laporan stula

LAPORAN

STUDI LAPANGAN BIOPROSES

“Isolasi Bakteri Azotobacter Chroococcum dari Tanah Tanaman

Jagung dengan Metode Cawan Tuang”

Oleh Kelompok 2 dan 8:

Anggadyah Nareswari (1331410086)

Chandra Kirana (1331410002)

Laryssa Victoria Golderry (1331410101)

Noka Marina Agustin (1331410076)

Shanti Dwi Mardika (1331410106)

POLITEKNIK NEGERI MALANG

TEKNIK KIMIA

2013

KATA PENGANTAR

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan karunia yang

telah dilimpahkan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penyusunan

Laporan Studi Lapangan ini.

Tak lupa penulis mengucapkan terima kasih khususnya kepada Ibu Diah

Meiliawati dan Ibu Sri Rulianah selaku dosen pengajar mata kuliah Bioproses

yang telah membantu dalam penyusunan Laporan Studi Lapangan ini. Penulis

juga berterimakasih banyak kepada semua pihak yang telah membantu dalam

proses penyusunan Laporan Studi Lapangan ini.

Laporan Studi Lapangan ini berjudul “Isolasi Bakteri Azotobacter

Chroococcum dari Tanah”. Bertujuan untuk memenuhi salah satu tugas dari

mata kuliah Bioproses. Laporan ini kami susun dengan mengacu pada sumber

yang benar dan terpercaya. Dan kami juga berusaha untuk menyusun laporan ini

dengan sistematika yang runtut, sehingga proposal ini mudah dipahami oleh

semua pihak.

Namun penulis menyadari jika Laporan Studi Lapangan ini masih jauh

dari kesempurnaan, maka dari itu kritik dan saran untuk membangun Laporan

Studi Lapangan ini menjadi lebih baik sangat diharapkan.

Akhir kata, semoga Laporan Studi Lapangan ini bermanfaat bagi pembaca

terutama dalam upaya peningkatan kualitas belajar.

Malang, 8 Januari 2014

Penulis

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL

HALAMAN PENGESAHAN

ABSTRAKSI

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

DAFTAR LAMPIRAN

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kegiatan

1.2 Tujuan Kegiatan

1.3 Manfaat Kegiatan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1

2.2

2.3

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Kegiatan

Indonesia merupakan Negara agraris, dimana banyak orang tertarik untuk

menanamkan modalnya dalam bidang pertanian dan perkebunan. Indonesia

menjadi Negara incaran, karena memiliki 5 pulau besar yakni Sumatera,

Kalimantan, Jawa, Sulawesi dan Papua, yang kelima-limanya merupakan lahan

yang potensial untuk pengembangan berbagai industri pertanian dan perkebunan.

Salah satu faktor penting untuk menunjang pengembangan kedua bidang

tersebut selain tersedianya modal dan lahan yang luas adalah terkontrolnya tingkat

kesuburan tanah . Dengan terkontrolnya tingkat kesuburan tanah diharapkan agar

lahan yang nantinya digarap akan terus produktif memberikan nutrisi bagi

tanaman. Disini yang dimaksud dengan kesuburan tanah atau tanah subur adalah

tanah yang mengandung banyak nutrisi berupa senyawa-senyawa nitrogen.

Nitrogen (N2) merupakan hara makro utama yang sangat penting untuk pertumbuhan

vegetatif tanaman. Nitrogen merupakan senyawa dasar pembentukan fitohormon dalam

tanaman khususnya auksin dan sitokinin.

Nutrisi ini dihasilkan oleh aktivitas bakteri penyubur tanah yang mampu

menangkap N2 dari atmosfer dan melakukan fiksasi untuk menghasilkan senyawa-

senyawa dalam nitrogen yang disebut sebagai bakteri nitrogen.Bakteri nitrogen

adalah bakteri yang mampu mengikat nitrogen bebas dari udara dan mengubahnya

menjadi suatu senyawa yang dapat diserap oleh tumbuhan. Karena kemampuannya

mengikat nitrogen di udara, bakteri-bakteri tersebut berpengaruh terhadap nilai ekonomi

tanah pertanian. Kelompok bakteri ini ada yang hidup bebas maupun simbiosis. Bakteri

nitrogen yang hidup bebas yaitu Azotobacter Chroococcum, Clostridiumpasteurianum,

dan Rhodospirillum rubrum. Bakteri nitrogen yang hidup bersimbiosis dengan tanaman

polong-polongan yaitu Rhizobium leguminosarum, yang hidup dalam akar membentuk

nodul atau bintil-bintil akar.

Azotobacter Chroococcumseperti yang sudah disinggung, mampu berinteraksi

secara intensif dengan akar tanaman maupun tanah. Azotobacter Chroococcumyang

merupakan agen biologis pemfiksasi dinitrogen yang menghasilkan amonium.

Azotobacter Chroococcum dapat memfiksasi dinitrogen menjadi amonium melalui

reduksi elektron serta protonasi gas nitrogen, sehingga inokulasinya dapat menambah

ketersediaan hara nitrogen dalam tanah yang diserap dan dimanfaatkan oleh tanaman.

1.2 Tujuan Kegiatan

1. Mengetahui morfologi Azotobacter Chroococcum.

2. Mengetahui bentuk koloni Azotobacter Chroococcum.

3. Mengetahui ciri-ciri Azotobacter Chroococcum.

4. Mengetahui cara mengisolasi Azotobacter Chroococcum.

1.3 Rumusan Masalah

1. Bagaimana morfologi Azotobacter Chroococcum?

2. Bagaimana bentuk koloni Azotobacter Chroococcum?

3. Bagaimana ciri-ciri Azotobacter Chroococcum?

4. Bagaimana cara mengisolasi Azotobacter Chroococcum?

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Tanah

Tanah adalah sebuah komponen dari keseluruhan ekosistem dan tidak

dapat dilepaskan dari kesehatan ekosistem tersebut. Dibidang pertanian, tanah

yang sehat memiliki kondisi fisik, kimia, dan biologis optimal untuk produksi

tanaman dan memiliki kesanggupan untuk menjaga kesehatan tanaman serta

kualitas ekosistem yang mencakup air dan tanah. Dalam sejumlah kondisi, tanah

yang sehat mungkin saja tidak berfungsi sebagai komponen ekosistem yang sehat

karena adanya penambahan komponen tanah yang tidak sehat dari luar tanah itu

sendiri (Elliot 1998) misalnya penambahan bahan kimia yang berlebihan atau

pembuangan limbah toksis.

