gdlhub-gdl-s3-2013-kusumadjaj-26598-14.-bab--a

7/25/2019 gdlhub-gdl-s3-2013-kusumadjaj-26598-14.-bab--a

1/29

118

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Asam Fitat dan Garam Fitat

Struktur asam fitat atau mio-inositol-1,2,3,4,5,6-heksakis dihidrogen

fosfat diilustrasikan pada Gambar 2.1. Asam fitat merupakan cairan kental tidak

berwarna, yang larut dalam air, etanol, aseton, serta tidak larut dalam pelarut

organik seperti eter, benzena, dan kloroform. Garam-garam fitat pada

umumnya larut pada pH rendah tetapi akan mengendap pada pH tinggi (Wyss et

al., 1999).

Asam fitat/garamnya relatif tahan terhadap pemanasan (Noor, 1992).

Pemanasan pada suhu 81 oC hanya mampu menghidrolisis asam fitat maupun

garam fitat sebesar 7%, sedangkan pemanasan pada suhu 116 oC, tekanan 15 psi,

selama 1 jam, hanya mampu menyebabkan degradasi asam fitat/garamnya sebesar

22%. Ikatan ester fosfat pada asam fitat/garamnya sangat stabil terutama pada

kondisi basa. Hidrolisis secara kimia pada kondisi asam berlangsung dengan

Gambar 2.1. Struktur kimia asam fitat. Gugus fosfat pada C nomor

2 berposisi aksial, sementara gugus fosfat yang lainnya

berposisi equatorial (Turner et al., 2002).

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Desertasi PENAPISAN,KARAKTERISASI ..... ALINE PUSPITA KUSUMADJAJA


2/29

119

kecepatan rendah, di mana hidrolisis maksimum terjadi pada pH 4,5. Bahkan pada

kondisi di mana hidrolisis berlangsung selama 6 jam, menggunakan HCl pekat

atau H2SO4pekat, pada suhu 100o

C, asam fitat/garamnya tidak dapat terdegradasi

secara sempurna. Selain secara kimia, asam fitat/garamnya dapat terdegradasi

secara enzimatik, yaitu dengan menggunakan enzim fitase.

Seperti diilustrasikan pada Gambar 2.1, asam fitat memiliki dua belas

atom hidrogen yang terikat pada gugus fosfat, yang dapat terdisosiasi membentuk

ion hidrogen. Kedua belas atom hidrogen tersebut memiliki harga pKa yang

bervariasi seperti tercantum pada Tabel 2.1. Enam ion hidrogen memiliki harga

pK1 1,1

pK2 1,5

pK3 1,5

pK4 1,7

pK5 2,1

pK6 2,1

pK7 5,7

pK8 6,9

pK9 7,6

pK10 10,0

pK11 10,0

pK12 12,0

pKa 1,1 2,1 ; tiga ion hidrogen memiliki harga pKa 5,7 7,6 ; dan tiga ion

hidrogen sisanya memiliki harga pKa 10 12 (Turner et al., 2002). Dengan

demikian, asam fitat bermuatan negatif pada berbagai variasi pH. Hal ini

Tabel 2.1. Data pKa Mio-Inositol- Heksakisfosfat (Turner et al., 2002)




3/29

120

menyebabkan asam fitat mudah berikatan dengan kation-kation logam multivalen

dan juga dengan protein yang bermuatan positif (Talamond et al., 1998).

Menurut IUPAC-IUB (1989) asam fitat disebut juga mio-inositol-

1,2,3,4,5,6-heksakis dihidrogen fosfat. Penamaan ini berdasarkan aturan Agranoff

yang disebut Agranoffs turtle. Menurut aturan Agranoff seperti diilustrasikan

pada Gambar 2.2, asam fitat memiliki 6 gugus fosfat yang terdiri dari 1 gugus

fosfat berposisi aksial, 4 gugus fosfat berposisi ekuatorial, dan 1 gugus fosfat

berposisi ekuatorial yang letaknya tepat berseberangan membentuk sudut 180o

dengan gugus fosfat aksial. Penomoran asam fitat dapat dilakukan berdasarkan

konfigurasi D atau konfigurasi L. Pada konfigurasi D: nomor terkecil dimulai dari

gugus fosfat yang terletak disebelah kanan gugus fosfat aksial, terus bergerak

berlawanan arah jarum jam melewati gugus fosfat aksial menuju gugus fosfat

lainnya. Pada konfigurasi L: nomor terkecil dimulai dari gugus fosfat yang

terletak disebelah kiri gugus fosfat aksial, terus bergerak searah jarum jam

melewati gugus fosfat aksial menuju gugus fosfat lainnya (IUPAC-IUB, 1989 ;

1

234

5

6

1

2

3

4

5

6

Gambar 2.2. Sistem penomoran asam fitat. Simbol lingkaran / O menggambarkangugus fosfat. Gugus fosfat pada C nomor 2 berposisi aksial, sementara

gugus fosfat yang lainnya berposisi equatorial. Nomor berwarna merah

adalah penomoran dengan konfigurasi D yaitu berlawanan arah jarum

jam, sedangkan nomor berwarna hitam adalah penomoran dengan

konfigurasi L yaitu searah jarum jam.




