repository.usu.ac.id › bitstream › handle › 123456789 › 52059... bab 2 tinjauan pustaka 2.1...

37
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Struktur dan Sifat - Sifat Vitamin C Vitamin C (http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C ) Vitamin C atau asam askorbat mempunyai berat molekul 176,13 dengan rumus molekul C 6 H 8 O 6 Pada pH rendah vitamin C lebih stabil daripada pH tinggi. Vitamin C mudah teroksidasi, lebih-lebih apabila terdapat katalisator Fe, Cu, enzim Askorbat oksidase, sinar, temperatur yang tinggi. Larutan encer vitamin C pada pH kurang dari 7,5 masih stabil apabila tidak ada katalisator seperti di atas. Oksidasi vitamin C akan terbentuk asam dihidroaskorbat. Vitamin C dengan iodin akan membentuk ikatan dengan atom C normor 2 dan 3 sehingga ikatan rangkap hilang (Sudarmadji, 1989). . Dalam bentuk kristal tidak berwarna, titik cair 190-192°C. Bersifat larut dalam air sedikit larut dalam aseton atau alkohol yang mempunyai berat molekul rendah. Vitamin C sukar larut dalam kloroform, eter dan benzen. Dengan logam membentuk garam. Sifat asam ditentukan dengan ionisasi enol grup pada atom C nomor tiga. Vitamin C merupakan senyawa turunan gula yang sangat penting. Banyak dijumpai dalam berbagai tanaman seperti sitrus, Hungarian Paprika, Green Wallnuts serta beberapa jaringan hewan. Vitamin C diperlukan di dalam diet (diet essensial) untuk mencegah penyakit scurvy sehingga biasa juga disebut vitamin anti skorbut. Universitas Sumatera Utara

Upload: others

Post on 26-Feb-2020

9 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Struktur dan Sifat - Sifat Vitamin C

Vitamin C (http://en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C)

Vitamin C atau asam askorbat mempunyai berat molekul 176,13 dengan rumus

molekul C6H8O6

Pada pH rendah vitamin C lebih stabil daripada pH tinggi. Vitamin C mudah

teroksidasi, lebih-lebih apabila terdapat katalisator Fe, Cu, enzim Askorbat oksidase,

sinar, temperatur yang tinggi. Larutan encer vitamin C pada pH kurang dari 7,5 masih

stabil apabila tidak ada katalisator seperti di atas. Oksidasi vitamin C akan terbentuk

asam dihidroaskorbat. Vitamin C dengan iodin akan membentuk ikatan dengan atom C

normor 2 dan 3 sehingga ikatan rangkap hilang (Sudarmadji, 1989).

. Dalam bentuk kristal tidak berwarna, titik cair 190-192°C. Bersifat

larut dalam air sedikit larut dalam aseton atau alkohol yang mempunyai berat molekul

rendah. Vitamin C sukar larut dalam kloroform, eter dan benzen. Dengan logam

membentuk garam. Sifat asam ditentukan dengan ionisasi enol grup pada atom C

nomor tiga.

Vitamin C merupakan senyawa turunan gula yang sangat penting. Banyak

dijumpai dalam berbagai tanaman seperti sitrus, Hungarian Paprika, Green Wallnuts

serta beberapa jaringan hewan. Vitamin C diperlukan di dalam diet (diet essensial)

untuk mencegah penyakit scurvy sehingga biasa juga disebut vitamin anti skorbut.

Universitas Sumatera Utara

Struktur asam askorbat pertama sekali dikemukakan oleh Haworth. Asam

askorbat disintesa secara komersial dengan bantuan bakteri berlangsung sebagai

berikut :

red oks

Acetobacter

red oks

D-glukosa D-sorbitol L-sorbosa Vitamin C

Acetobacter

Vitamin C merupakan asam kuat dengan nilai pKa 4,21 dalam bentuk kristal,

cukup stabil tetapi sangat mudah teroksidasi bila dalam bentuk larutan dan di udara

terbuka. Tes iodin dan 2,6-dichlorophenolindophenol adalah merupakan tes kuantitatif

yang spesifik untuk menentukan konsentrasi asam askorbat (West, 1966).

Asam askorbat (vitamin C) adalah suatu zat organik yang merupakan ko-enzim

atau ko-faktor pada berbagai reaksi biokimia di dalam tubuh. Salah satu peran utama

asam askorbat adalah proses hidroksilasi prolin dan lisin pada pembentukan kolagen.

Kolagen adalah komponen penting jaringan ikat, oleh sebab itu vitamin C

penting untuk kelangsungan hidup jaringan ikat. Dengan demikian vitamin C berperan

penting pada proses penyembuhan luka, adaptasi tubuh terhadap trauma dan infeksi.

Vitamin C ini harus tersedia secara kontinu dalam makanan sehari-hari agar tidak

sampai timbul gejala defisiensi. Khususnya pada manusia (juga pada binatang jenis

primata lainnya, dan pada marmut), vitamin C ini tidak dapat dibuat sendiri di dalam

Universitas Sumatera Utara

tubuh. Defisiensi vitamin C ini disebut sebagai skorbut. Kebutuhan yang dianjurkan

untuk orang dewasa di Indonesia adalah 30 mg/hari. Vitamin C adalah sebuah reduktor,

di mana sangat berperan pada proses respirasi jaringan.

Vitamin C akan diekskresikan bila berlebihan, tetapi apabila hal ini berjalan terus,

khususnya pada pemberian vitamin C dosis tinggi secara intravena dapat meningkatkan

kadar keasaman darah. Ekskresi vitamin C melalui urine yang berlebihan akan

meningkatkan kadar keasaman urine, ini mungkin tidak mengganggu, tetapi dalam

keadaan tertentu, penurunan pH darah, tidak diharapkan.

Pada binatang tertentu, vitamin C ini dapat langsung diubah menjadi CO2 dan

H2

Telah diketahui bahwa manusia dan marmut tak mempunyai enzim gulonalakton

oksidase, yang mengoksidasi 1-gulonalakton menjadi 2-keto-1-gulonalakton. Evolusi

ini terjadi 25 sampai 60 juta tahun yang menyebabkan hilangnya kemampuan manusia

dan kelompok hewan tersebut di atas untuk mensintesis vitamin C sendiri. Apakah

rekayasa genetika dapat memperbaiki ketidakmampuan tersebut di masa mendatang

sehingga dapat memasukkan kembali enzim tersebut dalam sel manusia

(Goodman,1996).

O, sehingga kelebihan vitamin C ini tidak akan menimbulkan masalah. Dilihat dari

sudut gizi, pemasukan vitamin C itu harus disesuaikan dengan pemasukan zat-zat gizi

lainnya (baik dalam jumlah maupun proporsinya) agar kesehatan dapat terbina

(Tjokronegoro, 1985).

Sudah sejak dahulu kala orang telah mengenal penyakit skorbut (Scurvy).

Gejala-gejala penyakit yang kemudian dikenal sebagai gejala defisiensi vitamin C

(asam askorbat) ini, sudah dilaporkan sejak zaman Mesir kuno, Yunani kuno dan

zaman Romawi. Gejala-gejala penyakit tadi terutama timbul pada mereka yang sedang

melakukan pelayaran jarak jauh, atau mereka yang sedang melakukan ekspedisi-

ekspedisi militer yang lama.

Universitas Sumatera Utara

Pengobatan dan pencegahan penyakit ini baru tampak setelah James Lind,

seorang tabib Inggris pada pertengahan abad 18, memberikan jeruk segar pada

penderita-penderita penyakit skorbut ini.

Kini vitamin C sudah sangat dikenal masyarakat luas, sebagai vitamin populer

yang selalu dikaitkan dengan faktor-faktor kesehatan, dan kesegaran jasmani seseorang.

Umumnya pada binatang, gejala defisiensi vitamin C ini sukar sekali terjadi,

karena vitamin C ini dapat disintesa sendiri di dalam tubuh mereka. Tetapi pada

manusia, marmut, primata, jenis kelelawar dan jenis burung tertentu tidak dapat

membuat vitamin C sendiri. Oleh karena itu manusia harus mendapat vitamin C dalam

makanan sehari-hari.

Jumlah masukan vitamin C yang diperlukan pada orang dewasa agar jangan

sampai terjadi gejala defisiensi adalah 10 mg/hari. Sedangkan di Indonesia, kebutuhan

yang dianjurkan adalah 30 mg/hari.

Apabila dosis vitamin C yang diberikan berlebihan, maka vitamin C yang

berlebih ini akan diekskresikan melalui urine. Sebagian dari vitamin C tadi akan

diubah menjadi garam-garam oksalat, dan pada keadaan fisiologis, kira-kira 40-50 mg

garam oksalat yang diekskresikan berasal dari vitamin C, yakni kira-kira setengah dari

seluruh ekskresi oksalat.

