university 2008 sarjana biologi medik, universitas ... sars cov 2 dengan rea… · pusat biomedis...

Pekerjaan

2005-

sekarang

Pusat Biomedis dan Teknologi Dasar kesehatan,

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

Pendidikan

2013 Master of Biomedical Science (by Research), Monash

University

2008 Sarjana Biologi Medik, Universitas Nasional

2004 D3 Analis Kesehatan, Poltekkes Jakarta III

Pelatihan/Scentific Conference

2019 Training in Cell Culture, Isolation and

Characterization of Influenza Viruses, Jakarta.

2017 TOT Pengelolaan Kesehatan Terpadu, BBPK Ciloto

2016 Option IX for the Control of Influenza, Chicago, USA

2014 16th International Congress of Infectious Diseases,

Cape Town, South Africa

2010 7th HKU-Pasteur Virology Course on Influenza and

Other Emerging Respiratory Viral Infection, HKU-

Pasteur Research Center, Hong Kong, China.

[email protected]

Agustiningsih,

SSi,

MBiomedSc

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

PUSLITBANG BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN

BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

Webinar PATELKI IIJakarta, 18 April 2020

Deteksi SARS-CoV2 dengan

Realtime PCR


• Single stranded RNA virus

• Genome terdiri dari ≥27.000 basa

• Zoonosis

• Tipe virus Alfa dan Beta menyebabkan penyakitpada manusia

• SARS-CoV-2 memiliki 96% kesamaan asam nukleatdengan coronavirus padakelelawar (RaTG13)

Coronaviruses (CoVs)

Perlman, et al., Nat Rev Microbiol 7, 439–450 (2009)

Zhang et al., Current Bilogy 30, 1346-1351 (2020)


SARS-CoV2

• Severe Acute Respiratpry Syndrome-

Coronavirus 2

• Etiologi dari COVID-19

• Ditularkan melalui droplet

• Saluran pernafasan sebagai jalur penularan

• Masa inkubasi : 1-14 hari sejak paparan infeksi

(umumnya 5 hari)

• Gejala umum : gejala gangguan pernafasan

akut seperti demam, batuk, sesak nafas


Metode Pemeriksaan

• Rapid Test

• Molecular test : Polymerase Chain Reaction

• Immunofluorescence Assay

• Test Serologi

• Kultur virus


Pre Analitik46-68%

Post

Analitik

18-47%

Analitik

7-13%

Proporsi Kesalahan Pemeriksaan

Laboratorium

Plebani, et al.,Clin Chem Lab Med

2006: 44(6): 750-59


Sensitifitas dan Spesifisitas

Pemeriksaan

Sensitifitas dan spesifisitas deteksi virus dalam

spesimen dipengaruhi :

• Jenis pemeriksaan

• Waktu pengambilan spesimen sejak onset

• Kualitas spesimen

• Jenis spesimen

• Penanganan spesimen

• Waktu dari pengambilan spesimen hingga

pemeriksaan


Jenis Spesimen


Viral Transport Medium (VTM)

• Steril

• Larutan Isotonik

• Mengandung Protein

• Mengandung Antibiotik

• Buffer pH

• Indikator (Phenol Red)*

Contoh VTM :

Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Virocult, MEM, UTM, dll


• Di Simpan dalam Freezer -20oC (Dalam kondisi Beku, VTM berwarna Kuning = Normal)

• Dicairkan terlebih dahulu jikaakan digunakan

• Hindari Beku-Cair (Frezze-Thaw) VTM Rusak

• Tidak Bisa digunakan bilaberwarna kuning keruh

Viral Transport Medium (VTM)


Update on WHO Guideline, 31 Maret 2020

Penggunaan Saline Steril


Swab Dacron/Rayon

Alat/Bahan Pengambilan Spesimen


Yang perlu diperhatikan:

• Putuskan tangkai plastik di daerah mulut cryotube agar cryotube dapat ditutup denganrapat

Pengambilan Spesimen Swab


• Cryotube kemudian dililit parafilm.

• Cryotube yang sudah berisi swab dibungkus dalam tissue bersih lalu dimasukan ke dalam plastik klip.

