8-kuliah hplc2rev-2013

HPLCHPLC

Dr. H. Dr. H. ATIKAHATIKAH, MS, MSii..AptApt

PRODI FARMASI –FKUB-2013

HPLC High Performance Liquid ChromatographyHigh Pressure Liquid ChromatographyKromatografi Cair Kinerja TinggiAtau dapat disingkat LC

Chromatography teknik pemisahan

Liquid Fase gerak berupa cairan

High Pressure digunakan tekanan tinggi untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom

HPLCHPLC

• Dikembangkan pada awal 1970-an• Dewasa ini merupakan teknik paling banyak

digunakan untuk pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan.

• Merupakan “method of choice for the analysis of a wide variety compounds”

Keunggulan dan Kelemahan HPLC Keunggulan dan Kelemahan HPLC

Keunggulan• Dilakukan pada suhu

kamar• Analisis kuantitatif yang

cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi

• Dapat dioperasikan secara otomatis

• Sensitivitas detektor yang tinggi

• Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas

Kelemahan• Sulit ditemukan

detektor yang universal

• Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC

• Lebih rumit dalam pelaksanaannya

• Lebih mahal

Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme

Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme

• Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)

• Kromatografi Partisi (partition chromatography) • Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange

Chromatography)• Size exclusion chromatography (SEC)

– Kromatografi Permeasi Gel– Kromatografi Filtrasi Gel

GSC GLC

GAS SFC

NP RP IEC

GPC GFC

SEC

Column

T LC Paper

P lanar

LIQUID

CHROMAT OGRAPHY

Fase normal dan Fase terbalikFase normal dan Fase terbalik

Normal Phase (Fase normal) Fase diam polar dan fase gerak non polar Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana

dll.

• Reversed Phase (Fase terbalik) • Fase diam non polar dan fase gerak polar • Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril

dll.

Kromatografi Fase NormalKromatografi Fase Normal

• Disebut juga kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)

• Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina)

• Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.

Kromatografi Fase terbalikKromatografi Fase terbalik

• Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak

• Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir

• Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar.

• Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).

Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography

• Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit dengan ion dari gugus fungsi bahan pendukung padat fase diam

• Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar kation); ammonium kuarterner (penukar anion)

• Fase gerak: dapar• Aplikasi: analisis ion, asam-

asam amino, protein/peptida, polinukleotida

Size Exclusion ChromatographySize Exclusion Chromatography

• Untuk pemisahan makromolekul (BM > 10000).

• Disebut GFC jika digunakan untuk pemisahan molekul biologis yang larut air

• Disebut GPC jika digunakan untuk penentuan Bobot molekul suatu polimer organik. Fase gerak umumnya toluen dan tetrahidrofuran.

Modus Pemisahan LainnyaModus Pemisahan Lainnya

• Kromatografi afinitas (Affinity chromatography) pemisahan berdasarkan interaksi reseptor/ligand dengan komponen analit. Ligand dalam bentuk enzim, antigen atau hormon yang diikatkan pada bahan pendukung padat.

• Chiral chromatography untuk senyawa chiral• Hydrophillic interaction chromatography (HILIC) mirip

NP-HPLC yang menggunakan fase diam polar tetapi dielusi dengan fase gerak polar.

InstrumentationInstrumentation

Pump

Injector

ColumnDetector

Mobile Phases

Gradient Controller

•

Instrumentation

Pump

70 mbar

Eluent

Degasser

Gradient mixer

A

A

B

C

B

C

A

B

C

A B C

A B C

Detector

Column

Instrumentation

Instrumentation

Fase GerakFase Gerak

• Fase gerak diletakkan dalam botol-botol reservoir.

Fase GerakFase Gerak

• Zat cair yang digunakan sebagai fase gerak harus saling campur.

HPLC Mobile PhaseHPLC Mobile Phase

• High solubility for the sample components• Non corrosive to HPLC system components• High purity, low cost, UV transparency• Others: low viscosity, low toxicity, non

flammability

Reversed-phase mobile phasesReversed-phase mobile phases

• Water• Methanol• Acetonitrile• THF• Additives, salts, acids, bases• Ion pairing

Kemurnian Fase gerakKemurnian Fase gerak

• Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi

• Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis.

