PENGHASILAN SEL PEREMBES INSULIN DARIPADA SEL STEM ADIPOS

MANUSIA UNTUK RAWATAN PENYAKIT KENCING MANIS

MOHAMAD LIZAN BIN MOHAMAD BUANG

TESIS YANG DIKEMUKAKAN UNTUK MEMENUHI SEBAHAGIAN

DARIPADA SYARAT MEMPEROLEHI IJAZAH

SARJANA SAINS PERUBATAN

FAKULTI PERUBATAN

UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA

KUALA LUMPUR

2013

PENGHASILAN SEL PEREMBES INSULIN

DARIPADA SEL STEM ADIPOS MANUSIA

UNTUK RAWATAN PENYAKIT

KENCING MANIS

MOHAMAD LIZAN BIN MOHAMAD BUANG

UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA

ii

PENGAKUAN

Saya akui karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang

tiap-tiap satunya telah saya jelaskan sumbernya

14 Mac 2013 MOHAMAD LIZAN BIN MOHAMAD BUANG

P44697

iii

PENGHARGAAN

Dengan nama Allah yang Maha Pemurah Lagi Maha Penyayang. Bersyukur ke hadrat

Ilahi di atas segala rahmat yang telah dikurniakan olehNya. Dengan izin dan

hidayahNya, penat lelah selama lebih dua tahun kini berjaya dibukukan. Diharapkan

hasil kajian ini akan dapat memperkukuhkan lagi iman kita terhadap keEsaan Allah

S.W.T.

Setinggi-tinggi penghargaan diucapkan kepada Profesor Dr Ruszymah binti Hj

Idrus selaku penyelia utama kepada penyelidikan yang dijalankan ini dan juga kepada

Dr Heng Kien Sing, Dr Aminuddin Saim dan Encik Lee Han Chung selaku penyelidik

bersama. Jutaan terima kasih di atas segala tunjuk ajar, nasihat, teguran dan bantuan

yang diberikan tanpa mengenal erti putus asa. Pengalaman berharga yang diperoleh

sepanjang kajian ini dijalankan bersama kalian tidak akan dilupakan. Ribuan terima

kasih kepada kakitangan dan rakan-rakan sepejuangan di Pusat Kejuruteraan Tisu

PPUKM iaitu Dr Shiplu Chowdry, Encik Shamsul Sulaiman, Cik Manira, Cik Nadia

dan Cik Rohaina yang banyak memberi sokongan moral dan bantuan di kala

diperlukan.

Penghargaan yang tidak ternilai ini turut ditujukan kepada Profesor Madya Dr

Nor Anita Megat Mohd Nordin, selaku Ketua Jabatan dan semua pensyarah,

kakitangan serta rakan seperjuangan di Jabatan Fisiologi PPUKM di atas segala

keprihatinan, tunjuk ajar serta ilmu yang dicurahkan sepanjang menjalani program

kerja kursus Sarjana Sains Perubatan (Fisiologi). Pengalaman berharga semasa

menuntut ilmu bersama kalian akan sentiasa dikenang. Tidak ketinggalan, terima

kasih juga diucapkan kepada pihak Universiti Kebangsaan Malaysia kerana telah

menyumbangkan bantuan kewangan melalui Peruntukan Dana Fundamental PPUKM

(32007001) bagi membolehkan projek ini dilaksanakan dengan jayanya, serta

Kementerian Pengajian Tinggi yang telah menaja yuran pengajian dan kos sara hidup

sepanjang saya berdaftar sebagai pelajar sarjana.

iv

Terima kasih yang tidak terhingga juga ditujukan kepada semua kakitangan

sokongan di PPUKM terutamanya Kakitangan Makmal Endokrin dan Kakitangan

Unit Elektron Mikroskop di atas bantuan dan kerjasama yang diberikan, dan juga

kepada kakitangan Klinik Pembedahan Plastik Nicanor, Petaling Jaya di atas

sumbangan spesimen tisu adipos bagi tujuan penyelidikan.