Tanah sehat dan subur merupakan sistem hidup dinamis yang dihuni oleh

berbagai organism (mikro flora, mikro fauna serta meso dan makro fauna).

Organisme tersebut saling berinteraksi membentuk suatu rantai makanan sebagai

manifestasi aliran energy dalam suatu ekosistem untuk membentuk tropik rantai

makanan (Simarmata et al, 2003). Dalam ekosistem tanah, tropic rantai makanan

dimulai dari tropic level pertama, yaitu kelompok organisme (tanaman dan

bakteri) produsen yang mampu memanfaatkan sinar matahari sebagai sumber

energinya. Hal ini berarti, bahwa kehadiran suatu organisme akan mempengaruhi

keberadaan organisme lain secara langsung maupun tidak langsung. Kesehatan

tanah dapat dievaluasi secara kualitatif maupun kuantitatif dengan menggunakan

indikator seperti kemampuan tanah sebagai media tumbuh tanaman maupun

mikroba (Simarmata et al, 2003)

2.2 Azotobacter

Azotobacter adalah spesies rizobakteri yang telah dikenal sebagai agen

biologis pemfiksasi dinitrogen yang menkonveksi dinitrogen ke amonium melalui

reduksi elektron dan protonasi gas dinitrogen. Unsur hara yang membatasi

produktivitas tanaman adalah nitrogen sehingga pupuk nitrogen selalu

ditambahkan sebagai input dalam produksi tanaman. Untuk menghindari

penurunan kesehatan tanaman akibat adanya input bahan kimia, diperlukan input

biologis berupa rizobakteri.

Penambahan atau inokulasi Azotobacter dengan tujuan untuk

meningkatkan ketersediaan nitrogen tanah telah sering dilakukan namun dengan

hasil yang bervariasi,bahkan kadang-kadang tidak meningkatkan hasil tanaman.

Kondisi tersebut sangatlah logis mengingat kontribusi rizobakteri hidup bebas

terhadap nitrogen tanah hanya sekitar 15 kg N/ha/tahun yang jauh lebih rendah

daripada kontribusi bakteri pemfikasasi nitrogen simbiosis yang mencapai 24-584

kg N/ha/tahun (Shantharam & Mattoo 1997).

Namun demikian, upaya mempertahankan kesehatan tanah dan sekaligus

produktivitas tanaman dengan inokulasi Azotobacter perlu dilakukan karena

rizobakteri ini berperan sebagai agen peningkat pertumbuhan tanaman melalui

produksi fitohormon yang dapat dimanfaatkan oleh tanaman. Selain itu, input

rizobakteri dalam suatu sistem pertanian sejalan dengan konsep Mekanisme

Pembangunan Bersih (Clean Development Mechanism, CDM) yang penting

diupayakan untuk mengurangi emisi gas rumah kaca dan meningkatkan serapan

karbon (carbon sequestration) sehingga karbon berada dalam bentuk yang lebih

stabil (Murdiyarso 2003).

Kemampuan Azotobacter dalam memfiksasi N2 telah diketahui pertama

kali oleh Beijerinckpada tahun 1901 (Page 1986). Namun demikian peningkatan

hasil ini tidak konsisten jika dibandingkan dengan rendahnya kapasitas fiksasi

bakteri memfiksasi nitrogen non simbiotik. Karena itu, diduga terdapat faktor lain

yang berperan dalam pengendalian pertumbuhan tanaman seperti produksi

fitohormon, pemutusan siklus penyakit maupun hama melalui perubahan

karakteristik mikroba, fisik atau kimia tanah, atau melalui peningkatan aktivitas

makrofauna tanah seperti cacing tanah (Peoples et al, 1995).

Sejumlah kajian mengindikasikan bahwa Azotobacter merupakan

rizobakteri yang selalu terdapat di tanaman serelia seperti jagung dan gandum

(Abbass & Okon 1993a; Abbas & Okon 1993b; Hindersah et al, 2000; Hindersah

et al, 2003a) maupun sayuran (Hindersah & Setiawati 1997; Hindersah et al,

2003b). Dengan demikian akan terjadi sistem asosiatif yang intensif seperti yang

diperlihatkan strain Acetobacter dan Herbasprillum dengan tebu dan Azuspirillum

dengan gandum (Kennedy et al, 1997).

2.3 Karakteristik bakteri Azotobacter chroococcum

Sel Azotobacter berukuran besar dengan bentuk batang, banyak isolat

hampir seukuran khamir, dengan diameter 2-4 μm atau lebih, biasanya polimorfik.

Pada media yang mengandung karbohidrat, kapsul tambahan atau lapisan lendir

diproduksi oleh bakteri pengikat nitrogen yang hidup bebas ini. Meskipun

Azotobacter adalah bakteri aerob obligat (tidak memerlukan oksigen bebas untuk

memperoleh energinya). Enzim nitrogenase yang dimilikinya yaitu enzim yang

mengkatalisis pengikatan N2 bersifat sensitif terhadap O2. Karakteristik

Azotobacter yang mempunyai kapsul lendir yang tebal membantu melindungi

enzim nitrogenase dari O2. Azotobacter dapat tumbuh pada berbagai macam jenis

karbohidrat, alkohol, dan asam organik. Metabolisme senyawa karbon teroksidasi

sempurna, sedangkan asam atau produk fermentasi yang lain jarang dihasilkan.

