein (R = H) Genistein (R = OH)

4

menentukan aktivitas antioksidasi. Analisis aktivitas antioksidasi dapat diukur melalui beberapa cara, yaitu metode asam tiobarbiturat (TBA), metode DPPH, uji kreis, uji masa simpan, dan rancimat (Adawiyah et al 2001).

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode asam tiobarbiturat (TBA) karena metode ini menggunakan proses autooksidasi asam lemak dengan asam lemak yang terdapat di tubuh manusia, yaitu asam lemak linoleat. Pengukuran MDA telah digunakan sebagai indikator kerusakan oksidatif asam lemak tak jenuh di sel hidup yang dapat menyebabkan perubahan struktural dan fungsi. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan spektrofotometer dari reaksi produk oksidasi asam lemak, yaitu MDA dengan asam 2-tiobarbiturat yang berwarna merah muda pada λ 532 nm (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993). Metode TBA ini menggunakan larutan standar 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP). Larutan ini lebih stabil dan memiliki kesamaan struktur serta dapat bereaksi dengan baik dengan TBA seperti MDA. Oleh karena itu, larutan TMP dapat sebagai standar MDA (Gambar 3).

(a)

(b)

Gambar 3 (a) Reaksi malondialdehida dengan asam 2-tiobarbiturat, (b) struktur TMP

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat rebusan daun sirih merah adalah daun sirih merah dan akuades. Bahan-bahan untuk penentuan waktu inkubasi asam linoleat, analisis potensi antioksidasi, dan

pembuatan kurva standar menggunakan adalah buffer fosfat 0.1 M pH 7, asam linoleat (Sigma L 1376 – 5G) 50 mM, etanol absolut, α-tokoferol (Sigma T 3634 10G), TCA (asam trikloroasetat) 20%, TBA (asam tiobarbiturat) 1%, asam asetat 50%, dan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (Sigma 066113ME-237 100 mL).

Alat-alat yang digunakan untuk membuat rebusan daun sirih merah adalah pemanas, gelas piala, dan urinometer. Alat-alat untuk penentuan waktu inkubasi asam linoleat, analisis potensi antioksidasi, dan pembuatan kurva standar adalah pipet tetes, autopipet, tabung reaksi, penangas air, gelas ukur, batang pengaduk, labu Erlenmeyer, kain kasa, sudip, corong, pemanas, termometer, neraca analitik Ohaus GA 200, gelas piala, botol gelap berulir, vorteks, kuvet, spektrofotometer Genesys 10 UV (190-1100 nm), sentrifus Hettich Universal (0-6000 rpm), dan tabung sentrifus.

Metode Penelitian

Pembuatan Rebusan Daun Sirih Merah (Safithri dan Fahma 2005)

Daun sirih merah segar ditimbang sebanyak 10 gram kemudian ditambahkan akuades sebanyak 50 mL. Daun tersebut direbus di dalam gelas piala dengan air mendidih 100 °C sampai volumenya menjadi 5 mL. Penentuan Bobot Jenis

Air rebusan daun sirih merah dimasukkan ke dalam densitometer kemudian dibaca meniskus cairan. Suhu cairan diukur lalu dihitung dengan faktor koreksi untuk mendapatkan nilai bobot jenisnya. Rumus penentuan bobot jenis sebagai berikut:

Bj terkoreksi = Bj terbaca ± faktor terkoreksi

Faktor koreksi = T1 – T2 x 10-3 (T1>T2) 3

Keterangan: - Bj terbaca ditambah faktor terkoreksi (Tcairan>Talat) - Bj terbaca dikurang faktor terkoreksi (Tcairan<Talat)

Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat dengan Metode TBA (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993)

Sebanyak 6 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7, kemudian ditambah 6 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, dan 3 mL air bebas

TBA MDA Produk Air

5

ion dicampurkan. Sebanyak 1 mL campuran ditempatkan di botol gelap kemudian campuran diinkubasi pada suhu 40 °C. Pengukuran intensitas serapannya dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL campuran asam linoleat yang telah diinkubasi ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Pengukuran dilakukan setiap hari hingga tercapai serapan maksimum. Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7.0, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan blanko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit.