Penghargaan yang paling istimewa ditujukan khusus buat bonda, Puan Hasimah

binti Tana di atas kasih sayang, dorongan dan doa yang tidak putus-putus diberikan

sepanjang pembelajaran anakanda. Tidak ketinggalan buat nenda, adik-beradik dan

keluarga tersayang. Syukur di atas pertolongan, sokongan, dorongan, doa dan

semangat yang telah dicurahkan selama ini. Akhir sekali, kajian ini saya dedikasikan

khas kepada arwah Hj Tana bin Den (datuk), terima kasih di atas segala pengorbanan

beliau selama ini dan mohon ampun kerana tidak berada di sampingmu pada saat

akhir hidupmu. Terima Kasih semua.

v

ABSTRAK

Diabetes mellitus ataupun kencing manis merupakan salah satu penyakit kronik yang sedang meningkat di seluruh dunia pada kadar yang amat membimbangkan. Walaupun ejen farmakologi dan rumusan insulin semasa telah mencapai tahap pengkhususan yang tinggi, namun sehingga kini tiada penyembuh yang pasti untuk penyakit tersebut. Penambahan semula sel β pankreas yang berkurangan melalui kaedah transplantasi pepulau telah berjaya menawarkan opsyen terapeutik yang efektif untuk penyakit tersebut, tetapi masalah kekurangan jumlah penderma pepulau telah menghalang penggunaannya secara meluas. Untuk menghasilkan sel perembes insulin (IPCs) yang berfungsi, beberapa strategi alternatif telah dipertimbangkan termasuklah penggunaan titisan sel pankreas progenitor, sel stem embrionik (ESCs), sel stem darah tali pusat (UCB-SCs) dan sel stem sum-sum tulang dewasa (BMSCs). Sel stem yang diperoleh daripada tisu adipos manusia (ADSCs), yang telahpun dikenali secara meluas sebagai sel stem mesenkima yang multipoten (MSCs), berkemungkinan boleh menjadi subset bagi sel β yang asli. Dengan bertambahnya kemajuan teknologi pembedahan kosmetik di Asia, sel stem tersebut boleh diperolehi dengan cara yang lebih mudah di dalam kuantiti yang banyak beserta risiko pembedahan yang sangat rendah. Di dalam kajian ini, kami telah mengasingkan sel ADSC manusia daripada tisu lemak abdomen yang disedut dan mengaruhkannya secara in vitro kepada sel IPC dengan menggunakan protokol 2 langkah yang mudah berdasarkan gabungan glukosa yang berkepekatan tinggi, nikotinamida, aktivin A dan peptida-seakan glukagon 1 (GLP-1) bagi tempoh 3 minggu. Semasa proses pembezaan berlaku, perubahan histomorfologi sel stem ke arah pencirian β-pepulau pankreas telah diperhatikan melalui mikroskop cahaya dan mikroskop elektron pancaran (TEM). Pewarnaan ditizon (DTZ) yang bersifat selektif terhadap sel IPC, turut mewarnakan sel pepulau yang baru itu. Penghasilan hormon insulin oleh sel baru telah dianalisa sepenuhnya dengan menggunakan teknik imunocerakin kimipendarcahaya (CLIA) (135 ± 1.7µIU/mL, p = 0.00001) dan cerakin imunoserap terangkai enzim (ELISA) (22.5 ± 0.7µIU/mL, p = 0.0000004), manakala fungsi pengawalaturan hormonnya telah berjaya dibuktikan melalui ujian cabaran glukosa (17.8 ± 0.5µIU/mL, p = 0.0000002). Keputusan awal daripada kajian ini menunjukkan bahawa sel IPC yang diperoleh daripada sel ADSC manusia mungkin boleh digunakan sebagai terapi bagi menyembuhkan penyakit kencing manis pada masa hadapan, akan tetapi beberapa kajian lanjut dan terperinci masih perlu dijalankan bagi menilai implikasi klinikalnya secara menyeluruh.