4/29

121

Bohn et al., 2008). IUPAC-IUB merekomendasikan penomoran asam fitat

berdasarkan konfigurasi D.

Asam fitat terdapat dalam jenis tanaman kacang-kacangan, serealia,

dan biji-bijian penghasil minyak (Lott et al., 2000). Di dalam tanaman, asam fitat

terutama terdapat dalam bentuk garam fitat (disebut juga : fitin), yaitu sebagai

kalsium fitat atau magnesium fitat. Seperti diilustrasikan pada Tabel 2.2,

kandungan asam fitat/garamnya dalam beberapa tanaman seperti jagung, kedelei,

gandum, padi, adalah sebesar 1-2% berat kering. Namun, beberapa tanaman

lain dapat mengandung asam fitat/garamnya sebesar 3-6% berat kering.

Sumber % Asam fitat / garamnya

Jagung 0,9

Gandum 1,13

Beras 0,89

Kedelei 1,4

Biji Wijen 5,3

Biji Kapas 4,8

Biji Bunga Matahari 1,9

Kacang Tanah 1,9

Kacang Hijau 1,2

Kacang Koro 2,5

Kacang Arcis 1,70

Kelapa 2,38

Lokasi terdapatnya asam fitat/garamnya di dalam tanaman tergantung

dari jenis tanaman tersebut. Pada gandum dan padi, sebagian besar asam

fitat/garamnya terdapat dalam lapisan aleuron dan perikarp, sedangkan pada

Tabel 2.2. Kandungan Asam Fitat/Garamnya Pada

Beberapa Tanaman (Lott et al., 2000)




5/29

122

jagung hampir 90% asam fitat/garamnya terdapat di dalam lembaga. Di dalam

biji-bijian penghasil minyak, sebagian besar asam fitat/garamnya terdapat di

dalam lapisan aleuron. Sementara itu, tidak terdapat lokasi khusus asam

fitat/garamnya di dalam kedelei (Bohn et al., 2008).

Pada tanaman, asam fitat/garamnya merupakan bentuk penyimpanan

mineral fosfor yang utama. Sekitar 60-90% dari total mineral fosfor pada tanaman

tersimpan dalam bentuk garam fitat, yaitu sebagai Ca-fitat atau Mg-fitat. Di

samping berperan dalam penyimpanan fosfor, asam fitat/garamnya juga

merupakan bentuk penyimpanan energi dan mineral penting seperti K, Ca, Mg,

Zn, Fe, Mn, yang sangat dibutuhkan pada proses pertumbuhan tanaman. Asam

fitat/garamnya juga merupakan sumber mio-inositol yang merupakan prekusor

dinding sel tanaman. Asam fitat/garamnya merupakan senyawa anti oksidan yang

baik. Asam fitat mampu membentuk kompleks dengan ion Fe2+, dan menghalangi

terbentuknya radikal bebas hidroksil (Rimbach and Pallauf, 1998).

Derivat senyawa inositol-fosfat yang merupakan hasil degradasi asam

fitat, berperan pada proses transport material melalui sel. Senyawa inositol-

trifosfat berperan terutama sebagai signal transduksi dan juga pada proses regulasi

sel tanaman maupun hewan (Marks et al., 2000).

2.2. Interaksi Asam Fitat dengan Mineral dan Protein

Asam fitat mengandung enam gugus fosfat yang bermuatan negatif

pada berbagai variasi harga pH. Oleh karena itu, asam fitat dapat berikatan dengan

ion ion logam seperti Zn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, maupun Cu2+,

membentuk senyawa kompleks. Interaksi asam fitat-mineral diilustrasikan pada




6/29

123

Gambar 2.3. Kation logam dapat berikatan dengan satu atau lebih gugus fosfat

yang terdapat pada satu molekul asam fitat atau kation logam dapat juga

membentuk jembatan diantara dua atau lebih molekul asam fitat.

Kestabilan dan kelarutan senyawa kompleks fitat-mineral dipengaruhi

oleh jenis kation, harga pH, maupun konsentrasi asam fitat dan konsentrasi kation

logam. Asam fitat membentuk senyawa kompleks yang paling stabil dengan ion

Zn2+. Kestabilan senyawa kompleks yang terbentuk menurun, sesuai dengan

urutan berikut : Cu2+, Co2+, Mn2+, Ca2+, dan Fe2+ (Konietzny et al., 2006).