Seperti halnya bakteri berendospora, kista Azotobacter resisten terhadap

proses pengeringan, penghancuran mekanik, ultraviolet, dan radiasi. Namun tidak

seperti endospora, kista Azotobacter tidak resisten terhadap panas dan tidak

mengalami dormansiyaitu, suatu keadaan berhenti tumbuh yang

dialami organisme hidup atau bagiannya sebagai tanggapan atas suatu keadaan

yang tidak mendukung pertumbuhan normal.Azotobacter merupakan bakteri

Gram negatif, bergerak dengan flagel peritrik, dan bersifat katalase positif.

Kisaran pH untuk pertumbuhan dengan adanya nitrogen tambahan adalah 4,5-8,5

sedangkan pH optimal untuk pertumbuhan dan pengikatan nitrogen adalah 7-7,5.

Bakteri ini terdapat di tanah dan di air (Holt et al, 1994). Azotobacter

chroococcum memiliki pigmen hitam-coklat yang tidak larut (Rao, 1986). Pada

medium padat, isolat Azotobacter menunjukkan karakteristik,

1. koloni dengan bentuk bulat, convex, halus, semi opoque, basah (moist)

2. koloni berwarna putih,bening sampai keruh dan coklat

3. koloni mempunyai diameter antara 0,5-4 mm (Wedhastri, 2002).

2.4 Klasifikasi Azotobacter chroococcum

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadacceae

Genus : Azotobacter

Spesies : Azotobacter chroococcum

2.5 Manfaat Azotobacter chroococcum

Bakteri dari famili Azotobacteraceae merupakan sebagian besar dari

bakteri pemfiksasi nitrogen yang hidup bebas. Azotobacter yang diinokulasi

daritanah atau biji efektif meningkatkan hasil tanaman budidaya pada tanah yang

dipupuk dengan kandungan bahan organik yang cukup. Azotobacter juga

diketahui mampu mensintesis substansi yang secara biologis aktif seperti vitamin-

vitamin B, asam indol asetat, dan giberelin dalam kultur murni. Organisme ini

memiliki sifat dapat menghambat pertumbuhan jamur (fungistatik) bahkan jamur

tertentu yang sangat pathogen seperti Alternaria dan Fusarium, tergantung

tersedianya sumber karbon.

Bakteri ini juga memiliki potensi mengekskresikan berbagai senyawa

eksopolisakarida (EPS) dan asam lemak (Suryatmana et al, 2006).

Eksopolisakarida dapat berfungsi sebagai biosurfaktan yang dapat meningkatkan

biodegradasi limbah minyak bumi (Iwabuchi et al, 2002). Sedangkan Vater et al

(2002) menyatakan bahwa asam lemak berfungsi sebagai biosurfaktan karena

merupakan senyawa amfifatik yang memiliki gugus liofobik dan liofolik.

Asosiasi ini dirasakan penting mengingat nitrogen adalah unsur hara

makro esensial, dan di lain pihak,produksi tanaman di Indonesia akan tergantung

dari input nitrogen karena umumnya tanah di Indonesia hanya mengandung

sedikit nitrogen. Pupuk nitrogen akan tetap berperan penting dalam peningkatan

produksi tanaman, namun demikian penggunaannya harus diatur untuk menjamin

produktivitas, stabilitas dan keberlanjutan ekosistem pertanian. Oleh karena itu,

inokulasi rhizobakteri Azotobacter selayaknya dijadikan salah satu faktor dari

managemen nitrogen dalam suatu sistem tanam sehingga akan bersifat sinergis

dengan input nitrogen lainnya seperti pupuk dan bahan organik yang selanjutnya

dapat menjamin kesehatan tanah.

Kemampuan Azotobacter dalam memproduksi fitohormon sitokinin dan

auksin dilaporkan pertama kali oleh Vancura dan Macura pada tahun 1960

(Vancura 1988). Sampai saat ini sejumlah penelitian telah membuktikan

kemampuan rizobakteri Azotobacter chroococcum, A. beijerinckii, A. paspali,

maupun A. vinlandii dalam memproduksi fitohormon terutama sitokinin. Teller &

Wong (1989) membuktikan adanya sitokinin dari jenis zeatin ribosida (ZR),

zeatin (Z), isopenteniladenosin (2iPR), isopenteniladenin (2iP), metiltiozeatin

(MSZ) dan metiltioisopentenil-adenin (MS2iP) yang diekskresikan oleh A.

vinlandii. Abbass & Okon (1993b) memperlihatkan bahwa kemampuan A. paspali

untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman berhubungan dengan kapasitasnya

dalam mensintesis factor tumbuh.

Nitrogen adalah satu unsur hara utama yang sangat penting dalam seluruh

proses biokimia di tanaman. Di dalam tanah, sumber nitrogen adalah bahan

organik, pupuk kandang, sisa tanaman yang terdekomposisi, fiksasi nitrogen

biologis, air irigasi dan pupuk anorganik (Laegreid et al, 1999). Kekurangan

nitrogen pada pembibitan sering kali membatasi pertumbuhan dan kualitas bibit.

Dalam sistem nutrisi tanaman yang terintegrasi, kesehatan tanah yang

berhubungan dengan ketersediaan nitrogen dapat dicapai dengan

menyeimbangkan input sumber nitrogen dari pupuk anorganik dan dari

mikroorganisme pemfiksasi nitrogen.

Dikemukakan oleh Krishnamoorthy (1981), di dalam proses pertumbuhan

dan perkembangan tanaman sering ditemukan satu atau lebih fitohormon pada

waktu yang bersamaan. Adapun kelompok tanaman yang paling banyak

memanfaatkan fitohormon ini menurut Manurung (1987) adalah kelompok

tanaman hortikultura, tanaman pangan, tanaman industri, tanaman perkebunan dan

tanaman kehutanan. Dengan demikian kemampuan Azotobacter dalam

memproduksi hormon sitokinin dan giberelin sangat menguntungkan mengingat

kedua fitohormon tersebut berperan dalam perkembangan dan pembelahan sel

(Taiz & Zeiger 1991).