Analisis Aktivitas Antioksidasi dengan Metode TBA (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993)

Air rebusan daun sirih merah sebagai larutan sampel dibuat dalam konsentrasi 2, 10, 20, 100, dan 200 mg rebusan/10 mL larutan. Masing-masing sampel diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%. Larutan kontrol positif digunakan 1 mL α-tokoferol, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%, sedangkan larutan kontrol negatif ditambahkan 1 mL air bebas ion, 2 mL bufer fosfat 0.1 M pH 7.0 dan 2 mL asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8%.

Semua larutan ini kemudian dimasukkan dalam botol gelap dan diinkubasi di penangas 40°C selama waktu inkubasi optimum dari metode TBA. Pada hari waktu inkubasi optimum, dilakukan pengukuran MDA melalui metode TBA dengan mengambil 1 mL dari setiap larutan, kemudian ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian panjang gelombangnya diukur pada panjang gelombang 532 nm.

Larutan blanko digunakan 1 mL campuran 3 mL etanol 99.8 % dan 2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7.0, kemudian ditambahkan 2 mL TCA 20 % dan 2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 %. Larutan blamko tersebut diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit.

Pembuatan kurva standar dilakukan dengan menggunakan larutan 1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) dengan konsentrasi 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 µM. Tiap larutan dipipet 1 mL dan ditambahkan 2 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan TBA 1% dalam asam asetat 50%. Campuran reaksi diletakkan dalam penangas air 100°C selama 10 menit. Setelah dingin larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm (diameter rotor sentrifus 130 mm) selama 15 menit. Kemudian serapannya diukur pada panjang gelombang 532 nm. Larutan blanko menggunakan 1 mL akuades yang diberi perlakuan seperti larutan konsentrasi TMP lainnya (konsentrasi 0 TMP). Analisis Data

Pengukuran potensi antioksidasi sampel dilakukan dengan rancangan percobaan acak lengkap (RAL). Kelompok pertama adalah ekstrak daun sirih merah dengan konsentrasi 2, 10, 20, 100, dan 200 mg rebusan/10 mL larutan dan setiap konsentrasi dilakukan dua kali ulangan. Kelompok kedua adalah vitamin E (kontrol positif) dengan konsentrasi 200 ppm dan dilakukan dua kali ulangan. Kelompok ketiga adalah akuades (kontrol negatif) dengan dua kali ulangan. Pengukuran dilakukan pada hari waktu inkubasi optimum.

Data kompleks MDA-TBA dianalisis secara statistik dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL). Model rancangan tersebut adalah: Yij = μ + λ + εij keterangan: μ = Pengaruh rataan umum λi = Pengaruh perlakuan ke-I, i = 1,2,3,..,6 εij= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3 i = 1 kontrol negatif tanpa antioksidan i = 2 ekstrak 2 mg rebusan/10 mL larutan i = 3 ekstrak 10 mg rebusan/10 mL larutan i = 4 ekstrak 20 mg rebusan/10 mL larutan i = 5 ekstrak 100 mg rebusan/10 mL larutan i = 6 ekstrak 200 mg rebusan/10 mL larutan i = 7 pembanding atau kontrol positif α-tokoferol 200 ppm

6

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi Daun Sirih Merah

Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan suatu komponen dari suatu campuran sehingga menjadi komponen-komponen yang terpisah (Harborne 1987). Komponen yang polar akan larut dalam pelarut polar, sedangkan komponen non polar akan larut dalam pelarut non polar. Senyawa–senyawa bioaktif dari daun sirih merah dalam ekstrak air adalah flavonoid, alkaloid, dan tanin (Safithri dan Fahma 2005). Senyawa-senyawa tersebut yang diperkirakan berperan sebagai antioksidan dari sirih merah. Flavonoid dan tanin merupakan senyawa fenolik. Golongan flavonoid merupakan senyawa fenolik terbesar dalam tumbuhan. Flavonoid memiliki aktivitas biologis seperti antibakteri, antioksidan, antifungal (Hans dan Heldt 2005). Ekstrak daun sirih merah ini perlu ditentukan bobot jenisnya terlebih dahulu. Penentuan bobot jenis bertujuan untuk memudahkan menentukan konsentrasi perlakuan. Bobot jenis air rebusan sirih merah dalam percobaan ini adalah 1.021 g/mL.