Interaksi fitat-mineral menghasilkan senyawa kompleks yang larut maupun yang

tidak larut. Senyawa kompleks yang terbentuk antara asam fitat dengan kation

monovalen seperti K+ atau Na+, larut pada berbagai variasi pH. Sementara itu,

senyawa kompleks antara asam fitat dengan kation divalen, pada umumnya larut

pada pH rendah dan mengendap pada pH netral atau basa, terutama jika

konsentrasi kation divalen melebihi konsentrasi asam fitat. Senyawa Ca-fitat larut

pada pH di bawah 5,5 6 ; senyawa Mg-fitat larut pada pH di bawah 7,2 8 ;

Gambar 2.3. Interaksi antara asam fitat dengan ion logam(Noor, 1992).




7/29

124

sedangkan senyawa Zn-fitat larut pada pH di bawah 4,3 4,5. Sebaliknya,

senyawa Fe-fitat mengendap pada pH 1 3,5 dan larut pada pH di atas 4.

Adanya kation kedua atau kation lain di dalam larutan fitat-mineral

memberikan pengaruh yang saling bersinergi. Dua jenis kation yang berada

bersama di dalam larutan asam fitat, akan meningkatkan presipitasi senyawa

kompleks yang terbentuk. Contohnya : adanya ion Ca2+ akan meningkatkan

pengikatan Zn2+pada asam fitat membentuk senyawa kompleks Ca-Zn-fitat yang

tidak larut. Ion Mg2+juga berpotensi meningkatkan pengendapan Zn2+oleh asam

fitat. Pengendapan Mg2+oleh fitat dipermudah dengan adanya Na-fitat (Bohn et

al., 2004). Jumlah gugus fosfat yang terikat pada senyawa mio-inositol

mempengaruhi kelarutan senyawa kompleks fitat-mineral. Senyawa kompleks

mio-inositol-fosfat-mineral lebih mudah larut seiring dengan berkurangnya

jumlah gugus fosfat yang terikat pada cincin mio-inositol (Lott et al., 2000).

Asam fitat maupun garam fitat tidak tercerna atau tidak terdegradasi di

dalam saluran pencernaan hewan ternak maupun manusia. Asam fitat/garamnya

yang tidak terdegradasi ini, akan diekskresikan ke lingkungan. Dengan demikian,

pembentukan senyawa kompleks fitat-mineral yang tidak larut akan menghambat

absorpsi dan ketersediaan mineral-mineral penting di dalam sel. Berbagai

penelitian menunjukkan bahwa asam fitat/garamnya merupakan faktor penting

yang berperan menurunkan absorpsi terhadap mineral-mineral penting, terutama

Zn2+, Fe3+, Fe2+, Ca2+, maupun Mg2+. Defisiensi Zn2+ pertama kali dilaporkan

terjadi pada tahun 1960-an, yaitu pada anak dan remaja laki-laki di Mesir, Iran,

dan Turki dengan karakteristik tubuh pendek dan keterlambatan pematangan

seksual. Diduga, penyebab defisiensi ini karena makanan utama terdiri atas serelia




8/29

125

tumbuk dan kacang-kacangan yang tinggi akan serat dan asam fitat/garam fitat,

yang menghambat absorpsi Zn2+(Konietzny et al., 2006). Dengan menggunakan

ayam sebagai binatang percobaan, juga telah berhasil dibuktikan bahwa Zn yang

terkandung dalam makanan dasar dari isolat protein kedelei kurang dapat

dimanfaatkan untuk pertumbuhan ayam bila dibandingkan dengan Zn yang

terkandung dalam makanan dasar dari kasein (Yi et al., 1996). Penambahan asam

fitat ke dalam makanan dari kasein menyebabkan penurunan absorpsi Zn dalam

saluran pencernaan babi dan tikus.

Asam fitat maupun garam fitat yang tidak tercerna dalam saluran

pencernaan juga menurunkan ketersediaan mineral fosfor yang berasal dari asam

fitat/garamnya. Fosfor diabsorpsi sebagai ortofosfat, dan oleh sebab itu

pemanfaatan fosfor dari asam fitat/garamnya sangat bergantung pada proses

defosforilasi asam fitat/garamnya. Saluran pencernaan hewan ternak maupun

manusia tidak mampu mendegradasi asam fitat maupun garam fitat karena tidak

adanya enzim fitase, dan juga karena terbatasnya populasi mikroba dalam saluran

pencernaan. Di samping meningkatkan ketersediaan mineral fosfor, proses

defosforilasi asam fitat dan garamnya juga akan mengurangi pengaruh negatif

asam fitat/garamnya terhadap absorpsi mineral-mineral penting. Mio-inositol-

pentakisfosfat menghambat proses absorpsi Zn

2+

, Fe

2+

, Ca

2+

, Mg

2+

secara kuat,

sedangkan mio-inositol-trifosfat memiliki pengaruh yang kecil terhadap absorpsi

ion logam Zn2+, Fe2+, Ca2+, maupun Mg2+ (Lott et al., 2000).