• Gunakan HPLC grade• Air sebagai fase gerak:

digunakan water for injection

Solvent UV Cutoff (nm)

Acetonitrile 190Water 190Cyclohexane 195

Hexane 200Methanol 210Ethanol 210Diethyl Ether 220

Dichloromethane 220

Chloroform 240Carbon Tetrachloride 265

Tetrahydrofuran 280 (220)

Toluene 285

Isocratic elution: Constant mobile phase composition during run

Isocratic and Gradient Elution

Gradient elution: Programme a changing (stepwise or continuous) mobile phase composition during the run For more complex mixtures

Gradient AnalysisGradient Analysis

Advantages:• Better suited for complex samples• Better resolution of early and late eluting peaks• Better sensitivity of late eluting peaks• Higher peak capacity (fit more peaks in the

chromatogram)

Disadvantages• More complex HPLC instrument• Method development, implementation and transfer are

more difficult• Typically longer analysis times since column must be

calibrated with initial mobile phase

DegasserDegasser

• Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut.

• Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector)

• Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.

Pompa HPLCPompa HPLC

• Pompa Pencampur untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir

• Pompa Analisis mengalirkan fase gerak ke dalam kolom

• Sistem Pompa:• Tekanan Tinggi• Tekanan rendah

Pada : HPLCMengapa perlu tekanan tinggi?

Pada : HPLCMengapa perlu tekanan tinggi?

• Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.

• Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan dp2

• Ukuran partikel makin kecil luas permukaan makin besar transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.

• Penggunaan ukuran partikel kecil diperlukan tekanan tinggi

• Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 – 6000 psi)

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Pompa AnalisisPompa Analisis

• Tekanan: 6000-9000 psi (lbs.m2)• Kecepatan alir: 0.1 – 10 ml/menit• Terbuat dari baja atau teflon • Dapat memberikan aliran isokratik dan gradien

Pompa tekanan rendahPompa tekanan rendah

04/17/23 kuliah ka ii-a 33

DIAGRAM SISTEM POMPA KCKTTEKANAN RENDAH

( Low Pressure System Pump )

DIAGRAM SISTEM POMPA KCKTTEKANAN RENDAH

( Low Pressure System Pump )

Sample InjectionSample Injection

– Load and Inject -Position

Load – InjectPosition

Sample InjectionSample Injection

– Load and Inject -Position

HPLC ColumnsHPLC Columns

Column: the key part of the separation

HPLC Column CategoriesHPLC Column Categories

• Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, PEEK, titanium

• Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC)

• Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano

• Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid

HPLC Column: SpecificationHPLC Column: Specification

CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ

Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail

Herstellername des Kieselgels

Porengröße (Angström)

Modifizierung des Kieselgels

Korngröße in µm

Säulendimension (Länge x ID)

Flussrichtung

Column packing characteristicsColumn packing characteristics

• Critical to the column performance• Support type: silica, polymer, hybrid• Bonded Groups: C18, C8, C4, C3, CN• Particle size (dp): 2, 3, 5 μm• Pore size (dpore): 100-500 m2/g• Ligand (Bonded phase) density: 2-4 μmole/m2

Polymer support materialsPolymer support materials

• Wide pH range: 1-14• Absence of active silanol groups• cross-linked polystirene-divinylbenzene,

polyether, polymetracrylates for bioseparation


TESTING KINERJA KOLOMKCKT

TESTING KINERJA KOLOMKCKT

1. JUMLAH PELAT TEORI ( N )

Number of Theoretical Plates

Idealnya harga N = 10 000 ,informasi disebutkan

- panjang dan diameter internal kolom

- macam komponen yang dianalisis dan harga k’

- fasa mobil dan fasa diam kolom

- ukuran sampel

- temperatur

04/17/23 44kuliah ka ii-a

2. FAKTOR SIMETRI Tailing Factor ( TF ) Symmetry Factor

2. FAKTOR SIMETRI Tailing Factor ( TF ) Symmetry Factor

Foley and Dorsey

TF = b 0.1

a 0.1

harus kurang

dari 2.5 kalau lebih dari 3.0 tidak bisa dilakukan analisis kuantitatif

3. RESOLUSI Harga R = 1 – 1,5


REGENERASI KOLOM REGENERASI KOLOM 1. KOLOM SILICA GEL ( Normal Phase )

Dilakukan pengaliran solvent berikut dengan

kecepatan alir 1 – 3 ml / menit :

