LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA

OLEH :

KELOMPOK C5 (SHIFT 3)

Ghinada Rafny Shafira (172010101008)

Maidy Frista Rosanti (172010101025)

Moh. Nur Indra Caesar (172010101026)

Roan Pratama Putra(172010101028)

Ridhotullah Istaz Maulana S. (172010101068)

Dita Rahmania (172010101082)

Moh. Batchiar Adam (172010101130)

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS JEMBER

2018

JUDUL PRAKTIKUM: Pengukuran Kadar Glukosa

WAKTU DAN TEMPAT: Kamis, 8 Maret 2018 di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Jember

DASAR TEORI

Glukosa merupakan monosakarida yang utama dan ada di dalam darah. Glukosa yang ada di dalam darah berasal dari makanan yang masuk ke dalam tubuh yang mengandung karbohidrat, dan juga hasil dari proses glikogenolisis, dan glukoneogenesis. Kadar glukosa normal berkisar antara 50-150 mg/dl. Agar kadar glukosa darah tetap normal, tidak kurang ataupun lebih, tubuh melibatkan berbagai hormon meskipun tubuh dapat memperoleh energi melalui oksidasi bahan selain glukosa. Salah satu alasannya adalah karena sel saraf dan eritrosit hanya bisa menggunakan glukosa sebagai sumber energi.

Diabetes millitus (DM) merupakan kelainan metabolik yang ditandai dengan peningkatan kadar glukosa darah, dan hari demi hari penderita DM semakin meningkat. Padahal, DM dapat menimbulkan komplikasi yang cukup luas mulai dari ujung rambut sampai ujung kaki, baik komplikasi secara akut maupun kronis. Kadar glukosa darah merupakan indikator yang baik untuk memonitor terapi pada penderita DM, sehingga pengukuran kadar glukosa darah sangat perlu dan disarankan dilakukan secara rutin. Pengukuran kadar glukosa darah dapat dilakukan dengan cara o-toluidin dan cara enzimatik menggunakan enzim glukooksidase.

Insulin merupakan hormon yang penting dalam mengatur kadar glukosa darah. Insulin merupakan suatu polipeptida (hormon protein) dengan dua rantai asam amino  yang dihubungkan oleh jembatan disulfida. Insulin diproduksi di ribosom sel--pankreas yang akan membentuk proinsulin. Kemudian, insulin  akan mengalami proses pematangan, dikemas dan disimpan dalam ganula-ganula di aparatus golgi. Insulin dikeluarkan dari ganula-ganula dengan cara eksositosis. Ganula-ganula tersebut bergerak ke  dinding sel melalui suatu proses yang melibatkan mikrotubulus, kemudian membran ganula berfusi dengan membran sel dan terjadilah sekresi insulin.

Struktur porcine insulin yang merupakan satu rantai polipeptida yang panjang, susunan asam-asam amino dari proinsulin adalah susunan polipeptida B yang pada ujung karboksilnya disambung melalui polipeptida yang terdiri dari 33 asam amino pada ujung amino dari polipeptioda A.

Insulin terdiri dari dua rantai polipeptida yaitu rantai A dan rantai B. Pada rantai A terdapat ikatan disulfida yang menghubungkan sistein. Pada manusia rantai A terdiri dari 21 asam amino, rantai B terdiri 30 asam amino. Dalam bentuk kristal, insulin akan mengikat Zn ditengah polimer. Antara rantai A dan rantai B terdapat dua ikatan disulfida, yang menghubungkan sistein. Akibat anaktivasi insulin, alkali ataupun senyawa pereduksi akan memutuskan ikatan disulfida. Enzim-enzim proteolitik akan mencernakkan insulin yang diberikan secar per oral.

Sekresi insulin sebanding dengan kadar glukosa darah (KGD), sehingga pada saat KGD tinggi, sekresinya juga akan meningkat, begitu pula sebaliknya. Insulin juga dapat menurunkan kadar glukosa darah dengan cara mempercepat transportasi glukosa dari darah ke dalam sel dengan bantuan reseptor insulin yang terdapat di permukaan sel target. Insulin juga mempercepat penurunan KGD dengan cara: (1) merangsang perubahan glukosa menjadi glikogen (glikogenesis) dan asam lemak (lipogenesis); (2) menghambat pembentukan glukosa dari glikogen (glikogenolisis) dan senyawa-senyawa nonkarbohidrat (glukoneogenesis). Jadi, sekresi insulin dipengaruhi KGD dan berperan penting pada pengendalian KGD.