Interaksi fitat-protein diilustrasikan pada Gambar 2.4. Interaksi

fitat-protein dipengaruhi harga pH larutan. Pada pH di bawah pH isoelektrik

protein, gugus fosfat asam fitat atau garam fitat berikatan kuat dengan protein




9/29

126

yang bermuatan positif, membentuk senyawa kompleks yang larut hanya pada pH

di bawah 3,5. Gugus-gugus protein yang berinteraksi dengan asam fitat

pada pH rendah antara lain : gugus -NH2terminal, gugus -NH2dari lisin, gugus

imidazol dari histidin, serta gugus guanidil dari arginin. Pada pH di atas pH

isoelektrik protein, baik asam fitat maupun protein bermuatan negatif. Tetapi

dengan adanya kation-kation multivalen, akan terbentuk senyawa kompleks fitat-

kation-protein. Gugus-gugus protein yang terlibat pada pembentukan senyawa

kompleks ini antara lain : gugus imidazol dari histidin dan juga gugus karboksil

protein.

Interaksi fitat-protein menyebabkan penurunan aktivitas enzim-enzim

pencernaan, serta menurunkan kelarutan dan daya cerna protein. Penurunan

konsentrasi asam fitat/garam fitat terbukti mampu meningkatkan ketersediaan

biologik asam amino. Asam fitat/garam fitat merupakan inhibitor bagi enzim-

enzim pencernaan seperti -amilase, lipase, pepsin, tripsin, maupun kimotripsin.

Pengaruh inhibisi asam fitat/garam fitat semakin kuat, seiiring dengan

meningkatnya konsentrasi fitat maupun bertambahnya jumlah gugus fosfat yang

Gambar 2.4. Interaksi antara asam fitat dengan protein(Selle et al., 2000).

PROTEIN

PROTEIN




10/29

127

terikat pada senyawa mio-inositol. Daya inhibisi asam fitat/garam fitat terhadap

enzim-enzim pencernaan diduga akibat protein yang berinteraksi dengan asam

fitat mengalami perubahan struktur. Daya inhibisi asam fitat juga dapat

disebabkan karena kemampuan asam fitat berinteraksi dengan ion Ca2+. Ion Ca2+

merupakan ion logam yang esensial untuk meningkatkan aktivitas tripsin,

-amilase, maupun enzim-enzim pencernaan yang lain.

2.3. Fitase

Fitase, yang juga dinamakan mio-inositol heksakisfosfat

fosfohidrolase, mengkatalisis reaksi hidrolisa asam fitat menghasilkan fosfat

anorganik dan mio-inositol pentakis-, tetrakis-, tris-, bis-, dan monofosfat.

Penggunaan fitase dalam jumlah berlebih akan menghasilkan produk akhir mio-

inositol-2-monofosfat. Keenam gugus fosfat yang terdapat dalam asam fitat akan

terhidrolisis jika digunakan gabungan enzim fitase dan fosfatase asam (Wyss et

al., 1999).

The Enzyme Nomenclature Committee of The International Union of

Biochemistry mengklasifikasikan tiga tipe fitase, yaitu 3-fitase (EC. 3.1.3.8), 4-

fitase (EC 3.1.3.26) dan 5-fitase (EC. 3.1.3.72). Klasifikasi ini didasarkan pada

posisi gugus fosfat pertama yang dihidrolisis enzim. Enzim 3-fitase, umumnya

terdapat pada mikroorganisme. Enzim ini memulai reaksi hidrolisis asam fitat

pada gugus fosfat posisi D-3, menghasilkan produk awal D-inositol (1,2,4,5,6) P5.

Enzim 4-fitase, biasanya terdapat pada tanaman. Enzim 4-fitase memulai reaksi

hidrolisis pada gugus fosfat D-4, menghasilkan produk awal D-inositol

(1,2,3,5,6)P5. Enzim 5-fitase memulai reaksi hidrolisis pada gugus fosfat D-5,




11/29

128

menghasilkan produk awal D-inositol (1,2,3,4,6)P5. Reaksi 3-fitase, 4-fitase, dan

5- fitase disajikan pada Tabel 2.3.

Fitase Reaksi dan Produk

3-fitase mio-inositol heksakisfosfat + H2O

D-mio-inositol 1,2,4,5,6 pentakisfosfat + fosfat





Fitase terbagi menjadi tiga subfamili yaitu histidin acid phosphatase

(HAP),-propeller phytase (BPP), danpurple acid phosphatase (PAP) (Fu et al.,

2008). Struktur tiga dimensi HAP diilustrasikan pada Gambar 2.5. HAP terdiri

dari domain / yang lestari dan domain yang bervariasi. Pusat aktif HAP

terletak pada interface diantara dua domain. Pusat aktif HAP menunjukkan suatu

urutan yang lestari yaitu RHGXRXP dan HD. Dua residu asam amino yang

berperan penting pada proses katalitik HAP adalah histidin dan asam aspartat.