-75 ml tetrahydrofuran

-75 ml metanol

-75 ml asam asetat 1 – 5 % dalam aquadest

-75 ml pyridin 1 – 5 % dalam aquadest

-75 ml tetrahydrofuran

-75 ml dichlorometan

-75 ml n hexan


REGENERASI KOLOMREGENERASI KOLOM2. KOLOM FASA SUNGSANG

( Reversed Phase Column )

Dilakukan pengliran solvent berikut dengan

kecepatan alir 0,5 – 2 ml / menit :

-75 ml aquadest + 4 x Injeksi 100 ul DMS

-75 ml metanol

-75 ml chloroform

-75 ml metanol

- Aquadest 0,1M H2SO4 Aquadest


RANGKAIAN KOLOM KCKTRANGKAIAN KOLOM KCKT

Kolom KCKT panjangnya maksimal

25 cm, efisiensinya kurang terutama untuk analisis multi komponen dengan matrik sampel yang rumit.

Untuk itu diatasi dengan perangkaian kolom KCKT secara seri dengan berpedoman pada rumus :

4)6,0

25,1()( 22

exp

R

RR

Panjangkan kolom 4 kali seri !

Particle size (dp)Particle size (dp)

• Particle size and size distribution key factor for efficiency and back pressure of column

• C term of van Deemter eq. proportional to dp2.• Decreasing particle size (the L constant)

increase column efficiency and peak resolution

Surface area and Pore size Surface area and Pore size

• Chromatographic supports are porous to provide more surface area; to maximize interaction of solutes with bonded stationary phase

• Packing for small molecules separations have pore size from 60 to 200 A and surface area 100-500 m2/g.

(300 psi)(1300 psi)(10,000 psi)(34,000 psi)

Particle Size and Column Performance

Chromatography Stationary PhasesChromatography Stationary Phases

relatively polar surface

O O O | | | O Si O Si O Si O H

| | | O O O | | | O Si O Si O Si O H

| | | O O O

bulk (SiO2)x surface

relatively nonpolar surface

Silica Gel

O O O | | | O Si O Si O Si O R

| | | O O O | | | O Si O Si O Si O R

| | | O O O

bulk (SiO2)x surface

Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37

hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv.

silica or “C18”)

“normal phase” “reversed phase”

Bonded PhasesBonded Phases

• C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN

• C-18C-18 Octadecyl SilylOctadecyl Silyl -Si-(CH -Si-(CH22))1717--

CHCH33

•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3

P P

C18 Phase designed to retain very polar compounds

C18 Phase designed to retain very polar compounds

Si-O-Si-(CH2)17-CH3

CH3

CH3

Protection of Siloxane Bonds With Bulky Alkyl Groups

Monolithic Silica RodsIncreased Flow Rates with Excellent Resolution

HPLC Detectors

• To detect the separated analytes

An ideal Detector:• UNIVERSAL (i.e. detects everything)• SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes)• LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between

intensity of response and amount of analyte).• give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the

analyte is, even if you didn’t know beforehand).


DETEKTORDETEKTORPada umumnya detektor KCKT bersifat

“ Blind and Differential “ kecuali FT-IR dan MS yang berfungsi sebagai pengana-

lisis yang spesifik, sedangkan KCKT bersifat pemisah selektif pada instrumen terpadu “hyphenated instrument” :

LC-MS atau LC / FT-IR


MACAM DETEKTOR KCKTMACAM DETEKTOR KCKT


PERSYARATAN DETEKTOR KCKTPERSYARATAN DETEKTOR KCKT• Sensifitas yang tinggi sampai ng, pg atau fg.• Memberikan tanggap kulitatif secara universal

atau spesifik terhadap analit yang ditentukan.• Memberikan tanggap kuantitatif.• Volume mati ( “ Death Volume “ ) yang kecil.• Tidak bersifat destruktif ( kecuali pada LC-MS ).• Tidak peka terhadap perubahan temperatur kecuali

detektor Fluorescence dan Refractive Index .• Mudah didapat, kecuali detektor Radio aktif.