Stimulasi reseptor insulin akan mengaktifkan tyrosine kinase yang ada pada sub unit Bdari reseptor insulin, sehingga terjadi proses fosforilase pada tirosin. Tirosinterfosforilasi akan merangsang aktivitas beberapa protein intraseluler dalam jalur signaling insulin. Sebagai hasil rangkaian aktivasi, glukosa transporter akan bergerak ke arah membran untuk memasukkan glukosa yang ada dalam darah, akibatnya terjadi penurunan KGD. Glukosa darah yang masuk ke dalam sel selanjutnya akan mengalami proses glikolisis atau disimpan terutama di otot dan di hati, melalui proses glikogenesis.

Preparat insulin yang tersedia di antaranya adalah:

1. Short acting insulin

Antara lain: regular insulin, crystallin zinc insulin, semilente insulin.

1. Long acting insulin

1. Protamin zinc insulin (PZI). Kombinasi insulin dengan protamin. Penyerapannya lambat. Penurunan glukosa darah lebih dari 24 jam.

1. Ultra lente insulin merupakan slow acting insulin. Kristal besar dengan adanya konsentrasi yang tinggi dari asetat dan Zn. Onset dan duration pelan.

1. Intermediate acting insulin

2. Lente insulin: campuran ultralente insulin dengan regular insulin dengan perbandingan 7:3

2. Globin insulin : gabungan insulin dengan protein (globin). Efek antara regular insulin dan PZA (duration antara 12-15 jam)

Tubuh kita memiliki organ yang mempunyai peran yang penting dalam mengendalikan kadar glukosa darah, yaitu ginjal. Glukosa dapat melalui filter glomerulus, tetapi direabsorpsi kembali ke peredaran darah melalui tubulus ginjal. Kemampuan tubulus untuk mereabsorpsi glukosa terbatas (sekitar 350 mg/menit). Pada seseorang yang mengalami peningkatan kadar glukosa darah, kadar glukosa yang mencapai tubulus juga meningkat. Jika jumlah glukosa dalam tubulus melebihi kemampuannya untuk merebsorpsi, sisa glukosa akan dibuang bersama urine. Keadaan ini disebut dengan glikosuria.

Dalam pemeriksaan dan mengukur kadar glukosa sendiri, terdapat 2 cara yaitu melalui darah (serum) dan melalui urin. Untuk pengukuran melalui darah atau serum, kita harus mengetahui persamaan reaksi yang terjadi pada pengukuran kadar glukosa serum, yaitu:

(GOD)Glukosa + O2 + H2Oasam – glukosat + H2O2

(POD)2 H2O2 + 4 – amino phenazone + phenol quinoneimine + 4 H2O

GOD = Glukosa Oksidase

POD = Enzim Peroksidase

Dalam pengambilan sampel darah perlu diperhatikan juga berbagai persiapan yang perlu diberitahukan secara baik dan mendetail pada penderita atau uji coba, antara lain :

1. Persiapan pasien untuk pengambilan spesimen pada keadaan basal/dasar:Untuk pemeriksaan tertentu pasien harus puasa selama 8 – 12 jam sebelum diambil darah.

2. Pengambilan spesimen sebaiknya pagi hari antara pukul 07.00 – 09.00.

3. Menghindari obat-obatan sebelum spesimen di ambil.

· Untuk pemeriksaan dengan spesimen darah, tidak minum obat 4-24 jam sebelum pengambilan spesimen.

· Untuk pemeriksaan dengan spesimen darah, tidak minum obat 48-42 jam sebelum pengambilan darah.

· Apabila pemberian pengobatan tidak memungkinkan untuk di hentikan, harus di informasikan kepada petugas laboratorium.

4. Menghindari aktifitasfisik/olahraga sebelum spesimen di ambil.Aktifitas fisik berlebihan akan menyebabkan terjadinya perubahan pada komponen darah dan spesimen lain, sehingga dapat mempengaruhi ke paramater yang akan diperiksa.

5. Memperhatikan efek postur.Untuk menormalkan keseimbangan cairan tubuh dari posisi berdiri ke posisi duduk, dianjurkan pasien duduk tenang sekurang-kurangnya 15 menit sebelum di ambil darah.