Pada strukturnya HAP mengandung lima jembatan disulfida (Koestrewa et al.,

1999). Contoh fitase yang termasuk subfamili HAP antara lain fitase fungi yaitu

fitaseA. niger, fitase A. fumigatus, sedangkan fitase bakteri yang tergolong HAP

adalah 3-fitase dan 4-fitase dariE. coli.

Tabel 2.3. Reaksi Enzim Fitase




12/29

129

Fitase dari kelompok Bacillus merupakan contoh fitase subfamili

BPP. Struktur tiga dimensi BPP ditunjukkan pada Gambar 2.6. Enzim terdiri dari

lima 4-untai dan satu 5-untai lembar anti paralel yang tersusun disekitar sumbu

aksis simetri enam semu, yang terletak pada batang propeller, yang merupakan

suatu saluran di pusat terisi dengan banyak molekul air. BPP memiliki dua sisi

pengikatan substrat yaitu sisi pemutusan, yang bertanggung jawab terhadap

hidrolisis substrat, dan sisi afinitas, yang meningkatkan afinitas pengikatan

terhadap atom pada substrat yang mengandung gugus-gugus fosfat

berdekatan/bersebelahan. Pengikatan substrat pada BPP difasilitasi dengan adanya

ion Ca2+ yang berperan menciptakan lingkungan elektrostatik yang sesuai

(Mullaney and Ullah 2003).

Gambar 2.5. Struktur tiga dimensi HAP (Koestrewa et al., 1999).




13/29

130

Fitase-fitase tanaman sebagian besar termasuk subfamili PAP. Enzim

PAP merupakan metaloenzim, yang pada pusat aktifnya mengandung ion Fe3+dan

Zn2+. Asam amino yang berperan penting pada proses katalitik enzim antara lain

histidin 295 dan histidin 296. Struktur tiga dimensi PAP disajikan pada Gambar

2.7. Enzim PAP merupakan homodimer dan terdiri dari dua domain dengan

subunit-subunitnya, yaitu domain N-terminal dan domain C-terminal. Domain N-

terminal tersusun atas lembar , sedangkan domain C-terminal tersusun atas

stuktur lembar dan heliks. Pada domain C-terminal terdapat motif -

logam, di mana logam terkoordinasi pada ujung karboksil dari untai paralel.

Logam Fe terkoordinasi pada tirosin, histidin, dan aspartat, sedangkan logam Zn

Gambar 2.6. Struktur tiga dimensi BPP (Mullaney and Ullah 2003).




14/29

131

terkoordinasi pada histidin dan asparagin (Klabunde et al., 1996). Contoh fitase

yang termasuk subfamili PAP adalah fitase dari jagung, kedelei, kacang-

kacangan, gandum. Demikian juga fitase yang diisolasi dari hati dan ginjal tikus

(Craxton, et al., 1997).

2.4. Karakteristik Fitase

Enzim fitase dari berbagai sumber memiliki pH yang sangat

bervariasi, berkisar antara 2,2 hingga 8,0. Fitase mikrobial, terutama dari fungi,

memiliki pH optimum 4,5 hingga 5,6. Fitase dari A. fumigatusmemiliki kisaran

pH optimum yang luas yaitu antara 4,0 hingga 7,3 (Wyss et al., 1999), sedangkan

fitaseAniger memiliki dua pH optimum yaitu pH 2,5 dan pH 5 5,5 (Kim et al.,

2006). Fitase bakteri, terutama dari golongan Bacillus, memiliki pH optimum

Gambar 2.7. Struktur tiga dimensi PAP (Klabunde et al., 1996).




15/29

132

antara 6,0 hingga 7,5. Fitase dari kacang-kacangan memiliki pH optimum sekitar

8, sedangkan fitase dari jagung memiliki pH optimum 4,8.

Temperatur optimum fitase dari Aspergillus berkisar antara 40o

C

hingga 70 oC. Sementara itu fitase dari E. coli memiliki temperatur optimum

55 oC (Greiner, 1993). Fitase dariB.amyloliquefaciensDS11 memiliki temperatur

optimum 70 oC, dan memiliki kestabilan termal yang baik (Kim et al., 1998).

Enzim ini, dengan adanya CaCl2, masih memiliki aktivitas 100% setelah

diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70 oC. Fitase termofilik dari B.

laevolacticus memiliki temperatur optimum 70 oC, dan masih memiliki aktivitas

sebesar 80% setelah diinkubasi selama 3 jam pada pH 8 dan suhu 70 oC (Gulati et

al., 2007). Fitase S. thermophile memiliki aktivitas maksimum pada pH 5 dan

suhu 60 oC, serta masih memiliki aktivitas sebesar 50% jika dipanaskan selama

1,5 jam pada suhu 80 oC (Singh and Satyanarayana, 2009). Fitase T. lanuginosus

memiliki aktivitas maksimum pada pH 6 dan suhu 65 oC (Berka et al., 1998).