HPLC DetectorsHPLC Detectors

• UV-Vis Detector• Photodiode array Detector (PDA = DAD)• Refractive Index Detector (RID)• Fluorescence Detector (FLD)• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)• Electrochemical Detector (ECD)• Conductivity Detector• Radiometric Detector

Hyphenated Systems• LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR

HPLC DetectorsHPLC Detectors• UV-Vis

– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)– Can be used with gradient elution– Requires chromophore

• Refractive Index– Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)– Isocratic only– Nearly universal detection

• Evaporative Light Scattering– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105); – Non-linear calibration required– Can be used with gradient elution– Nearly universal detection

UV-Vis DetectorUV-Vis Detector• Paling banyak digunakan• Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow

cell• Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat

bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit)

• 190 – 600nm• Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan

sensitivitas pada daerah visibel.• Macam UV-Vis:

– Fixed wave length– Variable wave length– Multiple variable wave length– Photo diode-array


DETEKTOR UV - VISDETEKTOR UV - VIS

1.FIXED WAVELENGTH ( FW )

= 254 nm dan = 280 nm

2.VARIABLE WAVELENGTH ( VW )

= analytical

3. MULTIPLE WAVELENGTH ( MW )

= analytical, confirmation,reference

4. PHOTO DIODE ARRAY ( PDA )

= 190 nm – 650 nm ( full scale )

UV-Vis DetectorUV-Vis Detector

Lamp

Grating

Flow cell

Reference diode

Sample diode

Cut-off filter

Holmium oxide filter

Slit

Mirror 2

Mirror 1

UV-VIS Diode Array Detector

PDAPDA

• Disebut juga diode array detector• Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang terelusi• Mampu melakukan identifikasi peak• Sensitivitas detektor lebih rendah pada model

terdahulu tetapi pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi

• PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with 512-1,024 diode (or pixels) mampu resolusi spektro 1 nm.

PDAPDA

• Dengan software pengevaluasi spektra dapat menampilkan kromatogram dan spektra sampel

• Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity)

• Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.

Overlay spectraOverlay spectra

nm200 250 300 350 400

Peak Purity test: HPLCPeak Purity test: HPLC

• Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic reference material) dengan diode array detector overlay

Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS)

• Pengukuran spektra pada “upslope,

apex dan down slope”• Peak harus “pure”

Match FactorMatch Factor

• MF = 1000 r = 1 100% pure peak• MF > 990 pure• MF < 900 not pure• 900 < MF < 950 contaminated

Pure and Impure HPLC peaks

• Peak purity tests can also be evaluated with

– The 3D-spectra of Photodiode array detectors

– Mass spectrometry

Comparison by 3 Point SpectrumComparison by 3 Point Spectrum

Acetyl Salicylic Acid

down slope

up slope, peak top

Refractive indexRefractive index

• Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel yang mengandung analit yang terelusi dengan sel pembanding.

• Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug) • Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan

umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll.

• Detektor standar untuk GPC• Tidak dapat digunakan untuk gradien

Refractive Index Detector

Evaporative Light Scattering Detector

Mass Spectrometer (MS)Mass Spectrometer (MS)

• MS works by ionizing molecules then sorting and identifying the ions according to their mass-to-charge (m/z) ratios.

• Two key components in this process: 1. ion source generates the ions, 2. mass analyser sorts the ions.

• ESI: Electrospray ionization• MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ionization• APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization

LC-MS LC-MS

HPLC• Providing best separation,• But unable to identify the

components unequivocally

MS• Providing Mass spectra of

compounds specific for identification

• Identification much more difficult (or impossible) for a component of mixture

LC-MS/MSLC-tandem MS = MSn

LC-MS/MSLC-tandem MS = MSn

Mass Spectrometer Mass Spectrometer

MALDIElectrospray ionization (ESI)

Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)

FABEI

Single quadrapole (SSQ)Triple quadrapole (TSQ)Quadrapole ion trapTime-of-flight (TOF)Fourier Transform (FTMS)Magnetic sector

HPLC Ionization Source

Mass Analyzer

Detector

Ionization sourceIonization source

• Coverts analytes of interest to gas phase ions• ESI: Electrospray ionization• MALDI: Matrix-assisted laser

desorption/ionization• APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization

ESI

APCIAPCI

Common Types of AnalysersCommon Types of Analysers

• Quadropole• Ion trap• Triple quadrupole• Time of Flight• Fourier transform MS (FTMS)

LC-MSLC-MS

CID: Collision Induced Dissociation

Q1: single Quaduprole

Triple Quaduprole LC-MS/MSTriple Quaduprole LC-MS/MS

LC-MS/MSLC-MS/MS

TIC: Total Ion Chromatogram Mass Spectra

Equipment

SupportService

Your HPLC Success

Your HPLC success depends onYour HPLC success depends on

• The suitability of the equipment you buy• Your ability to keep it up and running (or find

someone else who will service it)• The support you receive, starting out in new

directions or in solving problems that come up

Systematic TroubleshootingSystematic Troubleshooting

• All of the components of HPLC or LC-MS/MS can have problems require troubleshooting

• “An ounce of prevention is worth a pound of cure”

• The best troubleshooting strategy is to prevent problems from occurring by exercising best practices in daily HPLC operation.