Sampai saat ini, inokulan Azotobacter diperbanyak di dalam kultur cair

bebas N yang diaplikasikan dengan cara menyiramkan ke daerah perakaran

tanaman. Inokulan cair ini memiliki kelebihan, yaitu selama inkubasi untuk

memperbanyak sel bakteri, kondisi media yang bebas nitrogen mendorong

ekskresi Nitrogen hasil fiksasi oleh bakteri ke dalam media dan menginduksi

pembentukan fitohormon oleh bakteri.

Peningkatan tinggi pupus dan berat kering tajuk yang sejalan dengan

peningkatan konsentrasi dan dosis inokulan juga diperlihatkan dalam aplikasi 106

dan 108 cfu/mL Azotobacter dengan dosis 2,5 dan 5,0 mL (Hindersah et al,

2002b). Pada percobaan ini peningkatan pertumbuhan tajuk terhenti pada tanaman

yang mendapatkan 5 mL Azotobacter dengan kepadatan sel 108 cfu/mL.

Peningkatan yang sama diperlihatkan oleh bibit tanaman selada lettuce

(Lacutcasativa L.) yang diberi supernatan kultur cair Azotobacter. (Hindersah et

al, 2002a).

Namun demikian, inokulasi Azotobacter pada media tanam bibit sayuran

yang tidak mengandung pupuk kandang tidak dapat memperbaiki pertumbuhan

bibit seperti yang dibuktikan oleh Kristanti (2002) pada bibit tanaman tomat.

Peranan nitrogen dalam pertumbuhan awal tanaman tidak diragukan lagi. Bentuk

utama nitrogen di dalam tanah adalah ammonium dan nitrat yang tersedia untuk

tanaman serta bahan organik yang harus mengalami dekomposisi sebelum dapat

langsung diambil akar tanaman. Adanya penambahan nitrogen dalam bentuk

ammonium di dalam inokulan Azotobacter meningkatkan daya dukung tanah

untuk menyokong pertumbuhan tanaman. Selama pembibitan, jumlah nitrogen

yang diperlukan akan jauh lebih kecil daripada yang diperlukaan tanaman pada

fase pertumbuhan selanjutnya. Ammonium di dalam inokulan, yang akan

dikonversi menjadi nitrat saat diinokulasikan ke tanah yang aerob, dapat

mencukupi kebutuhan tanaman selama pembibitan.

2.6 Gambar-gambar Azotobacter Chroococcum

BAB III

METODOLOGI

3.1 Sterilisasi Alat dan Media

Langkah - langkah sterilisasi yaitu:

3.1.1 Tahap persiapan

1. Buka pengunci autoclave

2. Cek kedalaman air. Tinggi air harus dibawah plat berlubang

3. Jika kurang tambahkan aquadest dari atas autoclave

4. Pasang keranjang sesuai kebutuhan(1 atau 2 keranjang)

5. Masukkan alat atau media yang disterilkan

3.1.2 Tahap pelaksanaan

1. Tutup autoclave dan dikunci sampai rapat, pastikan tidak ada yang

bocor

2. Tutup kran steam dan kran udara

3. Pilih tanda gunting untuk sterilisasi alat dan tanda erlenmeyer untuk

sterilisasi media(pastikan waktu menunjukkan angka 0, suhu dibawah

102oC, tidak ada indikasi error).

4. Tekan program dan pilih sesuai kebutuhan

5. Tekan Start

6. Tunggu proses pemanasan, misal program 2(suhu 121oC, waktu 30

menit). Waktu untuk mencapai 1 bar dibutuhkan 30 menit, dan selama

itu lampu heater dan exhaust menyala

7. Bila sudah tercapai satu bar, lampu heater dan exhaust padam, lampu

steril menyala berkedip – kedip selama 7 menit diiringi dengan

penurunan suhu, waktu dan tekanan selama 30 menit

8. Lampu steril padam, dan alarm berbunyi selama 10 detik,

menunjukkan bahwa proses sterilisasi selesai

9. Tekan stop, biarkan autoclave tertutup sampai tekanan turun

menunjukkan 0-2 bar

10. Buka kran udara dan kran steam

11. Buka pengunci autoclave

12. Angkat keranjang

3.1.3 Tahap akhir

1. Putar tombol off jika suhu autoclave sudah menunjukkan suhu 40oC

2. Bersihkan sisa air disekitar autoclave

3. Tutup autoclave tanpa dikunci

3.2 Prosedur Percobaan

3.2.1 Sterilisasi alat dengan autoclave

1. Cuci alat yang digunakan dengan air dan sabun hingga tidak terasa

berminyak, bilas dengan air mengalir kemudian dengan aquadest atau

alcohol. Tiriskan.

2. Untuk tabung reaksi dan peralatan berleher disumbat dengan kapas

berbungkus kain kasa steril. Sumbatan harus padat dibagian luar agar

dapat menahan debu dan kotoran.

3. Bungkus semua peralatan dengan kertas kecuali Erlenmeyer yang

memiliki sumbatan kapas.

4. Masukkan dalam autoclave pada suhu 121oC, selama 30 menit.

5. Setelah selesai disterilisasi, simpan alat dalam oven bersuhu 80oC

selama 24 jam. Selanjutnya alat disimpan dalam kotak peralatan steril

yang sudah disediakan.

3.2.2 Sterilisasi media dengan autoclave

1. Larutkan nutrient agar NA bubuk dengan aquadest sesuai keperluan.

2. Panaskan larutan dengan hotplate sampai larut semua. Kehilangan

aquadest selama pemanasan diganti dengan penambahan aquadest.

3. Sterilisasi dalam autoclave suhu 121oC, selama 30 menit.

3.2.3 Pembuatan media

1. Timbang 12 gram media NA

2. Larutkan dengan air panas sampai benar-benar homogeny

3. Tuang kedalam Erlenmeyer, sumbat dengan penyumbat, tutup dengan

plastik dan ikat dengan rapat

4. Sterilisasi dengan autoclave

3.2.4 Pengenceran

1. Timbang sampel tanah sebanyak 1 gram, kemudian larutkan dalam air

di beaker glass sebanyak 100 ml (10-1). Kemudian homogenkan.