vi

GENERATING INSULIN-PRODUCING CELLS FROM HUMAN ADIPOSE

TISSUE-DERIVED STEM CELLS FOR THE TREATMENT OF

DIABETES MELLITUS

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a devastating chronic disease which is growing at an alarming rate worldwide. Although current pharmacological agents and insulin formulations have reached a high degree of specificity, until now there is still no definitive cure for the disease. Replenishment of the deficient pancreatic β cells via islet transplantation has successfully offered a potential therapeutic option for the disease, but the scarcity of islets donor severely hinders its wide application. In generating functional insulin-producing cells (IPCs), many alternative strategies have been considered including the utilization of progenitor pancreatic cell lines, embryonic stem cells (ESCs), umbilical cord blood stem cells (UCB-SCs) and adult bone marrow stem cells (BMSCs). Human adipose tissue-derived stem cells (ADSCs), which are widely recognized as multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) may display as potential subsets of native β-cell attributes. With the advancement of cosmetic surgery in Asia, ADSCs can be obtained easily in large quantities at low risks. For this study, we isolated human ADSCs from lipoaspirated abdominal fat tissue and induced them in vitro to differentiate into IPCs by using a simple 2-step protocol based on a combination of high-glucose, nicotinamide, activin A and glucagon-like peptide 1 (GLP-1) for a duration of 3 weeks. During differentiation, the histomorphological changes of the stem cells towards pancreatic β-islets characteristics were observed via light microscope and transmission electron microscope (TEM). Dithizone (DTZ) staining, which is known to be selective towards IPCs, also stained the new islet-like cells. The production of insulin hormone by the cells was significantly analyzed via a chemiluminesence immunoassay (CLIA) (135 ± 1.7µIU/mL, p = 0.00001) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (22.5 ± 0.7µIU/mL, p = 0.0000004), meanwhile its hormonal regulation function was successfully proven via a glucose challenge test (17.8 ± 0.5µIU/mL, p = 0.0000002). This initial data indicates that IPCs derived from human ADSCs could be potentially used as a therapy to cure diabetes mellitus in the future but further studies still need to be carried out to evaluate its full clinical implications.

vii

KANDUNGAN

Halaman

PENGAKUAN ii

PENGHARGAAN iii

ABSTRAK v

ABSTRACT vi

KANDUNGAN vii

SENARAI JADUAL xii

SENARAI RAJAH xiii

SENARAI SINGKATAN xv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Perubatan Regeneratif Dan Kejuruteraan Tisu 1

1.2 Rawatan Terapi Sel Untuk Penyakit Diabetes 4

1.3 Objektif Kajian 8

1.3.1 Objektif umum kajian 8 1.3.2 Objektif khusus kajian 8

1.4 Hipotesis 9

BAB II KAJIAN PERPUSTAKAAN

2.1 Pengenalan 10

2.2 Latar Belakang Penyelidikan 10

2.3 Pankreas Dan Perkembangannya 12

viii

2.3.1 Pankreas 12 2.3.2 Perkembangan sel β pankreas 16 2.3.3 Sel β pankreas 21 2.3.4 Sel β pankreas matang 22 2.3.5 Perembesan hormon insulin 23 2.3.6 Faktor yang mempengaruhi fungsi sel β 27 2.3.7 Homeostasis glukosa di dalam badan 28

2.4 Penyakit Kencing Manis 29

2.4.1 Diabetes melitus 29 2.4.2 Terapi semasa untuk penyakit diabetes 32 2.4.3 Potensi terapi sel untuk rawatan diabetes jenis 1 36 2.4.4 Sumber sel perembes insulin daripada sel stem manusia 39

2.5 Tisu Adipos Dan Kejuruteraannya 45

2.5.1 Tisu adipos 45 2.5.2 Sel stem tisu adipos 46 2.5.3 Kejuruteraan tisu adipos 47

BAB III BAHAN DAN KAEDAH

3.1 Bahan 53

3.1.1 Sampel tisu 53 3.1.2 Alat radas 53 3.1.3 Bahan kimia dan kit reagen 54

3.2 Kaedah Kajian 55

3.2.1 Penyediaan media dan reagen 55 3.2.2 Pencernaan tisu lipoaspirat manusia 58 3.2.3 Pengkulturan sel stem adipos manusia 61 3.2.4 Pengiraan sel 62 3.2.5 Proses aruhan sel ADSC kepada sel perembes insulin 64 3.2.6 Pengenalpastian ciri-ciri sel 64 3.2.7 Analisis kehadiran hormon insulin 66 3.2.8 Ujian rangsangan glukosa ke atas sel perembes insulin 66