Pelarut untuk ekstraksi daun sirih merah adalah air. Pemilihan air sebagai pelarut bertujuan untuk mempermudah aplikasi dalam masyarakat. Selain itu, berdasarkan informasi ilmiah bahwa air rebusan sirih merah dapat sebagai antihiperglikemia (Safithri dan Fahma 2005), memperbaiki pankreas terhadap tikus hiperglikemia (Permata 2006), memiliki aktivitas sebagai hepatoprotektor (Windyagiri 2006), dan tidak ada efek toksik pada dosis 20 g/kg BB (Salim 2006). Selain air, pelarut lain seperti etanol dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa bioaktif dari daun sirih merah.

Penentuan Waktu Inkubasi Asam Linoleat

Malondialdehida merupakan salah satu produk hasil oksidasi asam linoleat. Tahap awal dari reaksi radikal, asam linoleat akan kehilangan pasangan elektron pada ikatan ganda. Reaksi ini terjadi secara bertahap sehingga terjadi penataan ulang struktur asam linoleat sebagai diena terkonjugasi. Tahap selanjutnya adalah asam linoleat sudah banyak terbentuk menjadi radikal dengan reaksi lanjut senyawa radikal asam linoleat terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu malondialdehida (MDA) (Gambar 4). Kadar MDA adalah komponen yang diukur dalam penelitian ini. Kadar MDA dapat ditentukan dengan metode TBA (Ottolenghi 1959 dalam Kikuzaki dan Nakatani 1993). Reaksi antara MDA dan TBA menghasilkan senyawa kompleks MDA-TBA berwarna merah. Absorbansi dari senyawa tersebut diukur tiap 24 jam pada panjang gelombang 532 nm untuk melihat pembentukkan MDA maksimum.

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses oksidasi asam linoleat adalah panas, cahaya, oksigen, dan ion logam (Schultz 1962). Percobaan ini mengkondisikan campuran asam linoleat, larutan buffer fosfat, dan akuades diinkubasi dalam botol gelap dengan suhu 40 °C. Oleh karena itu, faktor panas dan oksigen saja yang mempengaruhi oksidasi asam linoleat.

Hasil percobaan menunjukkan kadar MDA dari hari ke-0 hingga hari selanjutnya mengalami peningkatan. Pembentukkan MDA sebagai produk hasil oksidasi asam linoleat terjadi maksimum di hari ke-9. Proses ini dapat ditentukan karena ada lonjakan tinggi kadar MDA dari hari sebelumnya dan hari berikutnya tidak terjadi lonjakkan yang tinggi.

Gambar 4 Lipid peroksidasi (Murray 2003)

Oleh karenasemua asamterdekompoanalisis poteke-9 (Gamb

Waktu idalam percodengan meseperti metoterkonjugasiadalah mhidroperoksmencapai kasedangkan mengukur terkonjugasiyang mengrangkapnya.

Secara uhidroperoksdiena terko(Martsolich diasumsikanterdekompoanalisis akdilakukan dkadar hidromaksimum karena itu, pmenyebabkaSelain itu, langsung, dterbentuknyasam linolea

Gambar 5 K

Aktivitas A

Salah salinoleat ad

a itu dapat diasm linoleat yasisi menjadi Mensi antioksidar 5). inkubasi opti

obaan lebih lamenggunakan ode FTC (Ferii. Prinsip dmengukur ida yang adar maksimu

metode dabsorban d

i yang terbengalami penata. umum, kadar ida (metode onjugasi terj2007). Dua h

n bahwa asisi menjadktivitas ant

di hari ke-8 aperoksida danmenggunakanperbedaan koan perbedaan dengan men

apat diketahua MDA makat yang diguna

Kurva kadar M

Antioksidasi EMera

atu produk dadalah senyaw

sumsikan di hang diinkubaMDA sehinggdan dilakukan

imum asam ma bila dibandmetode yan

i Tiosianat) dadasar metode

kadar sterbentuk

um (Chen et adiena terkodari ikatan

ntuk di asam aan ulang di

maksimum sFTC) dan

jadi di harhari berikutnysam linoleat

di MDA stioksidasinya atau dua hari n diena terkon metode TBAmponen yanglama waktu in

ngukur MDAui secara tepaksimum dan akan.