Masukkan dalam Erlenmeyer, dan tutup dengan sumbat kapas.

2. Tulis kode kelompok dan tanggal pada permukaan luar dasar cawan

petri. Beri nomor di bagian atasnya.

3. Ambil 6 tabung reaksi berisi air steril masing-masing 9 ml, letakkan di

rak tabung reaksi.

4. Langkah selanjutnya dapat dilihat di gambar

5. Ambil 1 ml campuran biakan secara aseptic dengan pipet mikro,

pindahkan ke tabung reaksi 1, kocok dan homogenkan (10-2)

6. Ambil 1 ml dari tabung reaksi 1 campuran biakan secara aseptic dan

pindahkan ke tabung reaksi 2, kocok dan homogenkan (10-3). Lakukan

hal yang sama sampai pengenceran (10-12).

3.2.5 Metode Cawan Tuang

1. Dari masing-masing tabung, pindahkan 1 ml campuran biakan secara

aseptic ke 4 cawan petri steril dengan menggunakan pipet mikro steril.

Beri penomoran dan keterangan pengenceran pada cawan petri sesuai

dengan asal biakan tabung.

2. Tambahkan media agar cair bersuhu kurang lebih 40o C secukupnya

kedalam cawan petri secara aseptic. Dengan posisi cawan petri di meja

kerja, putar-putarkan cawan petri searah jarum jam sebanyak 5 kali

kemudian berlawanan arah jarum jam sebanyak 5 kali. Selanjutnya

putarkan cawan petri membentuk angka 8 sebanyak 5 kali. Kemudian

biarkan biakan beku.

3. Bungkus cawan petri dengan kertas pembungkus dan inkubasi selama

2 x 24 jam di incubator oven dalam keadaan terbalik (tutup cawan di

bawah) pada suhu yang sesuai.

4. Amati diameter warna, bentuk, ketinggian/elevasi, tepian koloni yang

terbentuk. Serta ada tidaknya jamur yang terbentuk.

3.2.6 Pewarnaan Gram

1. Mengambil sebuah gelas benda, dan membersihkan dengan tissue

2. Memanaskan gelas benda kira – kira 10 – 20 x diatas nyala api

sehingga debu dan lemaknya hilang.

3. Meletakkan kaca obyek, dengan sisinya yang tidak berlemak pada

bagian atas rak tabung reaksi dan membiarkan sampai dingin.

4. Menaruh setetes air diatasnya (tetesan ini harus menyebar sama rata).

Jika tidak menyebar berarti lemaknya masih belum hilang dan

pekerjaannya harus diulang.

5. Membakar lup inokulasi hingga. Dengan jarum ini, mengambil sedikit

bakteri dari biakannya dan meletakkan dipinggir tetesan tersebut

6. Kemudian mencampurkan bakteri dalam tetesan air dengan

menggosokkan lup inokulasi dalam suspensi tersebut hingga terdapat

suatu lingkaran dengan garis tengah kira – kira 1 cm.

7. Jumlah bakteri yang tepat ditunjukkan jumlah bakteri yang tepat keruh.

8. Memijarkan jarum yang telah dipakai. Mengeringkan suspensi bakteri

tersebut. Tetapi jika ingin mempercepat keringnya suspensi tersebut,

preparat boleh dipanaskan dengan hati – hati dengan

menggoyangkannya selama 30 menit di atas nyala api kecil.

9. Membuat dua garis tebal di kanan kiri preparat dengan sebuah potlot

kaca. Hal ini berguna untuk menahan aliran larutan zat warna keluar

dan sebagai penandaan.

10. Memfikserkan preparat tersebut dengan menggerakkan kaca obyek,

dengan bagian atas yang ada preparatnya. Hal ini dilakukan beberapa

kali dengan melalui api pembakar spiritus.

11. Mewarnai dengan karbon Kristal violet, diamkan selama 1 menit.

12. Mencuci sebentar dengan air.

13. Meneteskan larutan lugol (iodium) pada preparat dan di diamkan

selama 1 menit.

14. Mencuci dengan menggunakan alcohol 95% selama 10 – 20 detik

dengan menggoyangkan preparat di dalam gelas kimia yang berisi

alcohol.

15. Membilas dengan air sebentar.

16. Meletakkan preparat ini tegak lurus di atas kertas serap / tissue,

sehingga sebagian besar airnya diserapa.

17. Mewarnai dengan larutan safranine selama 20 detik.

18. Mencuci dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap / tissue.

19. Mengamati dengan mikroskop perbesaran kuat tanpa gelas penutup.

20. Mencatat jenis mikroba yang diperiksa, dan membedakan antara gram

negatif dan gram positif.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Sterilisasi alat dan media

1. Autoclave

2. Air

3. Media agar NA

4. Tabung reaksi

5. Erlenmeyer

6. Cawan petri

7. Pipet ukur

8. Tip pipet mikro

3.3.2 Pengenceran

1. Sampel tanah tanaman jagung

2. Air steril

3. Erlenmeyer

4. Beaker glass

5. Lampu spirtus

6. Korek api

7. Tabung reaksi

8. Sumbat kapas

9. Rak tabung reaksi

10. Pipet mikro

11. Tip pipet mikro steril

12. Vortex mixer

3.3.3 Metode cawan tuang

1. Tabung reaksi berisi biakan mikroba

2. Pipet mikro

3. Tip pipet mikro steril

4. Cawan petri steril

5. Media steril

6. Lampu spirtus

7. Incubator oven

8. Spidol

3.3.4 Pewarnaan gram

1. Gelas benda

2. Kaca penutup

3. Lup inokulasi

4. Bak pewarna

5. Rak tabung reaksi

6. Pembakar spirtus

7. Botol semprot

8. Penjepit kayu

9. Biakan bakteri hasil isolasi

10. Seperangkat pewarna gram meliputi : Ungu Kristal, Larutan KI, Alkohol

95 %, Safranin.