• Simpan dalam suhu 4-8°C sebelum dikirim. Jangan dibekukan dalam Freezer.

Pengambilan Spesimen Swab


Pengambilan Spesimen Sputum

• Container steril spesimen

• Plastik Klip atau Plastik pembungkus container

siapkan

• Sputum di tampung dalam container Steril


• Semua spesimen dikemas untuk mencegah kerusakan dan tumpahan

• Spesimen pasien harus dilakukan tatalaksana sebagai UN3373, "Substansi Biologis, Kategori B", ketika akan diangkut/ditransportasikandengan tujuan diagnostik atau investigasi

• system yang digunakan adalah denganmenggunakan tiga lapis (Three Layer Packaging) sesuai dengan pedoman WHO dan International Air Transport Association (IATA).

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen


Masing-masing spesimen dimasukkan ke dalam plastik klip berisi tissue sebagai absorban secara terpisah (per pasien/spesimen)



MOLECULAR TEST

• Mendeteksi antigen atau materi genetik

virus

• Sensitif dan spesifik

• Cepat

• Memerlukan tahapan persiapan sampel

• Perlu peralatan khusus

• Memerlukan fasilitas lab khusus BSL 2

• Tahapan:

isolasi materi genetik (ekstraksi)

perbanyakan materi genetik (PCR)


Mengisolasi asam nukleat dariberbagai material selular di dalamspesimen

Dilakukan di BSL II

Menghilangkan material penghambat yang tidak diperlukandalam reaksi PCR

Inaktivasi virus (lysis buffer) HARUS dilakukan di dalam BSC (Biosafety Cabinet) II

Ekstraksi RNA Sampel

Lysis

Binding

Wash

Elute

RNA


• Polymerase Chain Reaction

• Perbanyakan DNA spesifik

dengan metoda in vitro dan

enzimatis

• template : DNA

PCR


• deoksiribonukleotida trifosfat

(dNTP)

• enzim termostabil Taq DNA

polimerase

• Ion Mg2+

• Buffer

• Primer Forward

• Primer Reverse

• Template DNA

PCR

Reagensia

Spesifik

Komponen PCR


Tahap 2: AnnealingPenempelan Primer F dan R

30-45 detik, 50°-60°C

Tahap 3: ElongasiPerpanjangan untai DNA baru

oleh Taq Polymerase

1-2 menit, 72°C

Tahap 1: Denaturasids DNA ss DNA

60 detik, 90°-95°C

P

P

Tahapan PCR


235 = 34 milyar copy DNA

Gen Target

Jumlah copy DNA : 2n

n: siklus PCR

Exponential Amplification

Tahapan PCR


• Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, bukan realtime-PCR

• Amplifikasi DNA dengan template RNA

• Terdiri dari 2 tahap:

RT : Reverse Transcription cDNA Synthesis

PCR : DNA Amplification

RT-PCR


• dNTP

• enzim termostabil

Taq DNA polimerase

• Ion Mg2+

• Buffer

• enzim Reverse

Transcriptase

• Primer Forward

• Primer Reverse

• Template : RNA

• dNTP

• enzim termostabil

Taq DNA polimerase

• Ion Mg2+

• Buffer

• Primer Forward

• Primer Reverse

• Template : DNA

PCR RT-PCR

Komponen RT-PCR


2. PCR

1. RT

P

P

Plat-Taq enzyme

RT Reverse Transcriptase

P

Tahapan RT-PCR


Pencampuranreagensia, Primer danRNA/DNA Template

Amplifikasi DNA di dalam Thermal Cycler

Analisis HasilPCR/RT-PCR

Tahapan PCR/RT-PCR


REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

• Teknik amplifikasi (perbanyakan) DNA dimana

produk amplifikasi dapat dianalisis pada setiap

siklusnya dengan menggunakan fluorogenic

probe

• Produk amplifikasi dapat dideteksi sekaligus

dikuantifikasi pada saat proses berlangsung

sehingga tidak memerlukan perlakukan post-

PCR


Real Time

• PCR Buffer (ion Mg)

• dNTPs

• Enzim Reverse Transcriptase

• Enzim Taq Polymerase

• Primer Forward

• Primer Reverse

• Probe

Konvensional

• PCR Buffer (ion Mg)

• dNTPs

• Enzim Reverse Transcriptase

• Enzim Taq Polymerase

• Primer Forward

• Primer Reverse

KOMPONEN MASTER MIX qPCR

Probe : Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk

berhibridisasi dengan sekuen target

5’ 3’


Primer dan Probe SetWHO merekomendasikan beberapa Primer dan Probe Set

dengan beberapa target gen sebagai berikut:


Sinyal fluorescence vs siklus PCR

direkam dalam bentuk kurva amplifikasi.