MDA terhadap

Ekstrak Daunah

ari autooksidawa malondia

hari ke-9 si telah

ga untuk n di hari

linoleat dingkan ng lain an diena e FTC senyawa

hingga al 1996), onjugasi

diena linoleat

i ikatan

senyawa ikatan

ri ke-6 ya dapat t telah ehingga

dapat setelah

onjugasi A. Oleh g diukur nkubasi.

A secara at waktu kualitas

p waktu

n Sirih

asi asam aldehida

j

(MDA) yangberkarbon tigdicegah apabdihambat. menghambat tersebut densenyawa assenyawa antimerah (flavodalam larutandengan mudlinoleat radikMDA tidak jumlah yangasam linolesenyawa antio

Secara mdibagi menantioksidan preaksi berantpreventif bkecepatan Contohnya sebagai antdismutase (SSenyawa antiberfungsi unreaksi. Contofenol. Salah golongan feflavonoid yakuat memmemodifikasitelah diindumampu berindwi lapis (flavonoid, alkaloid) mantioksidan Rajendran, dmenyatakan intybus L., dmemiliki sememiliki akti

Inkubasi d(berdasarkan setelah itu spektrofotom532 nm dengKurva standa1,1,3,3-tetramberbagai konyang didapat dengan nilaimenggunakansebagai pembaktivitas anmerah. Pem

g merupakan ga. Keberadabila reaksi oks

Senyawa aproses o

ngan melengam linoleat ioksidan dari onoid, alkalon inkubasi a

dah melengkakal. Oleh katerbentuk ata

g kecil karenat terhambaoksidan. mekanisme, njadi dua preventif dan atai (Murray 2berfungsi u

dimulainya enzim-enzim

tioksidan seSOD) dan gluioksidan pemuntuk memutuohnya adalah

satu senyawfenol dari ang memilikimiliki kemi ikatan lem

uksi menjadinteraksi dan (Saija A et berberine (

memiliki kem(Shirwaik

dan Punitha 2Allium sativ

dan Terminalenyawa bioaivitas antioksidalam percoba

waktu inkadar MDA

meter dengan pgan warna laar yang digunmetoksipropannsentrasi. Pers

adalah y = 0 R2 = 99,6n alfa tokobanding (konttioksidasi ek

milihan vita

senyawa alan MDA ini sidasi asam liantioksidan oksidasi begkapi elektro

radikal. Aekstrak daun

oid, dan tanasam linoleat api elektron arena itu, seau terbentuk na proses okat dengan a

antioksidan kelompok,

antioksidan pe2003). Antio

untuk mengreaksi ra

m yang bereperti superutation perok

mutus reaksi beuskan perbanh senyawa-sewa yang tertumbuhan

i efek antiokmampuan

mak membrani radikal, bmempenetrasal 1995).

(senyawa tumampuan s

kar, Shirw2006). Aqil

vum L., Cichlia bellerica aktif tanin dasi. aan dilakukan

nkubasi optiA diukur dpanjang gelom

arutan merah nakan adalah lna (TMP) dsamaan garis 0.03675x - 0.1%. Percobaferol (vitamtrol positif) akstrak daun amin E s

7

dehida dapat

inoleat dapat

erlanjut on ke Adanya n sirih in) di dapat asam

enyawa dalam

ksidasi adanya

dapat yaitu

emutus ksidan

gurangi adikal. rfungsi roksida sidase. erantai nyakan enyawa rmasuk adalah ksidasi untuk

n yang bahkan i lipid Selain

urunan ebagai

waikar, (2006) horium Roxb. yang

n 9 hari mum),

dengan mbang muda.

larutan dengan

linear .00296 an ini

min E) analisis

sirih ebagai

8

pembanding karena vitamin ini banyak digunakan sebagai antioksidan alami dan larut dalam lemak.