3.3 Analisis Statistik 67

ix

BAB IV ANALISIS MORFOLOGI SEL PEREMBES INSULIN YANG

TELAH DIARUH DARIPADA SEL STEM ADIPOS MANUSIA

4.1 Pengenalan 69

4.2 Bahan Dan Kaedah 70

4.3 Keputusan Kajian 71

4.4 Perbincangan 79

4.5 Kesimpulan 85

BAB V ANALISIS FUNGSI SEL PEREMBES INSULIN YANG TELAH

DIARUH DARIPADA SEL STEM ADIPOS MANUSIA

5.1 Pengenalan 86

5.2 Penghasilan Insulin Oleh Sel Stem Adipos Yang Teraruh 88

5.2.1 Bahan dan kaedah 88 5.2.2 Keputusan kajian 88 5.2.3 Perbincangan 92 5.2.4 Kesimpulan 94

5.3 Penilaian Fungsi Sel Perembes Insulin Melalui Ujian 94 Cabaran Glukosa

5.3.1 Bahan dan kaedah 94 5.3.2 Keputusan kajian 94 5.3.3 Perbincangan 96 5.3.4 Kesimpulan 98

BAB VI RUMUSAN 99

BAB VII KAJIAN LANJUTAN 101

RUJUKAN 104

LAMPIRAN

Lampiran A Surat Kelulusan Menjalankan Penyelidikan 126

x

Lampiran B Borang Keizinan Mendapatkan Sampel Tisu 127

Lampiran C (Abstrak)

a. 8th Malaysian Conference and Exibition of Anti-Aging, Aesthetic and Regenerative Medicine / 1st International Congress on Anti-Aging, Aesthetic and Regenerative Medicine, Kuala Lumpur, Malaysia. 128

b. Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society Asia-Pacific Chapter Meeting, Singapore. 130