Apabila dosis vitamin terus ditinggikan maka proporsi vitamin C yang diubah

menjadi oksalat ternyata akan menurun. Tetapi apabila orang tersebut memang

menderita gangguan metabolisme oksalat, hal ini dapat menimbulkan masalah.

Kelebihan vitamin C juga dapat menaikkan kadar keasaman darah khususnya

yang mendapat vitamin C dosis tinggi secara intravena. Pada keadaan tertentu,

penurunan pH darah tidak diharapkan. Kelebihan vitamin C akan meningkatkan

keasaman urine. Pada keadaan tertentu (gangguan metabolisme urat dan/atau oksalat

dan lain-lain) dapat meningkatkan kemungkinan terjadinya batu saluran kemih.

Defisiensi vitamin C menimbulkan penyakit skorbut. Gejala-gejala klinik antara

lain : nyeri pada tungkai, pseudoparalysis, pembengkakan pada tungkai, fraktur pada

Universitas Sumatera Utara

daerah epiphisis, pendarahan dan pembengkakan gusi dan lain-lain. Penderita dengan

gejala-gejala skorbut yang jelas kini sudah jarang dijumpai. Apabila pengobatan

terlambat dilakukan, skorbut ini dapat menimbulkan kematian.

Sumber vitamin C dapat kita jumpai pada sayuran dan buah-buahan segar. Atau

dapat pula dengan tablet-tablet vitamin C yang sekarang banyak dipasarkan. Perubahan

primer yang terjadi pada skorbut disebabkan karena fungsi vitamin C ialah dalam hal

pembentukan dan mempertahankan bahan interseluler dan kolagen.

Pada defisiensi vitamin C kolagen menghilang, pendarahan timbul karena

kerusakan bahan semen dan kapiler. Gejala utama penyakit skorbut timbul akibat

kelainan tulang dan pembuluh darah. Terjadi pendarahan subperiosteal, resorpsi dentin

dan degenerasi odon-toblast.

Fragilitas dinding kapiler meningkat dan terjadi pendarahan pada trauma,

misalnya pada kulit, otot tulang, gusi. Gejala ini sulit dikenal bila defisiensi hanya

marginal, sehingga perlu diketahui tanda-tandanya, sehingga dapat diambil tindakan

yang efisien. Tanda marginal defisiensi nutrien dibagi beberapa tahap, yaitu :

1. Tahap permulaan : penurunan cadangan nutrien dalam jaringan karena

penurunan masukan, penyerapan dan metabolisme yang abnormal. Juga terjadi

penurunan ekskresi nutrien tersebut.

2. Tahap biokimia : penurunan aktivitas enzim, perubahan metabolisme dan tak

terlihat ekskresi urin.

3. Tahap fisiologik : kehilangan nafsu makan, penurunan berat badan, tak dapat

tidur, mudah marah. Metabolisme obat terganggu.

4. Tahap klinik : terlihat tanda-tanda klinik defisiensi.

5. Tahap morfologik : perubahan bentuk jaringan yang dapat menimbulkan

kematian, kecuali diobati dengan nutrien tersebut.

Koreksi pada tahap dini tentu lebih menguntungkan dibanding pengobatan pada tahap

yang sudah lanjut (Tjokronegoro, 1985).

Universitas Sumatera Utara

2.2 Sorbitol, Struktur dan Sifat-Sifatnya

Glukosa mempunyai 6 jumlah rantai atom C, 4 diantaranya merupakan atom C

asimetris sehingga banyak isomer yang dapat digambarkan dari molekul glukosa

tersebut. Salah satu isomer yang penting adalah isomer D-sorbitol karena merupakan

prekursor di dalam fermentasi vitamin C oleh Acetobacter xylinum.

Konversi struktur D-sorbitol ke dalam bentuk L-sorbosa sangatlah penting

karena L-sorbosa merupakan prekursor dari sintetis L-asam askorbat dengan

menggunakan larutan sorbitol 15% setelah difermentasi selama 24 jam oleh bakteri

Acetobacter suboxydans akan dihasilkan 93% L-sorbosa melalui reaksi di bawah ini :

CH2OH CH2

H – C – OH oksigen H – C – OH

OH

HO – C – H HO – C – H

H - C - OH dehidrogenase H – C – OH

H - C - OH - H2

CH

O C = O

2OH CH2

D-sorbitol L-sorbosa

OH

Pada tahap awal fermentasi, senyawa D-sorbitol akan berubah menjadi bentuk L-

sorbosa dengan adanya enzim yang dihasilkan oleh bakteri. Perubahan bentuk D-

sorbitol menjadi bentuk L-sorbosa dapat diuji dengan alat polarimeter yaitu dari

putaran sudut polarisasi dari kanan [D(+)] ke kiri [L(-)].

Gugus alkohol dari senyawa-senyawa gula dapat dioksidasi menjadi bentuk

ketosa oleh beberapa jenis bakteri dengan adanya oksigen. Sebagai contoh, D-sorbitol

dioksidasi oleh bakteri Acetobacter suboxydans sebagai berikut :

D-sorbitol + O2 → L-sorbosa + H2

L-sorbosa difermentasi lebih lanjut menjadi asam askorbat (West, 1966).

O

Universitas Sumatera Utara

2.3 Sorbosa

L-sorbosa adalah zat antara dalam produksi industri vitamin C dan L-sorbosa oleh

enzim invertase yang dihasilkan oleh mikroba maka terjadi inversi D-sorbitol menjadi

L-sorbosa yang merupakan prekursor di dalam biosintesis vitamin C. Sejak ditemukan

reaksi inversi ini maka industri pembentukan L-sorbosa (prekursor dalam biosintesis

vitamin C) berkembang pesat guna memenuhi bahan baku industri vitamin C. Produksi

sorbosa ditunjukkan dengan menggunakan inhibisi substrat dan produk secara

bersamaan. Angka oksidasi menurun secara drastis dengan penambahan konsentrasi

awal sorbitol dalam bioreaktor batch (Giridhar, 2000).

2.4 Fermentasi Vitamin C

Metode untuk mendapatkan vitamin C secara sintesis dengan urutan langkah yang

diperlukan dengan bantuan mikroba. Perkembangan vitamin C dianggap penting sekali.

Isolasi kristalin asam askorbat pada tahun 1928 dilakukan oleh Szent-Gyorgyi yang

dilanjutkan dengan identifikasi vitamin C oleh Waugh dan King serta Svirbely dan

Szent-Gyorgyi pada tahun 1932.

Vitamin C pertama kali diperoleh secara sintetis. Berbagai jenis sintetis vitamin

C diklasifikasikan menjadi empat metoda yang terpenting.

Metoda pertama dimana secara industri meliputi konversi D-glukosa menjadi

asam askorbat atau vitamin C. Langkah dari metoda tersebut meliputi oksidasi

mikrobiologi dari gugus hidroksil kedua 2,3,4,6-diisopropylidene derivative menjadi

gugus karbonil L-ascorbic acid (Vitamin C). Konfigurasi lanjutan yang penting adalah

L-sorbose, suatu senyawa gula yang jarang ditemukan. L-Sorbose dihasilkan dalam

skala besar dari D-glucitol (sorbitol) dengan pertumbuhan Acetobacter suboxydans.

Penggunaan 15% larutan sorbitol, dihasilkan L-sorbose sebesar 93% setelah

difermentasi selama 24 jam dari waktu inokulasi yang ditemukan oleh Wells, Stubbs,

Lockwood, dan Roe.

Universitas Sumatera Utara

Sorbitol ditemukan secara umum dalam skala besar dengan cara hidrogenasi

katalitik dari D-glukosa. Laporan pertama tentang oksidasi D-sorbitol menjadi L-

sorbosa oleh enzim yang dihasilkan oleh bakteri yang ditemukan Bertrand pada tahun

1896. Bakteri tersebut diidentifikasi dengan bakteri Acetobacter xylinum.

D-glucose D-glucitol (D-sorbitol) L-sorbose

2,3,4,6-diisopropylidene derivative

2,3,4,6-diisopropylidene-2-keto-L-gulonic acid

L-ascorbic acid (Vitamin C)

Untuk menyelesaikan sintetis tersebut, L-sorbosa diubah menjadi derivat 2,3,4,6-

diisopropilidena. Gugus hidroksil pertama derivat tersebut dioksidasi oleh ion

permanganat dalam larutan alkali menghasilkan asam 2,3,4,6-diisopropilidena-2-keto-

L-gulonat berdasarkan Reichstein dan Grussner. Asam 2-keto-L-gulonat atau derivat

diisopropilidena diubah menjadi asam L-askorbat dengan bermacam teknik untuk

mendapatkan hasil sempurna (Robinson, 1976).