SKEMA KERJA

Sterilisasi alat dan media

1 gram tanah + 100 ml air steril

Penuangan media pada cawan petri yang sudah disiapkan

Pengenceran biakan sebelum diinokulasi pada media

Inokulasi biakan mikroba yang telah mengalami proses pengenceran pada cawan tuang dengan pengenceran 10-2, 10-3, 10-4 sampai 10-12

Metode cawan tuang

Pewarnaan

Pewarnaan Gram

Pengamatan di bawah mikroskop

HASIL SPESIFIK MIKROBA

BAB IV

DATA HASIL PENGAMATAN

Studi lapangan ini bentujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari

biakan campuran dan mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Pada Studi

Lapangan ini kami mengisolasi bakteri Azotobacter Chroococcum.

Berikut ini adalah langkah-langkah dan hasil percobaan yang telah kami

lakukan dari proses isolasi terhadap bakteri Azotobacter Chroococcum.

No Tanggal Percobaan Kegiatan yang Dilakukan

1. Rabu, 4 Desember 2013 4 Pembuatan media.

Bahan : NA 12 gram + 600 ml aquades

5 Sterilisasi alat yang meliputi 20 tabung

reaksi, 10 cawan petri, erlenmeyer berisi

media NA, aquades, pipet ukur 10 ml, dan

tip pipet mikro yang berlangsung selama 2

jam.

6 Pengenceran yang berasal dari sampel

tanah tanaman jagung (10-1- 10-12)

7 Penuangan biakan mikroba ke dalam

cawan petri.

8 Penuangan media ke dalam 10 cawan petri

(10-3 – 10-12)

9 Membungkus cawan petri berisi inokulum

dan menyimpannya ke dalam incubator

oven selama 2 x 24 jam.

2. Jumat, 6 Desember 2013 Memindahkan cawan tuang dari incubator oven

ke dalam lemari pendingin.

3. Rabu, 11 Desember 2013 1. Pengamatan bentuk koloni bakteri hasil

isolasi cawan tuang

2. Pengamatan bentuk morfologi bakteri

Azotobacter Chroococcum

3. Pewarnaan bakteri dengan pewarnaan

gram

Hasil Pengamatan Koloni pada Cawan Tuang

No. Gambar Keterangan

1. Pengenceran 10 -5 Bentuk:

Bundar

Elevasi:

Timbul

Tepian: Licin

Warna: Putih

Bentuk:

Bundar

Elevasi:

Timbul

Tepian: Licin

Warna:

Kuning

2. Pengenceran 10 -6 Bentuk:

Rizoid

Elevasi:

Berbukit-

bukit

Tepian:

Berombak

Warna:

Bening

3. 10 -7

Bentuk: Tak

beraturan dan

menyebar

Elevasi:

Seperti kawah

Tepian:

Berlekuk

Warna: Putih

4. 10 -8

Bentuk:

Bundar

dengan tepian

kerang

Elevasi:

Elevasi

berbukit-bukit

Tepian: Tak

beraturan

Warna:

Kuning

Bentuk: Bulat

Elevasi:

Timbul

Tepian:

Timbul

Warna:

Orange susu

5. 10 -9

Bentuk:

Bundar

dengan tepian

menyebar

Elevasi: Datar

Tepian:

Menyebar

Warna:

Kuning

Bentuk:

Bundar

Elevasi:

Timbul

Tepian: Licin

Warna:

Kuning tua

6. 10 -10

Bentuk: Tak

beraturan dan

menyebar

Elevasi:

Berbukit-

bukit

Tepian:

Melekuk

Warna: Putih

7. 10-12

Bentuk: Tak

beraturan dan

menyebar

Elevasi:

Seperti kawah

Tepian:

Melekuk

Warna: Putih

Data Hasil Perhitungan Colony Counter

No. Pengenceran Jumlah

1. Pengenceran 10-3 > 300 koloni



4. Pengenceran 10-6 288 koloni







Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri Azotobacter Chroococcum

Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Azotobacter Chroococcum

BAB V

PEMBAHASAN

Studi lapangan (Stula) Bioproses dimulai pada 4 Desember 2013 dengan

melakukan sterilisasi alat-alat dan bahan yang akan digunakan dalam Stula. Pada

tanggal ini dillakukan sterilisasi alat yang akan digunakan dalam Studi Lapangan.

Alat dan bahan yang disetrilisasi meliputi: 20 tabung reaksi, 10 Cawan Petri,

erlenmeyer berisi media NA, aquades, pipet ukur 10 ml, dan tip pipet mikro yang

berlangsung selama 2 jam. Proses sterilisasi ini, menggunakan autoclave dengan

program 2 yaitu sterilisasi pada suhu 121oC dalam waktu 30 menit.

Sterilisasi ini bertujuan untuk menghindari alat-alat agar tidak

terkontaminasi saat akan digunakan dan menjaga kesterilan saat praktikum.

Setelah sterilisasi dilakukan langkah selanjutnya adalah melakukan pengenceran

dari sampel tanah tanaman jagung. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi

jumlah mikroba yang akan di isolasi dan memudahkan perhitungan. Dalam

melakukan langkah ini dan seterusnya, harus dilakukan dengan aseptic, yaitu

menyemprotkan tangan dengan ethanol 70% dan memakai masker, bersihkan

meja dan sekitarnya dengan menggunakan ethanol dan nyalakan lampu spirtus.