c. 10th CPD Series: Diabetic Asia 2011 Conference,

Kuala Lumpur, Malaysia. 132

xi

SENARAI JADUAL

No. Jadual Halaman

2.1 Sel-sel perembes hormon di dalam pepulau pankreas 15 dan fungsinya

xii

SENARAI RAJAH

No. Rajah Halaman

2.1 Anatomi kelenjar pankreas dalam sistem pencernaan manusia dan pelbagai jenis sel yang terdapat pada pankreas 13

2.2 Proses diferensiasi sel-sel endoderm di dalam pankreas 17

2.3 Struktur molekul proinsulin di dalam sel β pankreas 24

2.4 Proses transformasi hormon proinsulin kepada insulin 25

2.5 Proses stimulasi rembesan insulin oleh glukosa di dalam sel β 26

2.6 Kaedah transplantasi pepulau pankreas kepada pesakit diabetes 35

2.7 Peringkat berbeza sel adiposit semasa adipogenesis 48

2.8 Proses pembedahan kosmetik sedut lemak dan isolasi sel 50

2.9 Pelbagai penggunaan sel ADSC di bidang perubatan regeneratif 52

3.1 Carta aliran proses isolasi sel ADSC daripada lipoaspirat 60

3.2 Carta aliran kaedah aruhan sel ADSC kepada sel perembes insulin 68

4.1 Perbandingan histomorfologi sel ADSC teraruh dan sel kawalan 73 selepas 14 hari proses aruhan

4.2 Perbandingan histomorfologi sel ADSC teraruh dan sel kawalan 74 selepas 21 hari proses aruhan

4.3 Perbandingan histomorfologi struktur ultra sel ADSC teraruh dan 76 sel kawalan selepas 21 hari proses aruhan

4.4 Pewarnaan Ditizon ke atas sel ADSC teraruh dan sel kawalan 78

5.1 Analisis penghasilan insulin melalui ujian CLIA insulin 90

5.2 Analisis penghasilan insulin melalui ujian ELISA insulin 91

xiii

5.3 Analisis ujian cabaran glukosa ke atas sel ADSC teraruh 95

xiv

SENARAI SINGKATAN

PPUKM Pusat Perubatan Universiti Kebangsaan Malaysia

kg kilogram

cm sentimeter

mm milimeter

% peratus

°C darjah Celcius

µm mikron

µl mikroliter

ml mililiter

cm2 sentimeter persegi

nM nano molar

mM mili molar

µg/ml mikro gram per mililiter

ng/mL nano gram per mililiter

µIU/mL mikro unit antarabangsa per mililiter

N Normal

HLA antigen leukosit manusia

IPC sel perembes insulin

ADSC sel stem adipos

ESC sel stem embrio

ASC sel stem dewasa

MSC sel stem mesenkima

xv

HSC sel stem hematopoitik

UCB-SC sel stem darah tali pusat

FBS serum fetus lembu

PBS larutan penimbal fosfat

BSA albumin serum lembu

DMEM media Dulbecco’s Modified Eagle Medium

AA antibiotik antimikotik

GLP-1 peptida-seakan glukagon 1

TGF-β faktor pertumbuhan penukaran beta

ITS Insulin-Transferrin-Selenium

P0 pasaj 0

P1 pasaj 1

P2 pasaj 2

P3 pasaj 3

P4 pasaj 4

P5 pasaj 5

α alfa

β beta

δ delta

ε epsilon

PP polipeptida pankreas

DTZ Ditizon

PCR tindakbalas rantaian polimerase

xvi

CLIA ujian pengesanan imunocerakin kimipendarcahaya

ELISA ujian cerakin imunoserap terangkai enzim

ATP adenosina trifosfat

ADP adenosina difosfat

VDCC saluran kalsium bersandar pada voltan

KATP saluran potasium bersandar pada tenaga ATP

1

BAB I

PENGENALAN

1.1 PERUBATAN REGENERATIF DAN KEJURUTERAAN TISU

Perubatan regeneratif merupakan satu bidang penyelidikan yang semakin berkembang

dengan harapan dapat menyediakan rawatan terapeutik untuk penyakit atau

kecederaan yang tidak boleh dirawat dengan berkesan melalui perubatan konvensional

dan juga terapi dadah biologi yang baru. Terapi perubatan regeneratif dijangka dapat

mengimbangi kekurangan terapeutik di dalam pembedahan rekonstruktif dan

transplantasi organ, di samping mewujudkan strategi terapeutik yang baru. Perubatan

regeneratif melibatkan usaha pelbagai disiplin untuk menggantikan atau memperbaiki

tisu-tisu yang berpenyakit. Kejuruteraan tisu dan terapi sel merupakan dua komponen

utama di dalam perubatan regeneratif. Walau bagaimanapun, kesemua ini akan

disatukan melalui matlamat yang sama iaitu memberikan terapi yang selamat,

berkesan dan konsisten kepada pesakit (Atala, 2000; Lanza, 2000).

Kejuruteraan tisu adalah satu bidang bioteknologi yang menggabungkan

pelbagai disiplin ilmu melibatkan biologi, perubatan dan kejuruteraan yang

merevolusikan atau mengubah sepenuhnya cara kita mempertingkatkan tahap

kesihatan dan kualiti kehidupan berjuta manusia di dunia, dengan cara memulih,

mengekalkan atau meningkatkan fungsi tisu atau organ. Dalam erti kata lain, matlamat

utama bidang kejuruteraan tisu adalah berdasarkan konsep rawatan untuk

menggantikan atau mengembalikan struktur anatomi dan fungsi tubuh yang telah

hilang akibat daripada kecederaan, kerosakkan atau kehilangan tisu atau organ

berikutan kemalangan mahupun proses patologi yang berlaku di dalam tubuh.

2

Matlamat ini cuba dicapai dengan cara menggabungkan sel, biobahan, faktor biokima

dan fisio-kimia bersama faktor pertumbuhan yang tertentu di dalam satu persekitaran

mikro yang sesuai bagi setiap pertumbuhan tisu atau organ (Ibarra et al., 2000; Atala,

2000; Lanza, 2000).

Menurut Vacanti dan Langer (1993), kejuruteraan tisu merupakan satu bidang

interdisiplin yang menggabungkan prinsip kejuruteraan dan sains kehidupan ke dalam

aplikasi ke arah pembentukan bahan ganti biologi yang lebih memfokus kepada

penciptaan, pemeliharaan atau pengembalian fungsi organ dalaman yang telah rosak.

Selain menyediakan platform untuk mengubati penyakit, di mana tisu tumbuh di

dalam badan pesakit atau di luar badan pesakit dan kemudiannya ditransplantasi

semula kepada pesakit, kejuruteraan tisu juga menyediakan platform menggunakan

tisu yang dihasilkan secara in vitro untuk kajian metabolisme dan penyerapan dadah,

kajian ketoksikan dan kajian ke atas penyebab penyakit. Pengasasan kejuruteraan tisu

untuk aplikasi rawatan atau aplikasi diagnostik adalah untuk memanfaatkan sel-sel

hidup di dalam pelbagai cara.