Common HPLC ProblemsCommon HPLC Problems

• Problems are caused by component malfunction (Pump, degasser, injector, data system, column)

• Faulty preparation of mobile phase or sample preparation

• Problems can be categorized into several areas: Pressure problemsBaseline problemsPeak problemsData performance problems

Baseline ProblemsBaseline Problems

Problems and possible causes

Problems and possible causes

Kasus Kebocoran

a. Kondisi normal

b. Flow rate menurun peak melebar, tinggi peak naik

c. Efek = B, tinggi peak turun

d. Peak I lebih ramping dan pendek

Experience is the best teacher

Points to be considered for maintenance

• Pump– check a leak of plunger seal– wash a behind plunger seal for buffer

• Injector– wash an injection port after every injection– select a suitable washing solvent

• Column– do not keep a buffer solution

• Detector– check a life time of lamp or electrode

Module Performance attributes General Expectation Frequency

Pump Flowrate accuracyGradient accuracyPressure test

±2%±1%No leak

6 months6 months6 months

Injector PrecisionLinearityCarry over

1% RSDr > 0.999< 1%


Detector Wavelength accuracyLinearity of responseNoise and drift

±2nmr > 0.999Noise: 10-5 AUDrift: 10-4 AU/h


Column compartment

Temperature accuracy ±2% 6 months

Performance verification of HPLC

Pemeliharaan kolomPemeliharaan kolom

• Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel

• Simpan kolom RP dalam pelarut CAN atau metanol atau campuran air dan pelarut organik

• Tutup ujung kolom bila tida dipakai• Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan• Gunakan guard column (jika bekerja dengan sampel-

sampel kotor)• Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang

diperbolehkan (pH 2.5 – 8). Kolom modern (pH 1.5-10)• Jangan bekerja pada temperatur tinggi

Regenarasi kolomRegenarasi kolom

• Urutan flushing untuk kolom RP HPLC:– Water– Methanol– CH2Cl2– Methanol

SYSTEM SUITABILITY TESTS

• System suitability is an integral part of many analytical procedures.

• The tests are based on the concept, that the equipment, electronics, analytical operations and samples to be analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such.

[ System Suitability Parameters ]– Capacity Factor ( k' )– Precision/Injection Repeatability ( RSD )– Relative Retention (α)– Resolution ( Rs )– Tailing Factor ( T )– Theoretical Plate Number ( N )

SYSTEM SUITABILITY SYSTEM SUITABILITY PARAMETERSPARAMETERS

［［ Determination and Standards of ParametersDetermination and Standards of Parameters ］］ Capacity Factors ( k' )

k' = ( ｔＲ－ｔ０ ) / ｔ０ k' ＞２

Precision/Injection Repeatability ( RSD ) ≧ｎ５ RSD≦１％

Relative Retention (α ) α = k'1 / k'2

• There is not an essential parameter as long as the resolution( Rs ) is stated.

Resolution ( Rs ) Rs = ( ｔＲ 2 －ｔＲ 1) / (1/ ２ )( ｔＷ 1 ＋ｔＷ 2) Rs≧２

Tailing Factor ( T ) T = Ｗ x / ２ｆ T≦２

Theoretical Plate Number ( N ) N =１６ (ｔＲ /ｔＷ )2 = Ｌ /Ｈ N ＞２０００

Solventpeak

SolventtailA

ir p

eak

Inje

ctio

n

tW1 tW2tR1

t0

tR2

Wxf

h

0.05h

SST results are not OKSST results are not OK

• Check the Mobile Phase (pH, Composition)• Flow Rate• Change the Column or regenerate it• Optimization of the mobile phase

Analisis KualitatifAnalisis Kualitatif

• Berdasarkan waktu retensi– tR A = tR B zat A mungkin sama dengan B– tR A tidak sama dengan tR B zat A tidak sama

dengan zat B

• Untuk sampel kompleks tR dipengaruhi banyak faktor gunakan waktu retensi relatif (RRT):– tR analit dibandingkan tR komponen pembanding

dalam sampel

• Penambahan zat standar ke dalam sampel • Data spektra dari PDA (match factor) atau MS


QUALITATIVE ANALYSIS

• Compare Retention Times• Spike Sample with Standard• Collect and analyze• Use “Hyphenated” Technique : LC – MS• Use a Diode Array Detector• Use Peak Ratios at Different Wavelengths

Quantitative AnalysisQuantitative Analysis

• Normalization method• External standard method• Internal standard method• Standard addition method


ANALISIS KUANTITATIF MULTI KOMPONEN PADA KCKT

1. NORMALISASI AREA2. NORMALISASI AREA DENGAN

FAKTOR RESPON (TANGGAP) DETEKTOR.