Pada tahun 1953 dibuat beberapa studi dimana proses fermentasi vitamin C

dengan bantuan mikroorganisme hanya terjadi dalam 2 langkah. Hori dan Nakatani

mengubah glukosa oleh Acetobacter suboxydans menjadi asam 5-keto-D-glukonat,

yang selanjutnya oleh bantuan katalis enzim dirubah menjadi asam L-idonat.

Fermentasi dengan Pseudomonas, Acetobacter, atau Aerobacter inversi senyawa akhir

menjadi asam 2-keto-L-gulonat, yaitu suatu senyawa antara (intermediat) yang lazim

dikenal menjadi asam L-askorbat (Hori, 1953).

Pada tahun 1990, Boudrant menyatakan bahwa dengan menggunakan metode

Reichstein dan glukosa sebagai substrat, pembentukan asam askorbat dengan metode

Universitas Sumatera Utara

fermentasi hanya berlangsung dengan 5 tahap reaksi sebagai berikut : reduksi glukosa

menjadi sorbitol dengan menggunakan katalis nikel; oksidasi L-sorbitol menjadi L-

sorbosa; hasil diaseton sorbosa atau 2,3:4,6-diisopropilidena-L-xylo-2-heksofuranosa

setelah perlakuan dengan aseton dan asam sulfat; oksidasi 2,3,4,6-diisopropilidena-L-

xylo-2-heksofuranosa menjadi asam 2-keto-L-gulonat dengan menggunakan katalis

platinium; enolisasi dan laktonisasi internal asam 2-keto-L-gulonat menjadi asam L-

askorbat.

Asam L-askorbat seperti jalur di bawah ini :

(Boudrant, 1990).

Universitas Sumatera Utara

Pada zaman sekarang, ditemukan ada enam proses fermentasi bakteri untuk

menghasilkan vitamin C. Semua proses tersebut memperlihatkan prekursor langsung

dari asam L-askorbat, asam 2-keto-L-gulonat, dimana dinamakan asam 2-keto-L-

idonat. Perbedaan keenam jalur ini ditandai dari senyawa intermediat yang terbentuk

selama proses fermentasi.

Keenam jalur tersebut dapat dilihat sebagai berikut :

1. Jalur Sorbitol

2. Jalur asam L-idonat

3. Jalur asam L-gulonat

4. Jalur asam 2-keto-D-glukonat

5. Jalur asam 2,5-diketo-D-glukonat

6. Jalur asam 2-keto-L-gulonat

Universitas Sumatera Utara

Diagram jalur biosintesis vitamin C oleh berbagai jenis mikroorganisme :

(Boudrant, 1990).

1. Jalur Sorbitol

Biosintesis ini dinyatakan pertama kali oleh Motizuki. Sorbitol ditransformasikan

dengan cara fermentasi menjadi asam 2-keto-L-gulonat. Transformasi diperoleh dari

beberapa genus Pseudomonas dan Acetobacter, tetapi jenis metabolisme ini belum

dikenal secara umum.

Hasil transformasi dari sorbitol menjadi asam 2-keto-gulonat tidak melampaui

10%, walaupun hasil 70% dicatat dari Acetobacter cerenusote. Selain asam 2-keto-L-

gulonat, produk lain juga terbentuk. Okazaki menyarankan jalur biosintesis sebagai

berikut :

Universitas Sumatera Utara

Sorbitol

L-sorbose

L-idose

L-idonic acid

2-keto-L-gulonic acid

2. Jalur asam L-idonat

Biosintesis menggunakan asam L-idonat sebagai zat antara adalah transformasi

multistep. Metabolisme multistep dikenal adalah asam D-glukonat, asam 5-keto-D-

glukonat, asam L-idonat, dan asam 2-keto-L-idonat.

Oksidasi pertama, transformasi D-glukosa menjadi asam D-glukonat, tidak

dijelaskan secara terperinci.

3. Jalur asam L-gulonat

Jalur asam L-gulonat terdapat pada jalur L-idonat yang meliputi dua langkah

(oksidasi asam D-glukonat dan reduksi asam 5-keto-D-glukonat). Tetapi reaksi ini

berkembang menjadi asam L-gulonat, prekursor asam 2-keto-D-idonat. Oksidasi asam

L-gulonat disampaikan oleh Kita. Menurut Kita, transformasi asam 5-keto-D-glukonat

dapat dihasilkan dengan menggunakan Xanthomonas transluscens, dengan hasil 90%

dan konsentrasi 100 g L-1

, atau Xanthomonas trifolii (Erwinia lahyri).

Universitas Sumatera Utara

4. Jalur asam 2-keto-D-glukonat

Ada tiga langkah pada jalur ini :

1. Oksidasi asam D-glukonat

Kebanyakan akan mentransformasi D-glukosa menjadi asam D-glukonat dengan

menggunakan jalur ini. Transformasi D-glukosa menjadi asam 2,5-diketo-

gulonat yang diidentifikasikan oleh Katznelson dalam Acetobacter melanogenum

dan Pseudomonas albosesamae.

Dikenal bahwa Acetobacter suboxydans, untuk sintesis asam 5-keto-D-glukonat

dari asam D-glukonat, dapat mensintesis asam 2-keto-D-glukonat.

Pada tahun 1982, Sonoyama menjelaskan kemampuan pertama kali Erwinia spp,

untuk akumulasi asam D-glukonat dan asam 2-keto-D-glukonat.

2. Oksidasi asam 2-keto-D-glukonat

Oksidasi ini diselesaikan oleh Bacterium hoshigaki dan Bacterium glucunicum

dengan produk asam 2,5-D-diketo-D-glukonat. Juga dibiosintesis oleh

Acetobacter spp khususnya Acetobacter melanogenum. Ilustrasi biokonversi

glukosa dengan asam D-glukonat dan asam 2-keto-D-glukonat sebagai zat antara.

Proses transformasi langsung D-glukosa menjadi asam 2,5-diketo-D-glukonat

menggunakan Acetobacter fragum atau Acetomonas albosesamae yang

diumumkan secara luas.

3. Reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat

Pada tahun 1975, Sonoyama menjelaskan proses yang menghasilkan asam 2-

keto-D-gulonat dari asam 2,5-diketo-D-glukonat, dapat dilakukan oleh genus

Brevibacterium, Arthrobacter, Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, dan

Bacillus. Dengan Brevibacterium ketosporum, hasilnya mencapai 15% ketika

konsentrasi substrat 50 g L-1. Dengan mikroorganisme lain, hasilnya tidak lebih

dari 1%. Penggunaan Corynebacterium sejak tahun 1976, pertama kali

Universitas Sumatera Utara

menghasilkan hasil produk asam 2-keto-L-gulonat sekitar 10%. Pada masa kini,

diperoleh hasil mendekati 80%. Proses lain juga dijelaskan dengan menggunakan

Citrobacter. Dapat dikatalisis hanya dengan transformasi asam 2,5-diketo-D-

gulonat, dan permulaan digunakan Acetobacter cerenus. Dengan beberapa

mikroorganisme, hasilnya sekitar 30%, dengan konsentrasi substrat 100 g L-1

.

5. Jalur asam 2.5-diketo-D-glukonat

Proses produksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada langkah utama. Genus

Erwinia dijelaskan pada transformasi ini. Dijelaskan bahwa konsentrasi glukosa 200 g

L-1

Proses fermentasi dengan menggunakan Acetobacter cerenus memberikan hasil

sekitar 90%.

dan waktu fermentasi 20 jam yang memberikan hasil sekitar 75%.

6. Jalur asam 2-keto-L-gulonat

Jalur ini rupanya terjadi secara langsung, dan menghasilkan asam 2-keto-L-

gulonat, prekursor langsung asam L-askorbat dari glukosa. Jalur ini kemungkinan

terjadi dengan pengembangan yang baru.

Beberapa diantaranya :

1. Kultur tingkat kedua atau campuran

2. Seleksi mutan

3. Isolasi reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada Corynebacterium

4. Transfer gen reduksi asam 2,5-diketo-D-glukonat pada Corynebacterium dan

Erwinia (Boudrant, 1990).

Hancock menyatakan bahwa dengan menggunakan Saccharomyces cerevisiae

dan substrat L-galaktosa, L-galaktono-1,4-lakton dan L-gulono-1,4-lakton akan

dihasilkan asam askorbat sedangkan bila menggunakan substrat D-glukosa, D-

galaktosa atau D-manosa akan dihasilkan asam D-erithroaskorbat (Hancock, 2000).