Dalam bidang kejuruteraan tisu, sel autologus merupakan sumber sel yang

terbaik kerana ia dapat mengelakkan risiko penolakkan imunisasi, risiko penularan

penyakit dan masalah mencari penderma yang sesuai. Sel yang digunakan juga adalah

sel yang hidup dan berupaya untuk terus berkembang biak. Selain itu, penggunaan

biobahan sebagai struktur sokongan utama bagi memberikan bentuk kepada tisu yang

dijana, perlu diselidiki dari segi penerimaan sel terhadap biobahan tersebut dan

kesesuaiannya dengan pengguna kerana biobahan yang tidak sesuai akan

menyumbang kepada kegagalan graf. Maka dengan itu, biobahan daripada sumber

biologi dan autologus adalah pilihan terbaik supaya ianya dapat mengembalikan

fungsi dan berintegrasi dengan tubuh penerima. Biobahan yang digunakan mestilah

selamat kepada pengguna apabila proses degradasi berlaku tanpa mengakibatkan

mudarat kepada pengguna (Langer & Vacanti, 1993).

Bidang kejuruteraan tisu sudah mula bertapak di negara kita sejak beberapa

tahun yang lepas setelah hampir 35 tahun penyelidikan berkaitan kejuruteraan tisu

dijalankan oleh penyelidik luar (Saim et al., 2000). Ini dibuktikan daripada kajian

3

yang dilaporkan oleh Chick et al. pada tahun 1975 berkenaan kejayaan mereka

menjana satu sistem yang melibatkan sel-sel pankreas yang disimpan di dalam

membran separa telap untuk membantu proses pengawalan paras glukosa pesakit

kencing manis ataupun diabetes mellitus. Namun begitu, sejarah kejuruteraan tisu

sebenarnya telah bermula seawal 1970-an oleh seorang pakar tulang kanak-kanak dari

Children’s Hospital, Dr William Thomas Green yang menjalankan kajian untuk

menjana tisu rawan dengan menggunakan sel kondrosit yang disemai pada tulang

spikul dan diimplan ke atas mencit atimik seperti mana yang telah dilaporkan oleh

Charles A. Vacanti di dalam penulisannya pada tahun 2006 yang bertajuk ‘The

History of Tissue Engineering’.

Walaupun kajian tersebut tidak berjaya, namun ia telah mencetuskan pelbagai

ide dan membuka mata para penyelidik lain dalam meningkatkan mutu dan kualiti

penyembuhan penyakit. Beberapa tahun kemudian, para penyelidik daripada

Massachusetts General Hospital dan Massachusetts International Technology (M.I.T)

telah bergabung dalam menjalankan penyelidikan berkaitan kejuruteraan tisu kulit

yang menggunakan matriks kolagen bagi menyokong pertumbuhan sel fibroblas.

Pada tahun yang sama juga, ujian klinikal telah dijalankan ke atas pesakit yang

tercedera akibat kebakaran dengan menampal kepingan nipis sel keratinosit di

kawasan yang melecur. Bermula dari saat itu, lebih banyak kajian telah dilakukan

terhadap pelbagai jenis tisu badan seperti telinga (Cao et al., 1997; Saim et al., 2000;

Aminuddin et al., 2003), tendon (Cao et al., 2002), kornea (Tsai et al., 2000; Li et al.,

2003; Shimura et al., 2003), saraf periferi (Scherman et al., 2001; Evans et al., 2002;

Lundborg & Richard, 2003; Fansa & Keilhoff, 2004;) dan lain-lain lagi. Selepas

daripada itu, maka bermula pula episod penggunaan sel stem daripada pelbagai

sumber badan seperti sum-sum tulang (Prockop, 1997; Azizi et al., 1998; Pittenger et

al., 1999; Pittenger et al., 2000) dan tisu adipos (Zuk et al., 2001; Safford & Rice,

2005; Prunet-Marcassus et al., 2006) yang dipercayai boleh diaruh kepada sel yang

dikehendaki. Sehingga kini, pelbagai jenis kajian yang berkaitan dengan kejuruteraan

tisu sedang giat dijalankan di seluruh pelosok dunia dengan berpaksikan satu

matlamat yang sama iaitu bagi meningkatkan tahap kesihatan dan kualiti kehidupan

seluruh umat manusia di dunia.

4

1.2 RAWATAN TERAPI SEL UNTUK PENYAKIT DIABETES

Diabetes mellitus atau penyakit kencing manis, merupakan sejenis penyakit kronik

yang sangat membinasakan dan sehingga kini, lebih daripada 10% jumlah penduduk

di seluruh dunia menghidapi penyakit ini (International Diabetes Federation, 2010).