6. Memperhatikan variasi diurnal ( perubahan kadar analit sepanjang hari). Pemeriksaan yang di pengaruhi variasi diurnal perlu di perhatikan waktu pengambilan darahnya, antara lain pemeriksaan ACTH, renin dan aldosteron.

Pada pengukuran ini juga diperlukan spektofotometer untuk mendapatkan nilai absorbansi dari sampel tersebut.

Dalam pengukuran glukosa urin, sampel urin akan diberi benedict atau fehling sehingga glukosa dapat bertindak sebagai reduktor. Kita perlu pula untuk mengetahui reaksinya, yaitu:

Cu2O + Glukosa CuO (endapan merah bata)

Akan tetapi, reduksi positif tidak selalu berarti pasien menderita Diabetes Melitus. Hal ini dikarenakan pada penggunaan cara reduksi dapat terjadi hasil positif palsu pada urin yang disebabkan karena adanya kandungan bahan reduktor selain glukosa. Bahan reduktor yang dapat menimbulkan reaksi positif palsu tersebut antara lain : galaktosa, fruktosa, laktosa, pentosa, formalin, glukuronat dan obat-obatan seperti streptomycin, salisilat, dan vitamin C. Oleh karena itu perlu dilakukan uji lebih lanjut untuk memastikan jenis gula pereduksi yang terkandung dalam sampel urine. Hal ini dikarenakan hanya kandungan glukosa yang mengindikasikan keberadaan penyakit diabetes.

1. PENGUKURAN KADAR GLUKOSA SERUM

Metode

GOD-PAP: enzimatic photometric test

Prinsip

Menentukan kadar glukosa serum setelah direaksikan dengan enzim glucose oksidase. Quinoneimine menjadi indikator reaksi kolorimetri, yang terbentuk dari 4-aminoantipyrine dan phenol pada reaksi yang dikatalisis oleh enzim peroksidase.

Reagen

Komponen dari reagen:

1. buffer phospate

2. phenol

3. 4-aminoantipyrine

4. glucose oxidase

5. peroxidase

Spesimen

Serum atau plasma. serum dapat digunakan paling lambat dalam waktu 1 jam setelah pengambilan sampel. jaga serum tetap bersih, serum terkontaminasi hrs dibuang

Cara Kerja

1. Tiga buah tabung reaksi ukuran 5 ml, masing-masing diberi label RB (Reagen Blanko), STD (Reagen Standar), dan SPL (Reagen Sampel)

2. Tabung RB diberi 1000 uL reagen GOD-PAP.

3. Tabung STD diberi 10 uL reagen standar glukosa dan ditambah dengan 3000 uL reagen GOD-PAP , dicampur hingga homogen.

4. Tabung SPL diberi 10 uL serum dan ditambah dengan 1000 uL reagen GOD-PAP, di campur hingga homogen.

5. Tabung SK di beri 10 uL serum kontrol dan ditambah 3000 uL reagen GOD-PAP, di campur hingga homogen.

6. Masing-masing di inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar.

7. Absorbansi (DA) standar dan Abs sampel di ukurterhadap reagen blanko (RB) dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 546 nm.

 

RB 

STD 

SPL 

Sample (ul)

 

 

10 

Standar (ul) 

 

10 

 

Reagen 

1.000 

1.000 

1.000 

Campur, inkubasi 20 menit (20-25 0C) atau 10 menit pada suhu 37 0C, kemudian ukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 546 nm Abs standar (STD), sampel (SPL), terhadap blanko reagen (RB) dalam 10 menit.

Perhatian: mahasiswa hanya mengerjakan pengukuran glukosa sampel (SPL)

Perhitungan nilai

Nilai referensi

Anak-anak (puasa)

Umur 1 – 6 tahun

74 – 127

Umur 7 – 19 tahun

70 – 106

Dewasa (puasa)

Glukosa darah vena

70 – 115

2. PENGUKURAN KADAR GLUKOSA URINE

Glukosa dapat bertindak sebagai reduktor. Jika senyawa yang mudah menerima elektron (oksidator) direaksikan dengan glukosa dapat terjadi reaksi oksidasi reduksi. Sebagai contoh oksidator misalnya Cu++ pada CuSO4 yang berwarna biru. Cu++ akan direduksi oleh glukosa menjadi Cu+ dalam bentuk Cu2O yang berupa endapan berwarna merah bata, sedangkan glukosanya dioksidasi menjadi asam glukonat. Makin tinggi kadar glukosa, maka warna merah bata yang terbentuk akan makin kuat.