Universitas Sumatera Utara

Running menyatakan bahwa fermentasi aerobik dan pemilihan strain yang tepat

akan dihasilkan asam askorbat ekstraseluler sebesar 76 mg/L. Dengan mutagen klasik

dan metoda seleksi, kami menciptakan mutan Prototheca moriformis ATCC 75669

yang menghasilkan kuantitas asam askorbat terbesar daripada strain tipe alamiah (78,4

vs 21,9 mg AA/g sel) (Running, 2002).

Rewatkar menyatakan bahwa dengan menggunakan 5 gram sorbitol; 0,5 gram

ekstrak yeast dan 2 gram agar yang dilarutkan dalam 100 mL H2

Salah satu aspek yang penting dari proses-proses fermentasi adalah cara

pemanenan dan memurnikan hasil produk fermentasi atau bioproduk. Proses ini

dikenal dengan proses hilir (Kroner, 1984).

O setelah difermentasi

selama 7 hari oleh Acetobacter suboxydans akan diperoleh sebanyak 4,997 mg/L

(6,2213%) asam askorbat. Dengan cara yang sama tetapi menggunakan bakteri

Pseudomonas aeruginosa akan dihasilkan 3,217 mg/L (4,0213%). Sedangkan bila

digunakan Saccharomyces cerevisiae akan dihasilkan 1,882 mg/L (2,3525%) asam

askorbat (Rewatkar, 2010).

Universitas Sumatera Utara

2.5 Kinetika Pertumbuhan Mikroba

Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memenuhi persyaratan untuk

pertumbuhannya. Apabila suatu sel mikroba (misalnya bakteri) ditumbuhkan pada

suatu medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba tersebut akan

mengadakan multiplikasi secara aseksual dengan pembelahan sel menjadi dua sel

vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses tersebut berlangsung terus-menerus

selama nutrisi, energi, dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi syarat tumbuh.

Waktu antara yang ditentukan sel untuk membelah disebut waktu generasi(g).

Waktu generasi masing-masing pembelahan sel berbeda-beda tergantung dari spesies

dan kondisi lingkungan. Namun demikian, sebagian besar bakteri mempunyai waktu

generasi antara 10-60 menit.

Kurva pertumbuhan mikroba dalam kultur :

Kurva Pertumbuhan Mikroba (Nurwantoro, 1997).

Universitas Sumatera Utara

1. Fase Adaptasi

Jika mikroba ditumbuhkan pada suatu media, pada awalnya akan mengalami

fase adaptasi (fase lag), yaitu fase untuk menyesuaikan dengan substrat dan

kondisi lingkungan sekitarnya. Pada fase ini belum terjadi pembelahan sel

karena beberapa enzim mungkin belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini

mungkin tetap, tetapi kadang-kadang menurun. Lamanya fase adaptasi setiap

jenis mikroba sangat bervariasi. Hal ini dipengaruhi oleh beberapa faktor,

antara lain media dan lingkungan pertumbuhan serta jumlah inokulum.

a. Media dan lingkungan pertumbuhan

Mikroba yang ditumbuhkan pada media dan lingkungan pertumbuhan yang

berbeda dengan media dan lingkungan pertumbuhan sebelumnya akan

melakukan adaptasi selama beberapa waktu. Akan tetapi, perlu diketahui

bahwa selama adaptasi ini mikroba juga mensintesis enzim-enzim yang

dibutuhkan dalam metabolisme. Kecuali jika media dan lingkungannya sama

seperti media dan lingkungan sebelumnya, mungkin tidak diperlukan waktu

adaptasi. Kalaupun memerlukan waktu, ini tidak akan berlangsung lama

melainkan sangat singkat.

b. Jumlah inokulum

Jumlah sel (mikroba) awal yang semakin tinggi akan memperlambat waktu fase

adaptasi.

2. Fase Pertumbuhan Awal

Setelah penyesuaian diri, maka sel mikroba mulai membelah dengan kecepatan

rendah.

3. Fase Pertumbuhan Logaritmik

Universitas Sumatera Utara

Pada fase ini pertumbuhan mencapai kecepatan maksimum. Selama fase

pertumbuhan logaritmik, tumbuh sel-sel muda yang mendominasi sebagian

besar fase ini, dimana pertambahan jumlah sel-sel muda ini mengikuti kurva

logaritmik. Kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh media (sering kali

disebut medium) tempat tumbuhnya, seperti pH dan kandungan nutrisi, juga

kondisi lingkungan termasuk suhu dan kelembaban udara relatif. Pada fase ini

sel membutuhkan energi lebih banyak dibandingkan fase lainnya, tetapi pada

fase ini justru sel-selnya sangat sensitif terhadap keadaan lingkungan.

4. Fase Pertumbuhan Lambat

Pada fase ini pertumbuhan populasi mikroba diperlambat, karena nutrisi di

dalam media mulai berkurang dan adanya hasil-hasil metabolisme yang

barangkali beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroba itu sendiri.

Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil, tetapi populasi mikroba tetap naik

karena jumlah sel yang tumbuh masih lebih banyak daripada sel yang mati.

5. Fase Pertumbuhan Tetap (Statis)

Pada fase ini jumlah sel yang mati seimbang dengan sel yang tumbuh. Hal ini

disebabkan komposisi media tidak memenuhi syarat pertumbuhan dan

kemungkinan adanya racun yang diproduksi oleh mikroba itu sendiri. Ukuran

sel pada fase ini menjadi lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun

kekurangan nutrisi.

6. Fase Menuju Kematian dan Fase Kematian

Pada fase ini sebagian populasi mikroba mulai mengalami kematian yang

disebabkan karena tiadanya nutrisi di dalam media dan habisnya energi

cadangan di dalam sel. Jumlah sel yang mati kian banyak sesuai dengan

Universitas Sumatera Utara

umurnya. Kecepatan kematian ini dipengaruhi oleh kondisi nutrisi, lingkungan,

dan jenis mikroba (Nurwantoro, 1997).

Setiap bahan pangan (biasa disebut pangan) selalu mengandung mikroba yang

jumlah dan jenisnya berbeda. Beberapa jenis mikroba yang banyak terdapat dalam

bahan pangan adalah bakteri, kapang, dan khamir.Pertumbuhan mikroba sangat

dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain : faktor fisika, kimia dan biologis.

Faktor-faktor tersebut meliputi:

1. Faktor intrinsik, merupakan sifat-sifat fisika, kimia, dan struktur yang dimiliki

oleh bahan pangan itu sendiri. Faktor intrinsik dalam bahan pangan berupa

kandungan nutrisi, pH pangan, aktivitas air(aw) pangan, potensial reduksi

oksidasi, senyawa antimikroba alamiah dalam pangan, dan struktur biologi;

2. Faktor ekstrinsik, yaitu kondisi lingkungan pada penanganan dan penyimpanan

bahan pangan, seperti suhu kelembaban, susunan gas di atmosfer. Faktor-faktor

ekstrinsik yang berpengaruh terhadap kehidupan mikroba, antara lain suhu,

kelembaban, dan susunan gas di atmosfer;

3. Faktor implisit, yang merupakan sifat-sifat yang dimiliki oleh mikroba itu sendiri.

Faktor ini sangat dipengaruhi oleh susunan biotik mikroba dalam bahan pangan.

Faktor-faktor implisit yang berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba adalah

sinergisme dan antagonisme;

4. Faktor pengolahan, karena perubahan mikroba awal sebagai akibat pengolahan

bahan pangan (misalnya pemanasan, pendinginan, irradiasi, penambahan bahan

pengawet). Mikroba spesifik yang terdapat di dalam bahan-bahan pangan dapat

dikurangi jumlahnya oleh berbagai jenis metode pengolahan atau pengawetan

pangan. Jenis-jenis pengolahan/pengawetan pangan yang berpengaruh terhadap

kehidupan mikroba antara lain suhu tinggi, suhu rendah, penambahan bahan

pengawet, dan irradiasi (pengaruh berbagai metoda pengolahan/pengawetan

pangan terhadap kehidupan mikroba) (Sudarmadji, 1989).

Universitas Sumatera Utara

2.6 Kinetika Pembentukan Produk

Sangat jarang dijumpai bioproses yang menghasilkan produk tunggal. Setiap

pertumbuhan mikroba selalu diikuti dengan pembentukan produksi satu atau beberapa

metabolit maka reaksi secara keseluruhan selalu stoikiometri serta mengikuti hukum

kekekalan massa. Selain pemantauan biomassa secara serentak juga dilakukan

pengukuran produk metabolit serta berkurangnya substrat persatuan waktu. Hubungan

ini umumnya disajikan dalam bentuk kurva. Hubungan kinetika pertumbuhan dan

pembentukan produk metabolit tergantung pada peranan produk di dalam metabolisme

sel.