Hasil akhir berupa nilai Ct yang merupakan

perpotongan antara garis threshold dengan

kurva amplifikasi

Deteksi produk PCR secara otomatis saat proses

amplifikasi berlangsung.

Specimen

Preparation

Thermal

Cycling

Fluorescence

detection

Analysis by

Computer

Semakin banyak DNA copy, semakin awal sinyal terdeteksi semakin rendah nilai Ct

HASIL REAL TIME PCR (qPCR)

inisiasi

eksponensial

plateau


Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal fluorescence yang

terdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam menentukan nilai

threshold cycle (Ct).

Pengaturan threshold manual diletakkan diatas noise atau background kurva

amplifikasi

Threshold

THRESHOLD


• Pemeriksaan RP gene yang merupakan gen yang terdapat di dalam sel epitel manusia

• Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses ekstraksi asam nukleat dan proses pengambilan spesimen telah dilakukan denganbenar

Validasi Hasil


Fasilitas Laboratorium PCR

WHO Laboratory Biosafety Manual 3rd edition, 2004


Alur kerja searah

Area Reagensia Area proses

spesimen

Area Perbanyakan

dan analisa hasil

Pre-PCR PCR

1 2 3

Lay out untuk Lab PCR


Setiap area memiliki alat lab, reagen, bahan habis pakai, dan APD

masing-masing. TIDAK untuk dipindahkan ke ruangan lain


1. Area/ruang reagensia (clean room)

- penyimpanan dan persiapan reagen PCR (master mix) – primer, probes, enzim, buffer

- dilakukan di dalam laminar flow**melindungi bahan reagensia, tidak ada hepa

filter, aliran satu arah

- bebas RNA/DNA, amplikon (DNA hasil PCR), dan spesimen

- area penambahan kontrol negatif



2. Area/ruang proses spesimen

- penatalaksanaan dan penerimaanspecimen klinis

- ektraksi RNA/DNA

- dilakukan di dalam BSC (Biosafety Cabinet)*

*melindungi spesimen, pekerja, ada hepa filter, aliran 2 arah

- pencampuran reagen (ruang reagen) dengan RNA/DNA

- bebas amplikon (DNA hasil PCR)



• Hazard level spesimen pemilihan BSC


Airflow BSC


3. Area/ruang perbanyakan dan analisis DNA/RNA

- mesin PCR konvensional atau Real Time PCR

- terdapat jutaan copi DNA (amplikon) ruangkotor/terkontaminasi amplikon

- deteksi dan analisa hasil dengan gel elektroforesis

- analisa hasil real time PCR



Gambar denah laboratorium PCR Labnas Lt4



Pemilihan Reagensia PCR

• Dipilih berdasarkan kebutuhan

• Perhatikan spesifitas dan sensitivitas

reagensia (terutama bila primer probe dari

manufacture)

• Sesuaikan chemistry reagensia dengan alat

PCR yang ada di lab


Alat dan Kit PCR

Open System Closed System

• Dapat digunakan untuk

seluruh reagen PCR

• Optimasi oleh

pengguna

• Penggunaan terbuka

untuk agen penyakit

yang akan diperiksa

• Penggunaan terbatas

hanya untuk reagensia

yang dibuat oleh

manufaktur yang sama

• Tidak perlu optimasi oleh

pengguna

• Penggunaan hanya untuk

reagensia yang tersedia

di manufaktur

NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENTNATIONAL INSTITUTE OF HEALTH RESEARCH AND DEVELOPMENT

TERIMA KASIH


university 2008 sarjana biologi medik, universitas ... sars cov 2 dengan rea… · pusat biomedis...

Documents