Reagen yang dipakai pada praktikum ini meliputi:

1. Reagen benedict

1. Larutan glukosa

1. Larutan vitamin C

Prosedur pengukuran kadar glukosa urin adalah sebagai berikut:

1. Ambil 5 tabung reaksi, beri tanda U, G1, G2, C1 dan C2.

1. Isilah masing-masing tabung reaksi dengan 2-3 ml reagen benedict

1. Tambahkan pada:

Tabung U : 1 ml urine

Tabung G1: 1 ml urine + 1 tetes larutan glukosa

Tabung G2: 1 ml urine + 5 tetes larutan glukosa

Tabung C1: 1 ml urine + 1 tetes larutan vitamin C

Tabung C2: 1 ml urine + 5 tetes larutan vitamin C

1. Panaskan di atas api sampai mendidih

1. Amati hasilnya

HASIL DAN PEMBAHASAN UJI GLUKOSA DARAH

Pengambilan serum dilakukan pada pukul 9.15. Setelah melakukan analisis pengukuran denganmenggunakan spektofotometer , kelompok kami mendapatkan bahwa nilai absorbsi sampel yang kami uji adalah 0,461. Sedangkan untuk nilai absorbsi standart didapatkan nilai absorbansi sebesar 0,507 serta 0,262 untuk nilai absorbansi larutan blanko.

Kelompok C5

Abs SPL: 0,461Abs STD: 0,507Abs RB: 0,262Nilai Standart = 100

Kadar Gula dalam Darah (mg/dl)= x Nilai Standart

= x 100

= x 100

= 0,812 x 100

= 81,2 mg/dl

Kelompok A5 :

Abs SPL: 0,398Abs STD: 0,507Abs RB: 0,262Nilai Standart = 100Kadar gula darah = 55,282 mg/dl

Kelompok B5

Abs SPL: 0,410Abs STD: 0,507Abs RB: 0,262Nilai Standart = 100Kadar gula darah = 60,4 mg/dl

Kelompok kami (C5) pada shift ke-3 sedikit memiliki perbedaan hasil dengan kelompok A5 (shift 1) dan kelompok B5 (shift 2). Hal ini dikarenakan saat akan memulai shift ke-3, serum dilakukan sentrifuge kembali dikarenakan serum sudah tidak jernih lagi. Hal ini dapat mempengaruhi hasil kadar gula dalam darah sampel.

Dengan hasil dan penghitungan kelompok kami, kelompok C5, didapatkan hasil 81,2 mg/dl. Pasien yang diambil darahnya merupakan mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Jember Angkatan 2017 yang berpuasa (6 orang) yang memiliki rata-rata umur antara 17-20 tahun. Sehingga dengan hasil kadar gula dalam darah 81,2mg/dl, pasien pemilik serum tersebut memiliki kadar gula darah yang normal sesuai dengan nilai referensi yang ada pada petunjuk praktikum.

Nilai referensi

Anak-anak (puasa)

Umur 1 – 6 tahun

74 – 127

Umur 7 – 19 tahun

70 – 106

Dewasa (puasa)

Glukosa darah vena

70 – 115

Dengan menganalisis hasil dan penghitungan kelompok A5 dan B5, kadar gula dalam darah tersebut idak mencapai angka 70 mg/dl (A5 = 55,282 mg/dl, B5 = 60,4 mg/dl). Hal ini terjadi kemungkinan dikarenakan akibat serum darah yang tidak jernih, sehingga mempengaruhi hasil tes yang dilakukan. Kemungkinan yang kedua dikarenakan perbedaan waktu inkubasi yang tidak sama, yaitu lebih atau kurang dari 20 menit. Hal ini juga dapat menjadikan hasil yang tidak sama akurat.