Konsentrasi yang digunakan untuk vitamin E adalah 200 ppm karena konsentrasi tersebut merupakan batas maksimum antioksidan yang diperbolehkan dalam makanan (Hernani dan Rahardjo 2005). Konsentrasi ekstrak daun sirih merah yang digunakan adalah 2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan. Pemilihan konsentrasi ini berkaitan aktivitas air rebusan daun sirih merah sebagai antihiperglikemia, hepatoprotektor, dan dapat memperbaiki sel pankreas dengan dosis 20 g/kg bobot badan. Nilai pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 532 nm berbanding lurus dengan jumlah MDA yang terbentuk dan berbanding terbalik dengan konsentrasi ekstrak.

Hasil percobaan menunjukkan setiap konsentrasi ekstrak daun sirih merah (2-200 mg rebusan/10 mL larutan) memiliki aktivitas antioksidasi dan aktivitas tersebut sebanding dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak daun sirih merah (Gambar 6). Persentase inhibisi (54.51-81.78 %) menunjukkan berbanding lurus dengan konsentrasi ekstrak (Tabel 1). Pada konsentrasi 200 mg rebusan/10 mL larutan, pembentukkan MDA dihambat 81.78 %. Hasil ini didukung oleh analisis statistik yang menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih merah berbeda nyata dengan kontrol negatif. Konsentrasi ekstrak daun sirih merah 2, 10, dan 20 mg rebusan/10 mL larutan aktivitas antioksidasinya tidak berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E, sedangkan konsentrasi ekstrak daun sirih merah 100 dan 200 mg rebusan/10 mL larutan berbeda nyata (α = 0.05) dengan vitamin E sehingga aktivitas antioksidasinya lebih baik.

Selain dengan vitamin E, aktivitas antioksidasi ekstrak daun sirih merah ini dapat dibandingkan dengan tumbuhan lainnya yang memiliki aktivitas antioksidasi, contohnya dengan mengkudu dan Physalis peruviana. Kemampuan antioksidasi ekstrak daun sirih merah dengan pelarut air ini lebih baik karena di setiap konsentrasinya tidak menunjukkan efek prooksidan bila dibandingkan dengan buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) yang diekstrak dengan pelarut metanol (Zin et al. 2001). Namun aktivitas antioksidasinya lebih rendah bila dibandingkan dengan ekstrak etanol 95 % Physalis peruviana konsentrasi 100 µg/mL (100 ppm) yang sudah memiliki daya hambat pembentukkan lipid peroksida sebesar 82.3 % (Wu et al 2005) karena ekstrak daun sirih merah mencapai daya hambat 81.78 % di konsentrasi 200 mg rebusan/10 mL larutan. Tabel 1 Persentase inhibisi ekstrak daun sirih merah

Perlakuan % Inhibisi Kontrol negatif 0 (d) Kontrol positif 54.51 (c)

2 mg rebusan/10 mL larutan 60.47 (bc) 10 mg rebusan/10 mL larutan 67.52 (abc) 20 mg rebusan/10 mL larutan 73.26 (abc) 100 mg rebusan/10 mL larutan 79.43 (ab) 200 mg rebusan/10 mL larutan 81.78 (a)

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstrak daun sirih merah berpotensi sebagai antioksidan secara in vitro pada konsentrasi 200, 1000, 2000, 10000, 20000 ppm. Konsentrasi ekstrak daun sirih merah 200, 1000, dan 2000 ppm memiliki aktivitas yang sama dengan vitamin E 200 ppm, sedangkan ekstrak daun sirih merah 10000 dan 20000 ppm aktivitasnya lebih baik dari vitamin E.

Saran

Perlu diketahui aktivitas antioksidasi daun sirih merah dengan menggunakan pelarut selain air dan penelitian antioksidasi secara in vivo. Selain itu, perlu diteliti senyawa bioaktif dari daun sirih merah yang berperan sebagai antioksidan.

Gambar 6 Kadar MDA ekstrakdaun sirih merah

7.536 (d)

3.428 (c)2.979 (bc)

2.448 (abc)2.015 (abc)

1.55 (ab)1.373 (a)

0

2

4

6

8

k - k + 2 10 20 100 200konsentrasi ekstrak (mg rebusan/10 mL larutan)

kada

r MD

A (μ

M)

9

DAFTAR PUSTAKA

Adawiyah DR, Sarastani D, Fardiaz D. 2001. Kajian aktivitas antioksidan biji buah atung (Parinarium glaberimum Hassk.). Laporan akhir penelitian. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Aqil F, Ahmad I, Mehmood Z. 2006. Antioxidant and free radical scavenging properties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J Biol 30:177-183.