Pengenceran dilakukan dengan mengencerkan 1 gram sempel tanah + 100 ml

aquades yang dimasukkan dalam erlenmeyer lalu homogenkan, ini merupakan

pengenceran 10-2. Siapkan 12 tabung reaksi yang masing- masing berisi 9 ml air

steril. Kemudian dengan menggunakan pipet mikro ambil 1 ml inokulum yang ada

di erlenmeyer tadi lalu campurkan ke tabung reaksi 1 dan homogenkan

menggunakan vortex mixer, ini merupakan pengenceran 10-3. Setelah itu ambil 1

ml biakan bakteri dari tabung reaksi 1 kemudian campurkan ke tabung reaksi 2

dan homogenkan menggunakan vortex mixer, ini merupakan pengenceran 10-4.

Dilanjutkan seterusnya dengan cara yang sama sampai pengenceran 10-12.

Setelah pengenceran dilakukan selanjutnya penuangan biakan bakteri dari

tabung reaksi pada masing-masing cawan petri yang telah disiapkan. Diambil 1 ml

biakan bakteri dari masing-masing tabung dengan menggunakan pipet mikro,

tuang ke dalam cawan petri, jangan lupa untuk menuliskan tanda di luar cawan.

Lakukan langkah ini secara aseptik. Tuang media yang masih hangat dengan suhu

kurang lebih 45oC kedalam cawan hingga kurang lebih setengan dari tinggi

cawan. Jangan terlalu banyak dan jangan terlalu sedikit. Dengan posisi cawan

petri di meja, cawan diputar searah jarum jam 5 kali kemudian berlawanan arah

jarum jam 5 kali. Selanjutnya cawan petri diputar membentuk angka 8 sebanyak 5

kali. Langkah tersebut dilakukan sama sampai cawan petri terisi biakan bakteri

dari semua tabung reaksi. Kemudian dibiarkan beku, dibungkus dengan kertas

pembungkus dan di inkubasi selama 2x24 jam dalam incubator oven dengan

keadaan terbalik.

Gambar : Pemindahan biakan bakteri kedalam cawan petri sebelum di tuangkan

media

Gambar : Cawan petri yang harus dijaga ksterilannya dengan berada di area

pembakar spirtus tidak lebih dari 30 cm

Gambar : Tabung reaksi berisi pengenceran

Gambar : Media NA setelah disterilisasi

Selanjutnya pada hari Jumat, 6 Desember 2013 dilakukan pemindahan

cawan dari incubator ke dalam lemari pendingin, karena waktu inkubasi sudah

selesai yaitu 2x24 jam atau 2 hari.

Pada tanggal 11 Desember 2013 dilakukan pengamatan terhadap bakteri

yang telah tumbuh di cawan tuang yang telah di inkubasi selama 2 hari. Ternyata

koloni-koloni dari bakteri tumbuh dengan sangat baik pada media.

Kemudian bakteri-bakteri yang tumbuh dalam cawan dihitung dengan

menggunakan colony counter, hal ini dimaksudkan agar mengetahui berapa

banyak bakteri yang ada dalam cawan tuang dari masing-masing pengenceran

yang telah dilakukan. Dari hasil colony counter diperoleh data sebagai berikut:

1. Pada pengenceran 10-3> 300 koloni



4. Pada pengenceran 10-6 = 288 koloni







Jumlah perhitungan bakteri berbanding terbalik dengan pengencerannya

karena, semakin tinggi pengenceran maka semakin sedikit bakteri yang tumbuh

dan sebaliknya. Dan berdasarkan hasil yang didapatkan dapat diketahui bahwa

bakteri yang tumbuh dari masing-masing pengenceran semakin sedikit. Dan tidak

di dapati adanya kontaminan yang merusak tumbuhnya bakteri.

Setelah melakukan perhitungan bakteri, dilakukan pengamatan bentuk

morfologi bakteri dengan menggunakan mikroskop. Pengamatan yang dilakukan

pertama kali adalah pengamatan terhadap bentuk, warna koloni, elevasi, dan

tepian koloni. Dilihat dari hasil pengamatan, terdapat berbagai macam bentuk

bakteri yang tumbuh dalam cawan tuang ini dikarenakan di dalam tanah terdapat

banyak sekali bakteri sehingga untuk mengisolasi bakteri Azotobacter

Chroococcum harus dilakukan sampai pengenceran yang tinggi agar bakteri

benar-benar terisolasi menjadi tunggal dan tidak bercampur dengan bakteri-yang

lainnya. Setelah diamati dari koloni yang mempunyai bentuk bulat, tepian licin,

elevasi timbul dan warna putih pada cawan pengenceran ke 10 -12 didapatkan

bakteri Azotobacter Chroococcum.

Gambar : Koloni bakteri Azotobacter Chroococcum

Gambar : Bakteri Azotobacter Chroococcum setelah diamati menggunakan

mikroskop

Bentuk morfologi bakteri yang di dapatkan setelah pengamatan sesuai dengan

bentuk morfologi Azotobacer Chroococcum berdasarkan literature yaitu memiliki

bentuk bulat.

Gambar : Literatur bentuk morfologi bakteri Azotobacer

Chroococcum

Dan setelah itu dilakukan pewarnaan terhadap bakteri. Pewarnaan yang

dilakukan adalah pewarnaan gram. Pewarnaan gram atau metode gram adalah

suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok

besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik

dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan

Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik

tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan

bakteri Klebsiella pneumonia.

Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna

metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis

tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri

gram negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi

antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur

dinding sel bakteri.

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram

positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,

sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna

penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang

membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda.

Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Didapatkan hasil pewarnaan sebagai berikut.

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun

mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik

aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja,

bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal

tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar

mendapatkan pengukuran yang akurat.

Sample biakan diambil dengan menggunakan lup inokulasi kemudian di

letakkan pada kaca preparat. Kemudian dikering udarakan atau fiksasi udara agar

bakteri menempel pada kaca preparat. Fiksasi panas atau dikeringkan dengan

pemanasan biasanya di atas spirtus pada pewarnaan gram dapat menyebabkan

bakteri tersuspensi mati atau tidak produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun

dapat melekatkan bakteri pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri diteteskan

Kristal ungu yang berfungsi memberikan pewarnaan pada bakteri tersebut. Bakteri

akan berwarna ungu. Penetesan Kristal ungu harus merata pada seluruh area

biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat terwarnai denga sempurna.