Glukosa dapat ditentukan kadarnya secara enzimatik, yaitu dengan cara penambahan enzim glukosa oksidase (GOD), pada percobaan ini menggunakan pereagen GOP-PAP. Warna absorbansi metode enzimatik intensitasnya pada λ= 546 nm dengan warna merah (dari H2O2 yang terbentuk ditambah dengan peroksidase.) Glukosa dioksidasi oleh oksigen dengan katalis GOD akan membentuk asam glukonik dan hydrogen peroksida (H2O2). Enzim peroksidase (POD) akan mengakibatkan H2O2 melepas O2 yang akan bereaksi dengan 4-amino antipyrin/phenazone dan fenol, menghasilkan quinoneimine dan air. Quinoneimine inilah yang menjadi indikator kadar glukosa dalam darah. Sehingga apabila kadar glukosa tinggi, H2O2 menjadi tinggi, quinoneimine juga menjadi tinggi, sehingga nilai absorbansi pada spektofotometri juga tinggi.

HASIL DAN PEMBAHASAN UJI GLUKOSA URIN

Tabel hasil pengukuran kadar glukosa pada urin adalah sebagai berikut :

U

Biru sedikit kehijauan

Negatif (-), urine normal

G1

Hijau kekuningan keruh atau hijau keruh

Positif (+)

G2

Kuning keruh

Positif (++)

C1

Hijau kekuningan keruh atau hijau keruh

Positif (+)

C2

Kuning keruh

Positif (++)

Perubahan warna yang terjadi pada masing-masing tabung reaksi dikarenakan adanya sifat glukosa yang bertindak sebagai reduktor pada larutan benedict (CuSO4).Larutan benedict mengandung tembaga alkalis (basa) yang pada awalnya berwarna biru, apabila dipanaskan dan ditambahkan glukosa menyebabkan terjadinya perubahan warna pada benedict menjadi hijau, kuning, jingga, sampai merah . Hal ini karena glukosa mereduksi ion Cupri (Cu2+) pada benedict menjadi Cupro (Cu+) dalam bentuk Cu2O yang berupa endapan berwarna merah. Semakin tinggi kadar glukosa maka warna merah bata yang terbentuk semakin kuat atau semakin gelap. Karena pada prinsipnya, semakin kuat sifat reduktor maka endapan yang terbentuk juga semakin banyak. Sementara itu, vitamin C merupakan zat non-gula yang memiliki sifat sama dengan glukosa yaitu bertindak sebagai reduktor, sehingga adanya penambahan zat tersebut juga dapat menyebabkan perubahan warna dan terbentuknya endapan pada urine. Itulah sebabnya pada penambahan satu tetes glukosa atau vitamin C akan menunjukkan warna yang hampir sama, begitupun juga pada penambahan lima tetes glukosa atau vitamin C.

Pada kondisi urine normal jika ditambah dengan larutan benedict, tanpa penambahan glukosa atau vitamin C, akan tetap mempertahankan warna benedict yaitu biru atau biru kehijauan. Apabila tetap menyebabkan perubahan warna pada urine (hijau, kuning, jingga, sampai merah), berarti urine tersebut mengandung glukosa.

KESIMPULAN DAN SARAN

Metabolisme karbohidrat dibantu oleh berbagai macam hormone dan enzim. Gangguan pada proses metabolism karbohidrat dapat berakibat fatal bagi kesehatan. Gangguan ini dapat dilihat dari kadar gula darah pasien.Regulasi kadar gula darah dibantu oleh hormone insulin. Semakin tinggi kadar glukosa darah, insulin akan disekresikan dalam kadar yang tinggi juga demi menjaga homeostasis. Selain insulin terdapat hormone glucagon yang berperan berlawanan dengan insulin.Pada percobaan, glukosa bersifat sebagai gula pereduksi sehingga akan mengakibatkan reduksi benedict dan menghasilkan endapan. Vitamin C juga memliki peran yang sama dengan glukosa yakni sebagai pereduksi benedict.

SARAN

Dalam melakukan praktikum diharapkan peneliti melaksanakan sesuai prosedur serta berhati-hati dalam menggunakan serum darah agar endapan dan cairan diatasnya tidak tercampur kembali.

DAFTAR PUSTAKA

Dawn. B, Mark, dkk. Biokimia Kedokteran Dasar. EGC.

LAMPIRAN

(Memasukkan GOD PAP mengguakan mikropipet 1000mikrometer)

(Memasukkan GOD PAP mengguakan mikropipet 1000mikrometer) (Proses menghomogenkan serum dengan vortex)

(Hasil spektofotometri) (Sampel serum)