Fitase dari tanaman misalnya dari kedelei, jagung, memiliki temperatur optimum

55 oC (Bohn et al., 2008).

Massa molekul relatif (Mr) fitase berkisar antara 35-700 kDa. Fitase

Bacillus memiliki Mr antara 38-44 kDa, sedangkan berat molekul fitase fungi

berkisar antara 65-85 kDa. (Kerovuo et al., 2000). Fitase Klebsiella aerogenes

memiliki Mr yang tidak biasa, yaitu 700 kDa, sedangkan Mr fitase

Schwanniomyces castellii adalah 490 kDa.

Aktivitas spesifik merupakan salah satu faktor penting pada enzim

komersial karena berdampak langsung secara ekonomis. Aktivitas spesifik fitase

yang telah dikarakterisasi sejauh ini berkisar antara : kurang dari 10 U/mg (lily




16/29

133

pollen, mung bean, soybean) hingga lebih besar dari 1000 U/mg (Citrobacter

braakii, Candida krusei, Peniophora lycii), pada suhu 37 oC dan pH optimumnya

masing-masing (Greiner and Konietzny, 2006). Aktivitas spesifik yang terbesar

sampai saat ini dimiliki oleh fitase Citrobacter braakii (3457 U/mg), fitase

Candida krusei (1210 U/mg), dan fitase Peniophora lycii (1080 U/mg). Jika

dibandingkan dengan fitase tanaman, fitase mikroba memiliki aktivitas spesifik

yang lebih tinggi.

Selain asam fitat, beberapa enzim fitase dapat menghidrolisis ikatan

fosfoester pada senyawa-senyawa ADP, ATP, p-nitrofenil fosfat, fenilfosfat,

fruktosa 1,6-difosfat, glukosa-6-fosfat, -gliserolfosfat, dan -gliserolfosfat.

Berdasarkan spesifisitas terhadap substrat, fitase dibagi menjadi dua kelas, yaitu

fitase yang memiliki spesifisitas terhadap substrat yang beragam, dan fitase yang

spesifisitasnya tinggi hanya terhadap asam fitat.

Fitase dengan spesifisitas terhadap substrat yang beragam, misalnya

fitase dari A. fumigatus, Emericella nidulans dan Myceliophthora thermophila,

memiliki aktivitas spesifik yang rendah terhadap asam fitat (23 U/mg ke 43

U/mg). Sebaliknya, fitase dengan spesifisitas tinggi terhadap asam fitat, misalnya

fitase dari E.coli, A. niger, A. terrus, memiliki aktivitas spesifik yang tinggi

terhadap asam fitat (103 U/mg ke 811 U/mg). Perkecualian terjadi pada enzim

fitase dariBacillus. Enzim ini sangat spesifik terhadap asam fitat, tetapi memiliki

aktivitas spesifik yang rendah (Idriss et al., 2002).

Enzim fitase yang telah diteliti, sebagian besar mengikuti pola kinetik

Michaelis-Menten. Perkecualian terjadi pada fitase dari M. thermophilia dan E.

nidulans, di mana pola kinetikanya tidak sesuai dengan Michaelis-Menten. Fitase




17/29

134

dari E. colimemiliki nilai Kcat/Km 4,78. 107M-1. s-1 (Greiner et al., 1993), di

mana ini merupakan nilai yang tertinggi yang dilaporkan untuk fitase.

2.5. Sumber Gen Penyandi Fitase Dari Mikroorganisme

Dewasa ini penelitian mengenai kloning dan karakterisasi gen

penyandi fitase masih terus dilakukan. Gen-gen penyandi fitase yang telah diklon

dan dikarakterisasi sebagian besar berasal dari golongan Aspergillus, antara lain

dari Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae maupun

Aspergillus awamori(Uchida et al., 2006). Gen penyandi fitase bakteri yang telah

diklon dan dikarakterisasi antara lain berasal dari E. coli, Klebsiella, dan Bacillus.

Metode kloning yang digunakan pada golongan fungi maupun bakteri hampir

sama, yaitu dengan cara ekspresi langsung dan penapisan dari pustaka genom

yang dibuat dalam sel inang E. coli (shot gun cloning). Beberapa peneliti

melakukan kloning gen penyandi fitase dengan menggunakan polymerase chain

reaction (PCR). Fragmen DNA spesifik hasil amplifikasi dengan PCR langsung

diklon dalam E. coli, dan kemudian dikarakterisasi (misalnya dengan hibridisasi

dan sekuensing). Untuk mendapatkan fragmen DNA spesifik yang mengkode

fitase, tahap yang sangat penting adalah mendesain primer PCR. Primer PCR

didesain berdasarkan urutan residu asam amino N-terminal dan internal peptida,

atau primer PCR dapat didesain berdasarkan daerah yang lestari (homologi) dari

gen penyandi fitase beberapa mikroorganisme yang telah diteliti. Data homologi

ini dapat diperoleh dari databaseyang tersedia pada GenBank(Martin et al., 2003

; Zou et al., 2006).