Avellini L, Chiaradia E, Gaiti A. 1999. Effect of exercise training, selenium and vitamin E on some free radical scavengers in horses (Equus caballus). Comparative Biochemistry and Physiology Part B 123: 147-154.

Chen HM, Muramoto K, Yamaguchi F, Nokihara K. 1996. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of soybean protein. J Agric Food Chem 44:2619-2623

Duarte J et.al. 2001. Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin in spontaneously hypertensive rats. British Journal of Pharmacology 133:117-124.

Duryatmo S. 2005. Dulu hiasan kini obat. Trubus. 427:37.

Duryatmo S. 2006. Wajah ganda sirih merah. Trubus. 434:92-93.

Gitawati R. 1995. Radikal Bebas, Sifat dan Peran dalam Menimbulkan Kerusakan atau Kematian Sel. Cermin Dunia Kedokteran 102:33-36.

Hans, Heldt W. 2005. Plant Biochemistry Third Edition. San Diego: Elsevier Academic Press.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Jilid 2. Iwang S, penerjemah. Bandung: ITB Press. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.

Hart H. 1983. Kimia Organik Suatu Kuliah Singkat.. Edisi 11. Achmadi S, Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry.

Hernani, Rahardjo M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya.

Jurkiewicz BA, Bissett DL, Buettner GR. 1995. Effect of topically applied tocopherol on ultraviolet radiation-mediated free radical damage in skin. Journal Invest Dermatol 104:484-488.

Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant effect of some ginger constituents. Journal of Food Science 58(6):1407-1410.

Linder MC. 2006. Biokimia Nutrisi dan Metabolisme dengan Pemakaian Secara Klinis. Aminuddin Parakkasi, Penerjemah; Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Nutritional Biochemistry and Metabolism.

Martsolich KA. 2007. Potensi antioksidasi ekstrak air dan ekstrak etanol 70 % daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper Edisi 25. Hartono, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s Biochemistry.

Nakayama S, Katoh EM, Tsuzuki T, Kobayashi S. 2003. Protective effect α-tocopherol-6-O-phosphate against ultraviolet B-induced damage in cultured mouse skin. The Journal Investigative Dermatology 121:406-411.

Permata DA. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) terhadap perbaikan pankreas tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Safithri M, Fahma F. 2005. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) Sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur sprague dawley. Laporan penelitian. Bogor: LPPM IPB.

Saija A et al. 1995. Flavonoids as antioxidant agents: importance of their interaction with biomembranes. Free Radic Biol Med. 19:481-486.

Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus putih galur Sprague-Dawley. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Schultz HW, editor. 1962. Symposium on Food: Lipid and Their Oxidation. Di

10

dalam: Sofianti D. Potensi antioksidasi daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.). [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Shirwaikar A, Shirwaikar A, Rajendran K, Punitha SIR. 2006. In vitro antioxidant studies on the benzyl tetra isoquinoline alkaloid berberine. Biol. Pharm. Bull. 29(9):1906-1910.

Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Jakarta: Agromedia Pustaka.

Suryawanshi NP, Bhutey AK, Nagdeote AN, Jadhav AA, Manoorkar GS. 2006. Study of lipid peroxide and lipid profile in diabetes mellitus. Indian Journal of Clinical Biochemistry 21(1):126-130.

Windyagiri A. 2006. Potensi hepatoprotektor air rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) pada tikus putih hiperglikemia. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Wu JS et al. 2005. Antioxidant activities of Physalis peruviana. Biol. Pharm. Bull. 28(6):963-966.

Zin MZ, Hamid AA, Osman A. 2002. Antioxidative activity of extracts from mengkudu (Morinda citrifolia L.) root, fruit, and leaf. Food Chemistry 78:227-231.