Diabetes jenis 1 berlaku akibat daripada kemusnahan autoimun bagi sel β perembes

insulin di dalam pepulau Langerhans pada pankreas, manakala diabetes jenis 2 pula

merupakan penyakit yang kerap berlaku di kalangan individu yang lebih tua, di mana

ianya disebabkan oleh masalah rintangan insulin sistemik dan kekurangan perembesan

hormon insulin oleh sel β pankreas. Secara umum, semua mengetahui bahawa risiko

komplikasi penyakit diabetes bergantung kepada darjah kawalan glisemik oleh

seseorang pesakit diabetes. Beberapa ujian klinikal seperti Ujian Kawalan dan

Komplikasi Diabetes (1993), Kajian Kumamoto (Ohkubo et al., 1995) dan Kajian

Diabetes Prospektif UK (1998) telah menunjukkan bahawa pengawalan glisemik ketat

yang dicapai melalui rejim insulin intensif boleh mengurangkan risiko seseorang

pesakit untuk mendapat komplikasi penyakit diabetes seperti kerosakan retina mata

(retinopathy), kerosakan ginjal (nephropathy) atau pun kerosakan saraf (neuropathy).

Walau bagaimanapun, tidak semua pesakit diabetes berupaya untuk mengekalkan

paras glukosa darah yang normal biarpun ubat-ubatan atau rejim insulin diberikan

secara berkala. Hal ini turut disokong oleh satu kajian di negara Amerika iaitu Third

National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III, 1988-1994) di

mana ia telah menunjukkan bahawa hanya 50% daripada pesakit diabetes telah

berjaya mencapai paras HbA1c kurang daripada 7%. Oleh itu, satu-satunya cara bagi

memastikan kesihatan jangkamasa panjang bagi pesakit diabetes adalah dengan

mengekalkan paras normoglisemia di dalam badan secara konsisten.

Biarpun telah wujud pelbagai ubatan farmakologi dan terapi insulin yang

intensif, kebanyakan individu yang menghidap diabetes terutamanya diabetes jenis 1

masih tidak berupaya untuk mengekalkan paras glukosa darah yang normal pada

setiap masa. Tambahan pula, kawalan glisemik yang intensif melalui terapi insulin

selalu dikaitkan dengan kejadian hipoglisemia yang mengejut dan hal ini telah

menjadi penghalang utama di dalam pelaksanaan rawatan intensif dari perspektif

pakar perubatan dan pesakit. Selain itu, masalah ketidaksandaran (non-compliance)

5

pesakit diabetes terhadap ubat-ubatan yang telah diamanahkan kepada mereka turut

menyumbang ke arah kejadian komplikasi penyakit tersebut (Persatuan Diabetes

Malaysia, 2010). Kegagalan mencegah morbiditi yang dikaitkan dengan diabetes

boleh menimbulkan masalah atau beban yang begitu besar, bukan sahaja ke atas

pesakit dan saudara-mara mereka, tetapi juga kepada masyarakat. Kos bagi rawatan

komplikasi diabetes pada peringkat akhir didapati semakin meningkat dan hal ini turut

disebabkan oleh proses urbanisasi dan pertambahan mendadak bilangan penghidap

diabetes (World Health Organization, 2010). Oleh itu, pesakit dan masyarakat akan

mendapat lebih banyak manfaat seandainya perkembangan penyelidikan di dalam

rawatan diabetes terus dimajukan.

Kejayaan yang dicapai sepanjang beberapa dekad dahulu melalui kaedah

transplantasi seluruh pankreas dan pepulau yang dipencilkan telah menunjukkan

bahawa penyakit diabetes boleh disembuhkan dengan kaedah penambahan sel β yang

berkurangan. Secara logiknya, penggantian tisu pepulau menawarkan pendekatan

yang lebih baik berbanding dengan hanya menggantikan insulin yang hilang. Prosedur

allotransplantasi pepulau pankreas telah menunjukkan ketaksandaran insulin

dikalangan beberapa pesakit diabetes jenis 1 (Shapiro et al., 2000; Matsumoto et al.,