Ada tiga pola yang dikenal dalam hubungan tersebut

a. Pola pertumbuhan yang berasosiasi dengan pembentukan produk

Pada umumnya dijumpai pada proses yang produknya merupakan hasil langsung

pada suatu jalur katabolik, misalnya pada fermentasi gula menjadi etanol

b. Pola pembentukan produk yang tidak berasosiasi dengan pertumbuhan

Pada pembentukan produk yang tidak berasosiasi dengan pertumbuhan

umumnya terjadi pada fermentasi yang menghasilkan metabolit sekunder

misalnya pada fermentasi antibiotik dimana pembentukan produk terjadi pada

akhir fermentasi

c. Pola campuran pertumbuhan berasosiasi dan tak berasosiasi

Pada beberapa fermentasi pertumbuhan dan pembentukan produk mempunyai

hubungan sebagian misalnya pada fermentasi asam laktat, pululan dan xanthan.

Pola ini disebut campuran pertumbuhan berasosiasi dan tak berasosiasi, dan laju

pembentukan produk berbanding lurus baik dengan konsentrasi sel maupun laju

pertumbuhan. Model ini dikemukakan oleh Leudeking dan Piret (1959) sehingga

disebut dengan model kinetika Leudeking Piret (Bailey, 1986).

2.7 Pemilihan Bioreaktor

Universitas Sumatera Utara

Bioreaktor adalah suatu unit alat yang digunakan untuk tempat berlangsungnya suatu

proses biokimia dari bahan mentah menjadi bahan jadi atau zat tertentu yang

dikehendaki, dikatalisis oleh suatu enzim yang terdapat pada mikroorganisme hidup

atau enzim-enzim terisolasi. Suatu bioreaktor harus dapat memberikan kondisi

optimum kepada mikroba penghasil enzim ataupun enzim terisolasi agar produksi

bahan yang dikehendaki memperoleh hasil maksimum. Untuk itu umumnya suatu

bioreaktor memerlukan pengatur-pengatur suhu, pH dan oksigen terlarut. Di samping

itu diperlukan bahan baku, bahan nutrisi yang cukup dan serasi dengan sifat enzimnya

(Muljono, 1992).

Reaktor biokimia atau bioreaktor diklasifikasikan menjadi dua kategori utama :

1) Fermenter mikrobial

2) Reaktor enzim (Rao,2005).

Dalam kegiatan bioproses terdapat 2 komponen penting yaitu biokatalis enzim

atau sel hayati penghasil enzim dan kondisi lingkungan. Kedua komponen tersebut

sangat penting dan berguna agar katalis dapat bekerja secara optimal. Lingkungan

optimal ini dapat dicapai dengan menempatkan biokatalis dalam wahana yang disebut

bioreaktor atau biofermentor.

Oleh karena itu bioreaktor dan seluruh sistem dalam bioreaktor harus dirancang

sebaik mungkin agar proses yang dilakukan oleh biokatalis dapat berlangsung

seoptimal mungkin. Selama proses suasana reaksi harus dapat dipantau dan

dikendalikan.

Bioreaktor harus memberikan lingkungan fisik sehingga biokatalis dapat

melakukan interaksi dengan lingkungan dan bahan nutrisi yang dimasukkan ke

dalamnya. Dalam praktek dikenal 2 sistem bioreaktor yakni bioreaktor monoseptik

misalnya dalam pembuatan ragi roti (yeast) dimana pembuang limbah (sisa fermentasi)

dari dalam bioreaktor dapat dilakukan tanpa sterilisasi tapi cukup dicuci saja.

Bioreaktor aseptis misalnya dalam pembuatan antibiotik asam-asam amino,

protein sel tunggal (PST) dimana setelah pembuang limbah alat harus disterilisasi pada

Universitas Sumatera Utara

autoklaf. Optimasi pertumbuhan biokatalis dan pembentukan produk dalam bioreaktor

harus memperhatikan faktor-faktor berikut ini

1. PH

2. Suhu

3. Media/Sumber Energi

4. Inhibitor

5. Inokulum yang baik

6. Kondisi fisiko kimiawi yang baik yang optimal

Bioreaktor sebagai wahana proses memegang peran penting dalam industri yang

mendayagunakan reaksi-reaksi biokimia yang dilakukan oleh sel (mikroba, tanaman

atau hewan) sebagai penghasil enzim (Aiba, 1973). Alat atau perlengkapan yang

memberi kondisi untuk berlangsungnya bioreaksi dinamakan pula fermentor. Alat ini

dapat dibuat dalam berbagai tipe. Menurut Denbigh dan Turner, jenis fermentor dapat

digolongkan dalam tipe berikut :

1. Fermentor Batch (FB)

2. Fermentor Teraduk Kontinu (FTK)

3. Fermentor Tubular (FT)

4. Fermentor Bed Cair (FBC)

Perkembangan terciptanya tipe-tipe tersebut sebagian besar dipengaruhi sifat-

sifat dasar mikroorganisme yang sangat bervariasi. Salah satu sifat mikroorganisme

yang menguntungkan adalah pada umumnya kadar airnya cukup tinggi sekitar

60-95% sehingga kerapatannya hanya berbeda sedikit dari air. Jadi untuk menjaga

suspensi bakteri hanya diperlukan gerakan hidrodinamik yang kecil, antara lain dapat

dilakukan dengan menggerakkan perlahan-lahan cairan sekitarnya dengan alat

pengaduk atau mekanik mengalirkan udara melalui media atau mengoncangnya.

Fermentor tipe batch (FB) adalah jenis yang asli yang mempunyai kelemahan

terutama dalam kecepatan produksi. Kondisi bahan maupun mikroorganisme dalam

fermentor batch secara menyeluruh mengalami perubahan seiring dengan waktu

Universitas Sumatera Utara

sampai pada tingkat tertentu saat pemanenan harus dilakukan untuk proses lebih lanjut,

seperti pemurnian dan lain sebagainya.

Pada fermentor teraduk kontinu terdiri dari deretan bejana silindrik yang

dilengkapi masing-masing dengan alat pengaduk. Pemasukan bahan diberikan ke

dalam bejana secara periodik. Bahan terfermentasi sebagian dipindahkan ke bejana

selanjutnya dalam periode yang sama dalam pemberian pertama. Setelah melalui

bejana, bahan terfermentasi dipanen untuk diproses lebih lanjut. Fermentor demikian

mudah mengontrol pH dan suhunya.

Fermentor tubular terdri dari suatu tabung yang biasanya agak memanjang untuk

menjamin berlangsungnya fermentasi secukupnya selama proses dalam tabung untuk

dipanen pada terminal terakhir. Fermentor demikian umumnya lebih sulit untuk

dilengkapi dengan sarana kontrol kondisi dan penyiapan alatnya sedemikian rupa

sehingga menjamin homogenitas untuk seluruh ruangan dan mengurangi pengaruh

perubahan fisik terhadap waktu proses (Muljono, 1992).

Sistem bioreaktor bagi pertumbuhan mikroorganisme dapat diklasifikasikan

sebagai sistem tertutup atau terbuka. Suatu sistem dipandang tertutup bila bagian

esensial sistem tersebut tidak dapat memasuki atau meninggalkan sistem tersebut. Jadi,

dalam sistem batch tradisional atau sistem fermentasi tertutup, semua komponen

nutrien ditambahkan pada awal proses fermentasi dan sebagai hasilnya, laju

pertumbuhan organisme yang ada di dalamnya akhirnya akan berkurang hingga

mencapai jumlah nol karena penurunan jumlah nutrien atau pemupukan limbah yang

beracun.

Karena alasan inilah, metabolisme organisme dalam proses batch tertutup selalu

berada dalam keadaan berubah-ubah. Akan tetapi, sebagian besar sistem bioteknologi

yang mutakhir akan bekerja sebagai proses batch dengan kondisi yang dibuat optimal

untuk menghasilkan pembentukan maksimal produk yang dikehendaki, misalnya

dalam proses pembuatan bir, antibiotik dan enzim.

Universitas Sumatera Utara

Ukuran bioreaktor produksi dalam industri berkisar antara 10.000 hingga 20.000

liter walaupun sebuah bioreaktor raksasa yang berukuran 4 juta liter baru-baru ini

diizinkan pembangunannya. Bioreaktor yang berukuran kecil terutama digunakan

untuk menghasilkan produk dengan volume rendah dan harga tinggi, seperti enzim

serta zat-zat kimia tertentu, sementara bioreaktor yang berukuran besar digunakan

secara luas untuk menghasilkan antibiotik, asam-asam organik, dan lain-lain.

