LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

PERCOBAAN VI

“TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME”

Disusun Oleh :

NAMA : RUKMANA

STAMBUK : G 301 12 008

KELOMPOK : III (TIGA)

JURUSAN : KIMIA

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS TADULAKO

2013

97

BAB IPENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan

mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang

masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati

dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai

dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri

juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan

adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran

yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop dengan

menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat

pembesaran yang relatif tinggi.

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana.

Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri

hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah

bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat

basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk

pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya

bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri

yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan

penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu

zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna

terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.

Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini

merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara

komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang

disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada

98

komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini

maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan

bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta

mengikuti aturan dasar yang berlaku. Oleh karena itu yang melatar

belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan

mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian

bakteri.

1.2. Tujuan

Adapun tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu :

1. Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami teknik pewarnaan

mikroba.

2. Membedakan golongan bakteri gram positif dan gram negative.

3. Mengamati bentuk bakteri pada preparat dibawah mikroskop.

99

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa

yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan

bergantung,menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain. Tetapi

pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat

bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan.

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain

bakteri itu tidak berwarna  juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal

tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat

terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini

merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi (Dwijoseputro, 2005).

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.

Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk

diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga

berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding

sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Mikroorganisme sulit dilihat dengan

mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya.

Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai

mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan

membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya

ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel

seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.

Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut

pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan

mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi

kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah

100

pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-

kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus

dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada

umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak

bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk

sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel

bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat

fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada

tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu,

bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau

sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan

oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan

pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp

(Lay, 1994).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian

warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).

Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh

ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut

berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat

asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat

warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna

adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo,

1990).

            Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada

zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut

kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian

yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa

lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel,

101

membran sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat

warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga

mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 1998).

            Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk

mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai

mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang

sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat

berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat

warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu

diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat

berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan

(Dwidjoseputro, 1998).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme

disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat

warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan

negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling

mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme

yang tak berwarna (Dwidjoseputro,1998).

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek.

Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah

cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati.

Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang

terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.

Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh

kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo, 1991).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa,

tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba

dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca

objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan

sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan

latar belakang hitam (Lay, 1994).

102

BAB III

METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat

Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah:

Hari/ Tanggal : Senin, 09 Desember 2013

Pukul : 13.00 WITA - Selesai

Tempat : Laboratorium Biologi Dasar Jurusan Biologi FMIPA

UNTAD

3.2. Alat Dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu :

A. Alat

1. Gelas objek

2. Jarum ose

3. Kaca preparat

4. Bunsen

5. Mikroskop

6. Pipet tetes

B. Bahan

1. Biakan murni Escherichia coli

2. Medium NA (Nutrient Agar)

3. Larutan Methylen blue

4. Alkohol 70%

5. Aquades steril

6. Spritus

7. Tissue

3.3. Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja yang dilakukan pada percobaan ini adalah :

1. Mensterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%.

103

2. Mengeringkan (mengelap) dengan tissue.

3. Mengambil inokulum/biakan Escherichia coli dengan jarum ose dan

meletakkan di atas kaca objek.

4. Memfiksasi diatas lampu bunsen , setelah kering , menetesinya dengan

larutan methylen blue, dan membiarkannya selama 1-2 menit.

5. Mencuci objek dengan air yang mengalir hingga zat warnanya hilang.

6. Mengeringkan kaca preparat dengan tissue.

7. Mengamati objek dibawah mikroskop dan mencatat hasil pengamatan.

104

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

No. Objek Bentuk Warna

1.

Biakan murni Escherichia coli

Basil (Batang) Merah

105

4.2. Pembahasan

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang

dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi

mikroorganisme.  Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa

dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat

digunakan untuk identifikasi awal. 

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram

negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau

Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah

Eschericia Coli. Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat

warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan

berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram negatif

akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua

jenis bakteri ini  terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan

mempertaahankan warna ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol. Pada

percobaan ini yang dilakukan hanyalah pengujian pada bakteri gram negative

yaitu Eschericia Coli.

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri

yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar

belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan

umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-

sel bakteri melainkan melatar  belakangi sehingga kelihatan atau nampak

sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak

langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam

sel bakteri melainkan ke dalam latar belakangnya.

Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk

mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan

106

negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk

membedakan spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan

pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang

diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak

mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu

dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan

untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak mengalami

perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif

memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas. Fungsi zat

warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat

ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama

dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target.

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun

mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik

aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan

meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih

dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak

diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.

Pada proses pewarnaan gram, harus gelas objek yang bersih.

Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu.

Pembersihan biasanya  menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di

beri satu tetes aquades pada permukaan gelas objek. Kultur bakteri murni

diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak

diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan

apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan

tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu

menjadi tidak jelas.

Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas

nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada

kaca objek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan

pencucian. Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat

107

berpenetrasi kedalam endospore. Yang perlu diperhatikan dalam proses

fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena

nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram

methylen blue selama 1-2 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan

dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue

untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air

bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.

Disisi lain bakteri garam negatif seperti Eschercia coli memiliki sistem

membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar

permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan

yang terletak di antara membran dalam dan luarnya, bakteri ini juga bersifat

patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen

ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif

terutama lapisan lipopolisakarida.

Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi

bakteri Eschercia coli mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna

merah. Bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram negatif, karena

menunjukkan ciri-ciri dari bakteri gram negatif.

108

BAB VPENUTUP

5.1. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :

1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat

digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram

positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi

bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan

bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.

2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna

methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai

lapisan peptidoglikan yang tebal.

3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna

methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai

lapisan peptidoglikan yang tipis.

4. Bakteri Eschercia coli merupakan bakteri gram negative yang

mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna merah. Bakteri ini

memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti

oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal

berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan

luarnya, bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya

bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan

komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan

lipopolisakarida.

5.2. Saran

Untuk praktikum selanjutnya dalam pengerjaannya harus lebih teliti

lagi agar diperoleh hasil yang akurat.

109

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D., 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.

Hadiutomo, 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Jakarta : PT. Gramedia.

Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Sutedjo, M.,1991, Mikrobiologi Tanah, Rhineka Cipta, Jakartaa.

.

110