18/29

135

Homologi gen-gen penyandi fitase beberapa mikroorganisme dapat

dijelaskan seperti penjelasan berikut ini. Pada A. nigerNRLL 3135 ditemukan

dua jenis fitase yaitu fitase A dan fitase B. Kedua fitase ini hanya memiliki

homologi sebesar 25% (Xiong et al., 2004). Fitase A yang berasal dari A. niger

var. awamorimemiliki homologi 97% dengan fitase dari A. nigerNRLL 3135.

Homologi yang lebih rendah dengan fitase A. nigerNRRL 3135 ditemukan pada

fitase dari A. fumigatus (65%), A. terrus (62%), E. nidulans (62%), T.

thermophilus(61%) danM. thermophila(46%). Enzim fitase B dari A. niger var.

awamori memiliki homologi 99% dengan fitase B dari A. niger NRLL 3135.

Pusat aktif enzim fitase gol Aspergillus menunjukkan suatu pola urutan yang

lestari yaitu RHGXRXP dan HD pada pusat aktif enzim. Urutan yang lestari ini

juga ditemukan pada pusat aktif fosfatase asam. Dua residu asam amino yang

diketahui berperan penting pada proses katalitik fitase maupun fosfatase asam

adalah histidin dan asam aspartat. FitaseAspergillus dengan demikian merupakan

subfamili dari fosfatase asam (Martin et al., 2003 ; Promdonkoy et al., 2009).

Bakteri E. colimengandung 2 jenis fitase yaitu 3-fitase dan 4-fitase.

Fitase dariE. colitidak menunjukkan homologi yang jelas dengan fitase dari A.

nigerNRLL 3135, tetapi pusat aktif kedua enzim menunjukkan suatu urutan yang

lestari yaitu RHGXRXP dan HD. Fitase E.coli dengan demikian termasuk

subfamili dari fosfatase asam (Chen et al., 2004).

Fitase dari Klebsiella sp. ASR1 (Sajidan et al., 2004) dan Klebsiella

pneumoniae subsp. pneumoniae XY-5 (Wang et al., 2004) juga menunjukkan

urutan lestari RHGXRXP dan HD pada pusat aktifnya. Fitase dariKlebsiella tidak

menunjukkan homologi yang jelas dengan fitase Aspergillus maupun fitase E.




19/29

136

coli. Namun karena adanya urutan yang lestari pada pusat aktifnya seperti tersebut

di atas, fitase dariKlebsiellatermasuk dalam subfamili histidin fosfatase asam.

Fitase dari Bacillus tidak menunjukkan homologi dengan fitase dari

Aspergillus maupunE. coli, dan terutama pusat aktif fitaseBacillustidak homolog

dengan histidin fosfatase asam. Pada pusat aktif fitase Bacillus tidak ditemukan

adanya urutan konserf RHGXRXP dan HD. Di samping itu, fitase Bacillus tidak

memiliki ikatan disulfida, di mana ikatan disulfida ini dibutuhkan untuk aktivitas

katalitik dan kestabilan konformasi fitase fungi. Gen-gen penyandi fitaseBacillus,

satu dan lainnya memiliki homologi berkisar 90% (Makarewicz et al, 2006 ; Fu et

al., 2008).

2.6. Polymerase Chain Reaction(PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode

enzimatis untuk mengamplifikasi secara eksponensial suatu urutan nukleotida

tertentu, secara in vitro. Saat ini metode PCR telah banyak digunakan untuk

berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.

Salah satu keunggulan metode PCR adalah metode ini sangat sensitif.

Sensitivitas tersebut membuat metode PCR dapat digunakan untuk

mengamplifikasi satu molekul DNA. Proses amplifikasi fragmen DNA secara

PCR diilustrasikan pada Gambar 2.8. Proses amplifikasi fragmen DNA dengan

PCR berlangsung secara eksponensial dan hanya membutuhkan waktu yang

singkat. Dengan menggunakan PCR, suatu fragmen DNA berukuran 110 bp dapat

diamplifikasi sebanyak 2 . 105 kali, setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220

menit (Erlich, 1992).




20/29

137

Kelebihan lain metode PCR adalah reaksi dapat berlangsung dengan

menggunakan komponen dalam jumlah sedikit. DNA cetakan yang diperlukan

hanya sekitar 5 g, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM, dan

reaksi biasanya dilakukan dalam volume 50-100 L. DNA cetakan yang

digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR

dapat digunakan untuk mengamplifikasi suatu sekuen DNA dalam genom bakteri

hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.