Modifikasi pada proses batch tersebut adalah sistem fed-batch dan dalam sistem

ini dapat ditambahkan sejumlah nutrien selama proses fermentasi untuk mengatasi

deplesi nutrien, atau ditambahkan sejumlah senyawa yang baru sebagai aktivator

selektif, misalnya dalam proses membuat ragi untuk industri pembuatan roti. Namun

demikian, sistem tersebut tetap tertutup karena tidak ada aliran keluar yang kontinu.

Berbeda dengan sistem di atas, suatu sistem fermentasi dianggap terbuka bila

semua komponen pada sistem tersebut (seperti organisme dan nutrien) dapat terus-

menerus memasuki dan meninggalkan bioreaktor. Jadi, sistem bioreaktor terbuka atau

aliran kontinu mempunyai masukan media nutrien yang baru dan keluaran biomassa

serta produk lainnya secara kontinu (Smith, 1995).

Dari penelitian yang dilakukan, digunakan alat pengaduk pada proses fermentasi

untuk memutuskan proses terbentuknya asam asetat dengan bantuan bakteri

Acetobacter xylinum sehingga diperoleh hasil vitamin C. Peneliti juga mengatur pH 4-

4,5 pada suhu kamar dengan menjaga kondisi optimal bakteri dalam proses biosintesis

vitamin C.

2.8 Acetobacter Xylinum

Acetobacter mempunyai sel-sel yang terbentuk elips atau tongkat yang melengkung.

Acetobacter merupakan bakteri aerob, yang memerlukan respirasi dalam metabolisme.

Acetobacter dapat mengoksidasi etanol menjadi asam asetat, juga dapat mengoksidasi

asetat dan laktat menjadi CO2 dan H2O. Berbagai spesies Acetobacter dapat ditemukan

Universitas Sumatera Utara

pada buah-buahan dan sayur-sayuran. Bakteri inilah yang menyebabkan pengasaman

jus buah-buahan dan minuman beralkohol (bir dan anggur) (Banwart,1981).

Spesies Acetobacter yang telah dikenal antara lain : A.aceti, A.orleanensis,

A.liquefasiensis, dan A.xylinum. Meskipun ciri-ciri yang dimiliki hampir sama dengan

spesies lainnya. A.xylinum dapat dibedakan dengan spesies yang lainnya karena

sifatnya yang unik.

Bila A.xylinum ditumbuhkan pada medium yang mengandung gula, bakteri itu

dapat memecah komponen gula dan mampu membentuk suatu polisakarida yang

dikenal dengan selulosa ekstraseluler. Selain itu mempunyai aktivitas oksidasi lanjutan

atau “over oxydizer” yaitu mampu mengoksidasi lebih lanjut asam asetat menjadi CO2

dan H2

Sifat inilah yang umumnya mempunyai sifat “under oxydizer” yaitu hanya

mengubah alkohol menjadi asam asetat. Dalam medium cair Acetobacter xylinum

mampu membentuk suatu lapisan yang dapat mencapai ketebalan beberapa sentimeter.

Bakteri terperangkap dalam massa benang-benang yang dibuatnya. Untuk

menghasilkan massa yang kokoh, kenyal, tebal, putih dan tembus pandang perlu

diperhatikan suhu fermentasi (inkubasi), komposisi medium dan pH medium.

O.

Menurut Warisno, biakan murni Acetobacter xylinum digunakan sebagai starter

yang bisa mensintesa air kelapa hingga menjadi nata de coco. Biakan murni ini bisa

diperbanyak menjadi bibit atau starter. Bibit atau starter berisi mikroba dengan jumlah

dan kondisi fisiologis yang siap diinokulasi ke dalam media fermentasi (Daulay,2003).

2.9 Enzim

Universitas Sumatera Utara

Berdasarkan metabolisme di atas, terjadi reaksi enzimatis dimana substrat glukosa

dapat diubah menjadi D-sorbitol melalui proses hidrogenasi dengan pengaturan

tekanan pada 80-125 atm, suhu 140°C - 150°C dan penggunaan katalis Ni. Selanjutnya

D-sorbitol diubah menjadi L-asam askorbat dengan bantuan enzim yang dihasilkan

oleh bakteri. Adapun enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteri dalam proses

biosintesis vitamin C sebagai berikut :

1. Enzim D-sorbitol dehydrogenase pada proses perubahan D-sorbitol menjadi L-

sorbose

Universitas Sumatera Utara

2. Enzim L-sorbose dehydrogenase pada proses perubahan L-sorbose menjadi L-

sorbosone

3. Enzim L-sorbosone dehydrogenase pada proses perubahan L-sorbosone menjadi

2-keto-L-gulonic acid

Selanjutnya melalui proses esterifikasi/laktonisasi, 2-keto-L-gulonic acid dapat diubah

menjadi L-asam askorbat (Hancock, 2002).

2.10 Metoda Hitungan Cawan

Metoda hitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup

akan berkembang menjadi suatu koloni. Jumlah koloni yang muncul pada cawan

merupakan suatu indeks jumlah mikroba yang hidup terkandung dalam sampel. Hal

yang perlu dikuasai dalam hal ini adalah teknik pengenceran. Setelah inkubasi, jumlah

koloni masing-masing cawan diamati. Untuk memenuhi persyaratan statistik, cawan

yang dipilih untuk dihitung mengandung 30-300 koloni. Untuk memenuhi persyaratan

tersebut harus melakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlah mikroba

dalam sampel ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran

pada cawan yang bersangkutan.

Prinsip dari metoda hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup

ditumbuhkan pada medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan

membentuk koloni yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa

menggunakan mikroskop. Metoda ini merupakan cara yang paling sensitif untuk

menentukan jumlah jasad renik, dengan alasan :

- Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung

- Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus

- Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang

terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik

Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas, metoda hitungan cawan juga memiliki

kelemahan sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena

beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni

- Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang

berbeda pula

- Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan

membentuk koloni yang kompak, jelas, tidak menyebar

- Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan

koloni dapat dihitung

Dalam metoda hitungan cawan, bahan yang diperkirakan mengandung lebih dari

300 sel mikroba per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan sampel dilakukan

pada permukaan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelumnya ditumbuhkan pada

medium agar di dalam cawan petri. Setelah inkubasi, akan terbentuk koloni pada

cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, di mana jumlah yang terbaik adalah

di antara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal, yaitu

1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat

berupa larutan buffer fosfat, 0,85% NaCl atau larutan Ringer. Metoda hitungan cawan

dibedakan atas dua cara, yakni metoda tuang (pour plate) dan metoda permukaan

(surface/spread plate) (Waluyo,L.,2010).

2.11 Metoda Analisa Vitamin C

Metoda analisa vitamin C dalam bahan pangan dapat dikelompakkan menjadi beberapa

metoda.

1. Metoda fisika

a. Metoda spektroskopi

Metoda ini berdasarkan pada kemampuan vitamin C yang terlarut dalam air untuk

menyerap sinar ultraviolet, dengan panjang gelombang maksimum 265 nm. Karena

vitamin C dalam larutan mudah sekali mengalami kerusakan, maka pengukuran

Universitas Sumatera Utara

dengan cara ini harus dilakukan secepat mungkin. Untuk memperbaiki hasil

pengukuran, sebaiknya ditambahkan senyawa pereduksi yang lebih kuat dari vitamin C.

Hasil terbaik diperoleh dengan menambahkan sejumlah ekuimolar (kira-kira) larutan

KCN (sebagai stabilizer) ke dalam larutan vitamin.

b. Metoda polarografik

Metoda ini berdasarkan pada potensial oksidasi asam askorbat dalam larutan asam atau

bahan pangan yang bersifat asam, misalnya ekstrak buah-buahan dan sayuran.

2. Metoda Kimia

Metoda kimia merupakan cara pengukuran vitamin C paling banyak macamnya dan

paling sering digunakan. Sebagian besar metode kimia didasarkan pada kemampuan

vitamin C karena senyawa dehidro asam askorbat (memiliki aktivitas vitamin C

sebesar 80%) tidak bersifat pereduksi, maka untuk mengukur vitamin C dalam bahan

pangan terlebih dahulu harus dilakukan perlakuan pendahuluan menggunakan senyawa

pereduksi seperti H2

S untuk mengubah dehidro asam askorbat menjadi asam askorbat.

Di samping itu, terdapat sejumlah vitamin C yang terikat dengan komponen protein

dan bersifat non pereduksi. Bentuk terikat ini harus dibebaskan lebih dahulu dalam

penentuan kandungan vitamin C dalam suatu bahan.