1

LAMPIRAN

12

Lampiran 1 Tahapan umum penelitian

Lampiran 2 Ekstraksi daun sirih merah

direbus

Lampiran 3 Bobot jenis larutan ekstrak sirih merah

Bj terkoreksi = Bj terbaca ± faktor terkoreksi

Faktor koreksi = T1 – T2 x 10-3 (T1>T2) 3

Keterangan: - Bj terbaca ditambah faktor terkoreksi (Tcairan>Talat) - Bj terbaca dikurang faktor terkoreksi (Tcairan<Talat)

Daun sirih merah

Ekstrak daun sirih merah (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan)

Analisis aktivitas antioksidasi metode

TBA

Analisis Statistika

Penentuan inkubasi optimum asam linoleat

(metode TBA)

Penentuan bobot jenis ekstrak

daun sirih merah

10 gram daun sirih merah ditambah akuades

50 mL

volume akhir 5 mL

konsentrasi perlakuan (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan)

13

Lampiran 4 Pembuatan kurva standar TMP

1 μM 5 μM 10 μM 20 μM 30 μM 40 μM 50 μM

2 ml TCA 20%

2 ml TBA 1 % dalam asam asetat 50 %

Inkubasi 100 °C selama 10 menit, dinginkan, sentrifus 3000 rpm selama 15 menit

Lampiran 5 Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat

6 ml asam linoleat dalam etanol 99,8 % 6 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7 3 mL akuades

Campuran dipipet ke dalam botol gelap (terdapat 11 botol dan 1 mL campuran untuk setiap botol), dinkubasi 40 °C

1 mL diambil setiap 24 jam

2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 % 2 mL TCA 20 %

Larutan diinkubasi 100 °C, dinginkan

Sentrifus 3000 rpm 15 menit

diukur serapannya pada λ 532 nm

1,1,3,3-tetrametoksipropana (TMP) 6 M

Masing-masing diambil 1 mL

Larutan

diukur serapannya pada λ 532 nm

14

Lampiran 6 Analisis aktivitas antioksidasi

2 mL buffer fosfat 0.1 M pH 7 2 mL asam linoleat 50 mM

1 mL akuades

Lama inkubasi optimum hasil pengukuran

2 ml TCA 20% 2 ml TBA 1 % dalam asam asetat 50 %

Inkubasi 100 °C selama 10 menit, dinginkan, sentrifus 3000 rpm selama 15 menit

Lampiran 7 Perhitungan bobot jenis

Suhu cairan: 29 °C

Suhu alat: 20 °C

Faktor koreksi: 29-20 x 10-3 = 0.003 3 Bj terbaca di urinometer: 1.018

Bj terkoreksi = 1.018 + 0.003 = 1.021 g/mL Lampiran 8 Perhitungan pembuatan konsentrasi

Volume yang dibutuhkan dari larutan ekstrak daun sirih merah untuk membuat konsentrasi 2 mg rebusan/10 mL larutan: 1.021 g = 2 x 10-3 g 1 mL a

a = 0.00196 mL = 1.96 µL

Rebusan daun sirih merah (2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan),

vitamin E 200 ppm, dan akuades

Inkubasi 40 °C.

Larutan

diukur serapannya pada λ 532 nm

Masing-masing diambil 1 mL

2 mL TBA 1 % dalam asetat 50 % 2 mL TCA 20 %

Lampiran

Absorbans

Konsentra

0

1

5

10

20

30

40

50

Lampiran

Nilai abso

Hari S

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Contoh pe

Hari ke-9

9 Hasil ab

si larutan st

asi (µM)

0

5

0

0

0

0

0

10 Hasil ab

orbansi MDA

Serapan1

0.042

0.055

0.058

0.100

0.115

0.923

0.872

1.103

1.346

1.470

1.453

erhitungan:

(Serapan1)

sorban larut

tandar TMP

Serapan

0

0.102

0.213

0.348

0.609

1.059

1.489

1.889

bsorban wa

A pada λ 53

Serapan2

0.040

0.058

0.059

0.120

0.138

0.756

0.542

0.953

0.723

1.480

1.532

y = -0.