2005; Noguchi et al., 2006). Dengan perkembangan terbaru di dalam prosedur

pemencilan pepulau dan imunosupresan, kejayaan yang memberangsangkan telah

dilaporkan dengan menggunakan pepulau daripada 2 atau 3 penderma bagi setiap

penerima. Sejak Protokol Edmonton diperkenalkan, lebih daripada 500 pesakit

diabetes jenis 1 daripada lebih 50 institusi telah menjalani transplantasi pepulau bagi

menyembuhkan penyakit mereka. Walau bagaimanapun, manfaat klinikal protokol ini

hanya boleh disediakan untuk jumlah pesakit yang kecil dan ianya juga tidak bertahan

lama (Robertson, 2004). Apapun, dengan keputusan menggalakkan yang diperoleh

melalui transplantasi seluruh pankreas dan pepulau yang dipencilkan, digandingkan

dengan kekurangan pankreas kadaver dan permintaan yang banyak, hal ini telah

menimbulkan dorongan yang kuat di kalangan para saintis ke arah pencarian sumber

sel perembes insulin (IPC) yang baru (Bonner-Weir & Weir, 2005).

Dengan alasan ini, beberapa pendekatan alternatif telah diselidik secara intensif

dan kemajuan ini menekankan keperluan segera terhadap pembangunan sumber

alternatif bagi penderma pankreas manusia, iaitu dengan mengkultur sel β manusia

6

yang banyak bagi tujuan transplantasi. Oleh kerana sel β yang mengalami pembezaan

tidak boleh dibiakkan di dalam kultur tisu, beberapa pendekatan utama terhadap

pengembangan sel β in vitro telah digunakan seperti ketakmortalan berbalik bagi sel β

yang matang dan pembezaan sel stem atau sel progenitor manusia (Efrat et al., 2002).

Meskipun pendekatan pertama telah berjaya dilakukan di dalam sel β haiwan roden,

namun setakat ini ia mengalami kesulitan di dalam pepulau manusia yang dipencilkan.

Oleh itu, cara alternatif yang lebih baik untuk pengembangan sel β pascamitotik

adalah dengan kaedah pembezaan atau pengaruhan sel stem, iaitu sel yang mempunyai

keupayaan pengembangan sendiri yang semula jadi, untuk menjadi sel perembes

insulin. Pengaruhan ini boleh dicapai secara in vitro dengan menggabungkan keadaan

kultur tisu, penggunaan faktor aruhan yang spesifik atau gen faktor transkripsi

dominan, dan dilengkapkan dengan pembezaan lanjut in vivo selepas transplantasi.

Matlamat ini bukan sahaja untuk mengaruhkan sel stem dan biosintesis insulin, tetapi

juga ke arah pemprosesan, penyimpanan dan perembesan terkawal atur yang betul

sebagai tindak balas terhadap isyarat fisiologi, yang tanpanya pendekatan terapi sel itu

tidak akan memberikan manfaat yang ketara berbanding pemberian insulin (Edlund,

2002).

Sehingga kini, di dalam menghasilkan sel perembes insulin yang berfungsi,

beberapa penyelidikan dan strategi alternatif daripada sel stem manusia telah

dijalankan termasuklah penggunaan titisan sel pankreas progenitor, sel stem embrio

(ESCs), sel stem darah tali pusat (UCB-SCs) dan sel stem sum-sum tulang (BMSCs).

Sel stem yang diperoleh daripada tisu adipos manusia (ADSCs), yang juga telah

dikenali secara meluas sebagai sel stem mesenkima yang multipoten (MSCs),

berkemungkinan boleh dibezakan untuk menjadi sel perembes insulin yang menyamai

sel β pankreas yang asli dan dengan kemajuan teknologi pembedahan kosmetik di

rantau Asia, khususnya di Malaysia, sel tersebut mudah didapati dalam kuantiti yang

banyak dengan risiko pembedahan yang rendah.

Oleh itu, kajian ini berfokus kepada penjanaan sel perembes insulin daripada

sel stem mesenkima adipos yang diperoleh daripada tisu lemak manusia yang

terbuang melalui kaedah kejuruteraan tisu. Ini adalah langkah permulaan di dalam

penjanaan sel perembes insulin bagi merawat penyakit kencing manis atau diabetes,

7

dan diharapkan agar kajian ini dapat diperdalamkan lagi pada suatu masa kelak supaya

lebih banyak informasi boleh diperolehi sebelum diunjurkan kepada kajian klinikal.