3. Metoda Biokimia (Metoda asam askorbat oksidase)

Metoda ini berdasarkan kemampuan enzim asam askorbat oksidase untuk

mengoksidasi asam askorbat. Reaksi oksidasi ini ternyata tidak bersifat spesifik untuk

menghasilkan hasil yang memuaskan karena enzim tersebut dapat juga mengoksidasi

komponen-komponen organik lain yang terdapat dalam ekstrak jaringan hewan,

terutama senyawa organik yang dapat mereduksi biru metilen (methyken blue). Lebih

lanjut dibuktikan bahwa enzim asam askorbat yang diisolasi dari labu tidak bereaksi

dengan vitamin C dalam urine manusia, cairan sumsum tulang belakang dan susu sapi.

Universitas Sumatera Utara

4. Metoda Biologi

Walaupun banyak diganti dengan metoda fisika dan kimia untuk menentukan vitamin

C, metoda biologi tetap merupakan metoda penentuan vitamin C yang paling realistis

dan paling mendekati kebenaran

(http://id.shvoong.com/writing-and-speaking/metode-analisa-vitamin/).

5. Larutan 2,6-diklorofenol indofenol dalam suasana netral atau basis akan berwarna

biru sedang dalam suasana asam akan berwarna merah muda. Apabila 2,6-diklorofenol

indofenol direduksi oleh asam askorbat maka akan menjadi tidak berwarna, dan bila

semua asam askorbat sudah mereduksi 2,6-diklorofenol indofenol maka kelebihan

larutan 2,6-diklorofenol indofenol sedikit saja sudah akan terlihat dengan terjadinya

pewarnaan. Untuk perhitungan maka perlu dilakukan standarisasi larutan dengan

vitamin C standar (Sudarmadji, 1989).

Dalam metoda biologi untuk mengukur vitamin C, hewan percobaan yang

digunakan hanya marmot (guinea pigs). Jika mereka diberi ransum tanpa vitamin C,

dalam waktu 2-3 minggu akan menderita Scurvy.

Terdapat 3 cara pengukuran biologis dengan menggunakan guinea pigs yaitu:

a. Metoda preventif, untuk mengukur jumlah terkecil vitamin C yang dapat mencegah

timbulnya tanda-tanda Scurvy secara makro, misalnya penurunan berat badan.

b. Metoda kuratif, untuk mengukur jumlah vitamin C terkecil untuk menyembuh

guinea pigs yang menderita Scurvy

c. Metoda histology, memeriksa gigi guinea pigs, lapisan odontoblas tidak teratur,

terjadi pengapuran predentive dan terbentuk lapisan tulang yang tidak beraturan di

antara odontoblast dan predentive

(http://id.shvoong.com/writing-and-speaking/metode-analisa-vitamin/).

Universitas Sumatera Utara

2.12 Penentuan Vitamin C secara Metoda Spektroskopi Ultraviolet-Sinar Tampak

Prinsip spektroskopi didasarkan adanya interaksi dari energi radiasi elektromagnetik

dengan zat kimia. Dengan mengetahui interaksi yang terjadi, dikembangkan teknik-

teknik analisis kimia yang memanfaatkan sifat-sifat dari interaksi tersebut. Hasil

interaksi tersebut bisa menimbulkan satu atau lebih peristiwa seperti : pemanasan,

pembiasan, interferensi, difraksi, penyerapan (absorpsi), fluoresensi, fosforiensi dan

ionisasi. Dalam analisis kimia, peristiwa absorpsi merupakan dasar dari cara

spektroskopi karena proses absorpsi tersebut bersifat unik/spesifik untuk setiap zat

kimia atau segolongan zat kimia (aplikasi kualitatif). Di samping itu adalah kenyataan

bahwa banyaknya absorpsi berbanding lurus dengan banyaknya zat kimia (aplikasi

kuantitatif) (Sudarmadji, 1989).

Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik,

molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan/atau atom yang mengandung

elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbit terluarnya dari tingkat energi

elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya absorban

radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi dan

dapat digunakan untuk analisa kuantitatif. Frekuensi radiasi ultraviolet dan sinar

tampak, terletak antara 1,5x108 Hz sampai 4,28x107 Hz, dengan panjang gelombang

antara 200 nm sampai 700 nm, serta energi yang besarnya antara 9,939x10-26 joule

sampai 2,836x10-26

aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan/atau molekul

heterosiklik mengandung atom dengan elektron-n, untuk meningkatkan elektron dalam

orbit molekul terluarnya ke tingkat tereksitasi. Kegunaan spektrofotometri ultraviolet

dan sinar tampak dalam analisis kualitatif sangat terbatas, karena rentang daerah

radiasi yang relatif sempit (500 nm) hanya dapat mengakomodasi sedikit sekali puncak

absorpsi maksimum dan minimum, karena itu identifikasi senyawa yang tidak

diketahui, tidak memungkinkan.

joule, sesuai dengan energi yang diperlukan oleh molekul organik

Universitas Sumatera Utara

Penggunaan utama spektroskopi ultraviolet-sinar tampak adalah dalam analisis

kuantitatif. Apabila dalam alur radiasi spektrofotometer terdapat senyawa yang

mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai

detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul adalah

absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding dengan

banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar analisis

kuantitatif. Kurva absorpsi di daerah ultraviolet pada umumnya lebih sempit daripada

kurva absorpsi di daerah sinar tampak. Penentuan kadar dilakukan dengan mengukur

absorban pada panjang gelombang absorban maksimum (puncak kurva), agar dapat

memberikan absorban tertinggi untuk setiap konsentrasi. Bila suatu senyawa

mempunyai lebih dari satu puncak absorpsi maksimum, lebih diutamakan panjang

gelombang absorpsi maksimum yang absorptivitasnya terbesar dan memberikan kurva

kalibrasi linier dalam rentang konsentrasi yang relatif lebar. Pada penentuan analit

yang terdapat dalam suatu matriks diperlukan pengukuran dari blanko matriks untuk

meralat kesalahan yang disebabkan oleh matriks. Bila komponen matriks untuk blanko

tidak dapat diperoleh, standar dua sampai lima kali yang ditambahkan dengan

konsentrasi yang meningkat secara teratur (Satiadarma, 2004).

Suatu spektrum ultra ungu diperoleh secara langsung dari suatu alat yang secara

sederhana memetakan panjang gelombang dari suatu serapan terhadap intensitas

serapan (absorbans atau transmitans). Datanya seringkali diubah menjadi suatu grafik

dari panjang gelombang terhadap serapan molar (εmaks atau log εmaks

T = I/I

). Intensitas dari

serapan dapat dinyatakan sebagai transmitans (T) didefinisikan sebagai :

dimana Io

o adalah intensitas dari energi pancaran yang mengenai cuplikan, dan I adalah

intensitas pancaran yang keluar dari cuplikan. Rumusan yang tepat dari intensitas

serapan adalah yang diturunkan dari hukum Lambert-Beer yang memantapkan

hubungan antara transmitans dengan tebalnya cuplikan, dan konsentrasi dari bahan

yang menyerap. Hubungan ini dinyatakan sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara

log 10 (Io

dimana :

/I) = kcb = A

k = suatu tetapan khas dari bahan larutan

c = konsentrasi dari larutan

b = panjang jalur

A = absorbans (kerapatan optik. serapan)

Bila c dinyatakan dalam mol per liter, dan panjang jalur (b) dinyatakan dalam

sentimeter, persamaan menjadi :

A = εcb

Istilah ε diketahui sebagai absorptivitas molar, dahulu dikenal sebagai koefisien

ekstingsi molar (molar extinction coefficient). Di dalam konsentrasi (c) dari larutan

yang didefinisikan sebagai g/liter, persamaan menjadi :

A = abc

dimana a adalah absortifitas (absorptivity), jadi berhubungan dengan absorptifitas

molar melalui

ε = aM

dimana M adalah berat molekul dari larutan (Silverstein, 1986).