1.470 = -0.0

x = 40.

tan standar

P

aktu inkubas

32 nm

[MDA]1 (

1.223

1.557

1.659

2.802

3.210

25.196

23.808

30.094

36.706

40.081

39.618

00296 + 0.0

00296 + 0.0

.081

dan kurva s

si optimum

µM) [MD

6

8

4

6

1

8 4

03675x

03675x

Ku

standar

asam linole

DA]2 (µM)

1.169

1.659

1.686

3.346

3.836

20.652

14.829

26.013

19.754

40.353

41.768

urva standa

eat

Rerata [M

1.196

1.618

1.673

3.074

3.523

22.924

19.319

28.052

28.230

40.217

40.693

ar TMP

15

MDA] ± SD

± 0.038

± 0.072

± 0.019

± 0.385

± 0.443

4 ± 3.213

9 ± 6.349

2 ± 2.886

± 11.984

7 ± 0.192

3 ± 1.520

D

16

Lampiran 11 Konsentrasi MDA dan daya hambat ekstrak daun sirih merah Sampel A1 hari

ke-9

A2 hari

ke-9

Rerata A [MDA]

(µM)

Rerata

[MDA]

SD %

inhibisi

K - (1) 0.389 0.114 0.251 6.910

K - (2) 0.389 0.204 0.297 8.162 7.536 0.885 0.00

K + (1) 0.101 0.104 0.103 2.883

K + (2) 0.147 0.139 0.143 3.972 3.428 0.770 54.51

E1 (1) 0.091 0.089 0.090 2.530

E1 (2) 0.124 0.122 0.123 3.427 2.979 0.634 60.47

E2 (1) 0.067 0.072 0.070 1.985

E2 (2) 0.109 0.099 0.104 2.910 2.448 0.654 67.52

E3 (1) 0.052 0.055 0.052 1.500

E3 (2) 0.086 0.093 0.090 2.530 2.015 0.728 73.26

E4 (1) 0.048 0.049 0.049 1.414

E4 (2) 0.058 0.060 0.059 1.686 1.550 0.192 79.43

E5 (1) 0.045 0.048 0.047 1.359

E5 (2) 0.050 0.045 0.048 1.387 1.373 0.020 81.78

keterangan: (K) kontrol, (E) ekstrak, (E1) 2 mg rebusan/10 mL larutan, (E2) 10 mg rebusan/10 mL larutan, (E3) 20 mg rebusan/10 mL larutan, (E4) 100 mg rebusan/10 mL larutan, (E5) 200 mg rebusan/10 mL larutan

Contoh perhitungan:

Kadar MDA (kontrol positif 1) y = -0.00296 + 0.03675x

0.103 = -0.00296 + 0.03675x x = 2.883 % inhibisi (kontrol positif 1): (rerata kontrol negatif – rerata sampel) x 100 %

rerata kontrol negatif (7.536-3.428) x 100 % = 54.512 %

7.536

17

Lampiran 12 Analisis statistik waktu inkubasi optimum dan aktivitas antioksidasi Waktu inkubasi optimum ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 4969.782 10 496.978 26.622 .000 Within Groups 205.345 11 18.668

Total 5175.127 21

Duncan N Subset for

alpha = .05

Hari 1 2 3 0 2 1.1960 1 2 1.6180 2 2 1.6725 3 2 3.0740 4 2 3.5230 6 2 19.3185 5 2 22.9240 7 2 28.0535 8 2 28.2300 9 2 40.2170

10 2 40.6930 Sig. .630 .081 .914

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.

Aktivitas antioksidasi ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 53.537 6 8.923 22.511 .000

Within Groups 2.775 7 .396

Total 56.311 13

Duncan

N Subset for alpha = 0.05 Perlakuan 1 2 3 4

200 mg rebusan/10 mL larutan 2 1.3730 100 mg rebusan/10 mL larutan 2 1.5500 1.5500 20 mg rebusan/10 mL larutan 2 2.0150 2.0150 2.0150 10 mg rebusan/10 mL larutan 2 2.4475 2.4475 2.4475 2 mg rebusan/10 mL larutan 2 2.9785 2.9785

Kontrol positif 2 3.4275 Kontrol negatif 2 7.5360

Sig. .151 .070 .072 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.

18

Lampiran 13 Hasil-hasil inkubasi optimum asam linoleat, aktivitas antioksidan, dan kurva standar

Larutan standar TMP Inkubasi optimum hari ke-9 (dari kiri ke kanan: 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0 µM)

Aktivitas antioksidan

(dari kiri ke kanan: K-, K+, 2, 10, 20, 100, 200 mg rebusan/10 mL larutan)