Bakteri yang telah diwarnai dikering udarakan selama satu menit sambil

digoyangkan. Lalu dibilas dengan aquades dengan cara mengalirkannya, bukan

dengan penyemprotan secara langsung pada bakteri tersebut karena dapat

menyebabkan bakteri rusak terkena semprotan aquades. Bakteri dikering udarakan

kembali.

Setelah itu, ditambahkan KI (Kalium Iodida) agar dapat menyatu dengan

ungu Kristal yang membentuk kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna

ungu. Kemudian dikering udarakan dan dibilas dengan aquades. Alkohol 96%

ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke

dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu

dan KI (UK-Y) pada gram negative, karena mengandung lipid sedangkan pada

gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung

peptidoglikan.

Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada dinding selnya dan

pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel dan membrane menurun

sehingga kompleks UK-Y tidak dapat keluar dari sel dan tetap berwarna ungu.

Sedangkan pada gram negative lipid tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-

pori mengembang sehingga kompleks UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak

berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan dinding sel. Setelah

dibilas, penambahan safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi

untuk mewarnai gram negative yang semula telah luntur pewarnaannya menjadi

warna merah. Hasil akhinya adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu dan

bakteri gram negative akan berwarna merah.

Dapat diketahui setelah pengamatan dengan mikroskop bahwa bakteri

Azotobacter Chroococcum merupakan bakteri gram negatif karena setelah

dilakukan pewarnaan bakteri berwarna merah dan tidak dapat mempertahankan

warna ungu setelah ditambah metil ungu. Ini menunjukkan bahwa lipid pada

bakteri Azotobacter Chroococcum tereksitasi (keluar) dari dinding sel dan pori-

pori mengembang sehingga kompleks UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak

berwarna atau warna ungu akan luntur karena peluruhan dinding sel.

BAB IV

PENUTUP

9.1 Kesimpulan

1. Bentuk bakteri Azotobacter Chroococcum berdasarkan hasil pengamatan

adalah coccus (bulat)

2. Koloni bakteri Azotobacter Chroococcum berbentuk bulat, elevasi timbul,

tepian licin dan berwarna putih

3. Bakteri Azotobacter Chroococcum merupakan bakteri gram negatif yang

ditandai dengan bakteri berwarna merah setelah diwarnai

4. Isolasi bakteri Azotobacter Chroococcum dilakukan dengan menggunakan

metode cawan tuang dengan media berupa NA

9.2 Kendala

1. Sampel tanah yang digunakan dalam keadaan agak basah, seharusnya

tanah kering sehingga bakteri yang dihasilkan kurang maksimal

2. Saat akan menuangkan media ke dalam cawan, waktu untuk menjaga

media pada suhu kurang lebih 45oC terlalu lama sehingga pada cawan

yang akhir, media yang dituangkan sudah agak menggumpal

9.3 Saran

1. Perlu diperhatikan efisiensi waktu dalam setiap langkah-langkah yang

akan dilakukan terutama saat pengamatan agar tidak ada waktu yang

terbuang sia-sia

2. Kekompakan dalam kelompok sangat diperlukan untuk mendukung dan

memperlancar kegiatan Studi Lapangan

3. Pengambilan data pada Studi Lapangan harus maksimal agar tidak

terdapat kekurangan data saat membuat laporan sehingga laporan yang

dibuat lebih lengkap

4. Diperlukan literatur yang lengkap untuk mendukung kelancaran kegiatan

Studi Lapangan. Karena dengan adanya literatur kita dapat

membandingkan hasil Stula yang diperoleh dengan teori yang telah

tersediasebelumnya sehingga hasil yang diperoleh lebih maksimal pula

DAFTAR PUSTAKA

Corolla, Edu.2009. http://educorolla2.blogspot.com/2009/03/peranan-bakteri-dalam-

kehidupan.html

Mauludinsohih, Ahmad.2013. http://seluruhilmu999.blogspot.com/2013/05/contoh-

makalah-mikrobiologi-tanah.html

Anonim.2013. http://www.pengertianahli.com/2013/10/pengertian-bakteri-dan-jenis-

jenis.html

Syifa, Almanda.2008. http://my.opera.com/allamandasyifa/blog/show.dml/4063352

Anonim. http://www.google.com/imgres?

sa=X&biw=1366&bih=629&tbm=isch&tbnid=tcz-1WYR-yXXLM:&imgrefurl=http://

my.opera.com/MCOB/albums/showpic.dml%3Falbum%3D53312%26picture

%3D649615&docid=QFT_NmgxkIlG2M&imgurl=http://files.myopera.com/MCOB/

albums/53312/

Azotobacter.jpg&w=283&h=283&ei=iR7AUs2yJ877rAf_74GQDg&zoom=1&ved=1t:3588,

r:4,s:0,i:90&iact=rc&page=1&tbnh=183&tbnw=180&start=0&ndsp=19&tx=63&ty=40

Endang, Herti. 2007. http://digilib.itb.ac.id/gdl.php?

mod=browse&op=read&id=jbptitbpp-gdl-hertiendan-31688

Anonym.2012. http://duniahayati.blogspot.com/2012/03/azotobacter-sang-bakteri-

nitrogen.html

Wedhastri, Sri. 2002. http://i-lip.ugm.ac.id/jurnal/detail.php?dataId=7255

Hamastuti, Hita. 2013. http://digilib.its.ac.id/its-Undergraduate-

23001130002377/25898

Dinata, Melissa. 2010. http://digilib.its.ac.id/google/?cx=partner-pub-

3496144705481397%3Aonvm6m-It7a&cof=FORID%3A11&ie=ISO-8859-

1&q=&sa=Search

Sarasati, Rasti. 2007. Metote Analisis Biologi Tanah. Jawa barat. Balai Besar

Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian.

laporan stula

Documents