3. DENGAN STANDAR EKTERNAL4. PENAMBAHAN STANDAR

INTERNAL.


QUANTITATIVE ANALYSISPeak Height or Area Chromatogram

Peak height unaffected by flow variations.Peak area should be used for badly tailing peaks.Both are imprecise with irreproducible injection volume

Quantitation by Normalization MethodQuantitation by Normalization Method

All the analytes present in the sample must elutes from the column, with enough resolution and, furthermore

have to be detected by the available detector.

The peak area is proportional to the weight of the analytes having passed through detector cell

The analytical signals lies within the linearity ranges

Thus,

Percentage in weight of each analyte mi = KiAi

so % i = Ai / Ai X 100

Quantitation by External StandardQuantitation by External Standard

This method is the most general method for determining the concentration of an analyte in samples

It involves the construction of a calibration plot (Area or height vs. Analyte concentrations) by using some concentrations (minimum 3-4 concentrations) of external standard; the concentration of the analyte can be determined by “interpolation”. It is not recommended to do “extrapolation”.

Do not forget to test whether the HPLC system is still “OK” by using “system suitable test”

External Standard CalibrationCalculation of Results

Y = aX + ba : SLOPb : Y intercept

2500

[Peak Area]

[Con

cen

trat

ion

]

125 ppm

2500


2. STANDAR EKSTERNAL

3. STANDAR INTERNAL

Prinsip : Semua konsentrasi standar dan sample ditambah standar internal sejumlah yang sama.

Perhitungan dengan cara kurva baku

IS

a

A

A

Cppm

Prinsip : Memakai standar yang sama dengan analit


ANALISIS KUANTITATIF SINGLE KOMPONEN DENGAN KCKT

1. STANDAR ADISI Tidak memungkinkan untuk pemakaian standar internal Hasil analisis dipengaruhi matrik sampel Kadar analit dalam sampel < LOQ (Limit of Quantitation). Prinsip : Sejumlah analit dengan kadar yang diketahui dan

bervariasi meningkat ditambahkan pada sampel (volume sampel sama)

stdstd

sampsamp xC

A

AC .

Kelemahan :Volume terinjeksi harus tepatPengenceran dan penimbangan harus saksama

Disadvantage of external standard calibration method

• Injection error will directly influence the quantitative result.

10 uL injection 11 uL injection

100 ppm100 ppm 110 ppm110 ppm

Advantage of internal standard calibration method

• Injection error can be eliminated.

2000 / 1000 = 22000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 22200 / 1100 = 2

10 uL injection 11 uL injection

11001100 22002200

IS10001000 20002000

IS TT

Disadvantage of internal standard calibration method

• Separation is slightly difficult.

ISISTT

TTISIS TTISIS

Disadvantage of internal standard calibration method

• It is difficult to find the IS compound.– The chemical structure of IS compound is

similar with one of target compound.– IS sample is not existent in the actual sample.

Calibration Method

• External standard calibration– Separation is not difficult– Injection error will directly influence the quantitative

result• Internal standard calibration

– Injection error can be eliminated– Recovery in the pretreatment procedure can be

estimated– Separation is slightly difficult– Difficult to look for the IS compound

Cara Berlaboratorium yang BaikCara Berlaboratorium yang Baik

• Good Laboratory Practices• ISO 17025 diadopsi di Indonesia menjadi SNI

19-17025• Laboratorium harus memiliki sistem mutu, yakni:

– Kebijakan mutu– Panduan mutu (SOP = standard operating procedure)– Instruksi Kerja– Form

Catat apa yang dilakukan dan lakukan apa yang tercatat

ISO 17025ISO 17025

• Kualifikasi personil• Validasi metode• Kualifikasi instrumen (kalibrasi alat)

29042013 GAS KROMATOGRAFI 121

8-kuliah hplc2rev-2013

Documents