2.13 Penentuan Vitamin C secara Metoda Polarimeter

Satu properti cahaya yang penting dan berguna adalah kenyataan bahwa ia bisa

dipolarisasi. Untuk memahami apa maksudnya, mari kita meneliti gelombang yang

berjalan pada tali. Tali dapat digetarkan pada bidang vertikal atau pada bidang

horizontal. Pada kedua kasus, gelombang dikatakan terpolarisasi bidang yaitu osilasi

terjadi pada bidang. Jika sekarang kita letakkan penghalang berupa celah vertikal pada

lintasan gelombang. Gelombang terpolarisasi vertikal akan lewat, tetapi yang

terpolarisasi horizontal tidak. Jika digunakan celah horizontal, gelombang terpolarisasi

vertikal akan terhenti. Jika kedua jenis celah digunakan, kedua jenis gelombang akan

terhenti. Perhatikan bahwa polarisasi hanya dapat terjadi untuk gelombang transversal,

Universitas Sumatera Utara

dan tidak untuk gelombang longitudinal seperti bunyi. Bunyi bergetar hanya sepanjang

arah gerak, dan baik orientasi maupun celah tidak akan menghentikannya. Teori

Maxwell mengenai cahaya sebagai gelombang elektromagnetik (EM) meramalkan

bahwa cahaya dapat terpolarisasi karena gelombang EM merupakan gelombang

transversal. Arah polarisasi pada gelombang EM yang terpolarisasi bidang diambil

sebagai arah vektor medan listrik. Cahaya tidak harus terpolarisasi. Ia dapat tidak

terpolarisasi, yang berarti bahwa sumber memiliki getaran di banyak tempat sekaligus.

Bola lampu pijar biasa memancarkan cahaya yang tidak terpolarisasi, sebagaimana

Matahari.

Cahaya yang terpolarisasi bidang bisa didapat dari cahaya yang tidak

terpolarisasi dengan menggunakan kristal-kristal tertentu seperti turmalin (bahan-

bahan listrik yang digunakan sebagai perhiasan). Atau, lebih umum saat ini, kita dapat

menggunakan lembar Polaroid (Materi Polaroid ditemukan pada tahun 1929 oleh

Edwin Land). Lembar Polaroid terdiri dari molekul panjang yang rumit yang tersusun

paralel satu sama lain. Polaroid seperti ini berfungsi seperti serangkaian celah paralel

untuk memungkinkan satu orientasi polarisasi untuk lewat hampir tanpa berkurang

(arah ini disebut sumbu Polaroid), sementara polarisasi tegak lurus hampir terserap

sempurna. Jika satu berkas cahaya terpolarisasi bidang jatuh pada Polaroid yang

sumbunya membentuk sudut θ terhadap arah polarisasi datang, berkas akan

terpolarisasi bidang yang paralel dengan sumbu Polaroid dan amplitudonya akan

diperkecil sebesar cos θ. Dengan demikian, Polaroid hanya melewatkan komponen

polarisasi (vektor medan listrik, E) yang paralel dengan sumbunya. Karena intensitas

berkas cahaya sebanding dengan kuadrat amplitudo, kita lihat bahwa intensitas berkas

terpolarisasi bidang yang ditransmisikan oleh alat polarisasi adalah

I = Io cos2

dimana θ adalah sudut antara sumbu alat polarisasi dan bidang polarisasi gelombang

datang, dan I

θ

o adalah intensitas datang.

Universitas Sumatera Utara

Cahaya yang tidak terpolarisasi terdiri dari cahaya dengan arah polarisasi (vektor

medan listrik) yang acak. Masing-masing arah polarisasi ini dapat diuraikan menjadi

komponen sepanjang dua arah yang saling tegak lurus. Dengan demikian, berkas yang

tidak terpolarisasi dapat dianggap sebagai dua berkas terpolarisasi bidang dengan besar

yang sama dan tegak lurus satu sama lain. Ketika cahaya yang tidak terpolarisasi

melewati alat polarisasi, satu dari komponen-komponennya dihilangkan. Jadi intensitas

cahaya yang lewat akan diperkecil setengahnya karena setengah dari cahaya tersebut

dihilangkan, I = ½Io

Apabila radiasi garis-D natrium yang terpolarisasi linier memasuki larutan yang

mengandung molekul senyawa kiral, antaraksi radiasi dengan molekul menyebabkan

vibrasi radiasi terpolarisasi tersebut mengalami rotasi searah atau berlawanan arah

dengan putaran jarum jam dan rotasi spesifik yang dihitung dapat digunakan untuk

karakterisasi identitas dan kemurnian senyawa kiral tersebut. Polarimetri adalah

pengukuran rotasi arah vibrasi radiasi terpolarisasi linier (bidang) pada waktu

berantaraksi dengan molekul senyawa yang aktif optik. Aktivitas optik suatu senyawa

bersumber pada struktur molekulnya yang tidak mempunyai bidang atau pusat simetrik.

Ketidaksimetrikan itu mungkin merupakan struktur molekul bawaan yang disebut kiral,

mungkin juga merupakan keistimewaan dari bentuk kristal yang tidak diberikan oleh

fase larutan atau gasnya atau terdapat juga pada sebagian kecil dari konformasi

molekul tertentu, seperti heliks polipeptida.

(Giancoli,2001).

Rotasi optik yang diakibatkan oleh senyawa kiral tergantung kepada tebal alur

dan konsentrasi larutan yang dilewati radiasi terpolarisasi linier, panjang gelombang,

jenis pelarut, pH, dan temperatur larutannya. Pengukuran rotasi optik pada umumnya

distandarkan, menggunakan garis hijau raksa, 5461 A atau doblet kuning natrium,

5890 dan 5896 A, pada temperatur 20°C. Rotasi spesifik, [α], dihitung dari rotasi optik

yang diamati,α, dengan rumus :

Universitas Sumatera Utara

b = tebal alur larutan dalam cm

C = konsentrasi dalam g/L

Polarimetri dengan radiasi sinar tampak dapat diamati dengan mata, tetapi jika

menggunakan radiasi ultraviolet atau inframerah diperlukan fotodetektor. Pelarut yang

digunakan untuk polarimetri pada umumnya air, tetapi dapat juga digunakan pelarut

lain, seperti etanol, dioksan atau kloroform. Pelarut harus dapat melarutkan analit

dengan baik, mempunyai kerapatan optik pada panjang gelombang pengukuran cukup

kecil, hingga radiasi dapat mencapai detektor dengan cukup intensitas. Temperatur

berpengaruh pada rotasi optik, karena mengubah konsentrasi dan kekuatan rotasi

(rotatory power) dari molekul. Perubahan konsentrasi yang disebabkan oleh ekspansi

termal, cukup berarti. Ketergantungan kepada temperatur dapat besar sekali, sehingga

menyebabkan perubahan pada rotasi spesifik. Pada sebagian besar molekul senyawa,

perubahan rotasi optik oleh temperatur disebabkan oleh perubahan kesetimbangan

konformasi, hingga rotasi optik dapat digunakan untuk analisis konformasi molekul

senyawa yang aktif optik (Satiadarma, 2004).

2.14 Penentuan Vitamin C secara Metoda Iodometri

Iodin dalam medium yang alkalis dapat terkonversi dengan cepat menjadi hipoiodida.

Hipoiodida dapat mengoksida aldosa,sedangkan untuk ketosa hanya sedikit yang

mengalami oksidasi. Sampel yang telah dalam bentuk larutan ditambah iodin encer dan

NaOH kemudian dicampur secepatnya (karena iodium dapat berubah menjadi iodat

dan tidak reaktif terhadap gula dalam larutan alkalis). Setelah itu diasamkan dengan

asam klorida atau asam sulfat dan dibiarkan beberapa menit. Kemudian kelebihan

iodin dititrasi dengan larutan tiosulfat standar.

Dalam keadaan optimal dan kondisi terkontrol hanya 1% dari ketosa yang ada

dalam sampel teroksidasi sehingga tidak mempengaruhi dalam penentuan aldosa.

Untuk memperbesar ketelitian penentuan cara ini maka adanya zat yang dapat

mempengaruhi harus dihilangkan misalnya etanol, aseton, manitol, gliserin, Na laktat,

Universitas Sumatera Utara

Na format dan Urea. Zat-zat tersebut dapat bereaksi dengan iodin. Apabila dalam

larutan yang ditera juga mengandung ketosa misalnya fruktosa, maka jumlahnya dapat

ditentukan dengan cara-cara yang lazim digunakan misalnya dengan cara oksidasi

dengan kupri setelah dilakukan penentuan gula dengan iodometri.

Larutan 2,6-diklorofenol indofenol dalam suasana netral atau basis akan

berwarna biru sedang dalam suasana asam akan berwarna merah muda. Apabila 2,6-

diklorofenol indofenol direduksi oleh asam askorbat maka akan menjadi tidak

berwarna, dan bila semua asam askorbat sudah mereduksi 2,6-diklorofenol indofenol

maka kelebihan larutan 2,6-diklorofenol indofenol sedikit saja sudah akan terlihat

dengan terjadinya pewarnaan. Untuk perhitungan maka perlu dilakukan standarisasi

larutan dengan vitamin C standar (Sudarmadji, 1989).

Universitas Sumatera Utara