2.7. Prinsip Dasar Metode PCR

DNA cetakan

Siklus 1

Siklus 2

Siklus 3

Siklus 4

4 untaitunggal

DNA 8 untaitunggal

DNA16 untaitunggalDNA

32 untaitunggalDNA

Gambar 2.8. Amplifikasi eksponensial fragmen DNAdengan metode PCR (Erlich, 1992).




21/29

138

Komponen utama pada proses PCR adalah dua buah oligonukleotida

primer, DNA cetakan/DNA sampel, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), dan

enzim DNA polimerase (Glick and Pasternak, 2003).

Dua buah oligonukleotida primermerupakan sekuen oligonukleotida

pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer ini

panjangnya kira-kira 15-25 basa, dan komplementer pada suatu daerah yang

terdapat pada kedua untai DNA cetakan yang anti paralel. Daerah DNA yang

komplementer dengan primer mengapit urutan DNA target. DNA target yang

diamplifikasi secara PCR pada umumnya berukuran 100-10.000 bp. DNA target

ini terdapat pada DNA cetakan / DNA sampel dan terletak diantara sepasang

primer(Erlich 1992).

Enzim yang digunakan pada proses PCR adalah enzim DNA

polimerase. Enzim ini mengkatalisis reaksi sintesis DNA. DNA polimerase yang

digunakan untuk mengamplifikasi urutan DNA tertentu dalam proses PCR

haruslah DNA polimerase yang termostabil, tahan terhadap pemanasan pada suhu

95 oC atau lebih. Beberapa polimerase yang digunakan pada proses PCR antara

lain : Taq, Pwo, Pfu, Tli, yang masing-masing secara berurutan diisolasi dari

bakteri termofilik : Thermus aquaticus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus furiosis,

dan Thermus litoralis(Erlich, 1992). Semua polimerase tersebut stabil pada suhu

di atas 95 oC dan memiliki aktivitas maksimum pada suhu sekitar 75 oC.

Proses PCR memerlukan sejumlah siklus guna mengamplifikasi suatu

urutan DNA yang spesifik. Masing-masing siklus terdiri dari tiga tahap reaksi

yaitu : denaturasi, annealingprimer, dan sintesis DNA, seperti diilustrasikan pada

Gambar 2.9.




22/29

139

Tahap pertama amplifikasi suatu fragmen DNA secara PCR adalah

denaturasi DNA sampel sehingga molekul DNA yang beruntai ganda akan

terpisah menjadi untai tunggal. Denaturasi DNA dilakukan dengan cara

meningkatkan temperatur dalam tabung reaksi hingga suhu 95 oC (Glick and

Pasternak, 2003). Temperatur ini dipertahankan selama 1-2 menit.

Gambar 2.9. Tahap reaksi amplifikasi DNA dengan

metode PCR(Glick and Pasternak, 2003).

Primer(P1 dan P2)dalam

- Denaturasi

-Annealing primer

- TaqDNA

polimerase

Sintesis untai DNA




23/29

140

Pada tahap kedua, temperatur campuran reaksi diturunkan secara

perlahan-lahan hingga mencapai 55 oC (Glick and Pasternak, 2003). Selama tahap

ini, primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan DNA sampel pada daerah

sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Temperatur pada tahap ini

dipertahankan selama 1-2 menit.

Pada tahap tiga, temperatur ditingkatkan hingga 75 oC selama 1,5

menit (Glick and Pasternak, 2003). Temperatur ini merupakan temperatur

optimum bagi enzim TaqDNA polimerase. Pada temperatur ini DNA polimerase

akan melakukan proses polimerisasi untai DNA yang baru berdasarkan informasi

yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerisasi, untai DNA yang baru

akan membentuk ikatan hidrogen dengan untai DNA cetakan. DNA untai ganda

yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara untai DNA cetakan dengan

untai DNA baru hasil polimerisasi selanjutnya akan didenaturasi kembali dengan

meningkatkan suhu inkubasi menjadi 95 oC. Untai DNA yang baru tersebut

kemudian akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerisasi berikutnya.

Tahap-tahap reaksi tersebut di atas pada umumnya dilakukan

berulang-ulang hingga mencapai 25-30 siklus. Pada akhir siklus akan diperoleh

molekul-molekul DNA untai ganda baru hasil polimerisasi, dalam jumlah yang

jauh lebih banyak dibandingkan jumlah DNA sampel yang digunakan.

2.8. Faktor-Faktor yang Menentukan Keberhasilan PCR




24/29

141

Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu :

konsentrasi deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), konsentrasi enzim, konsentrasi

Mg2+,

oligonukleotida primer, larutan bufer, serta jumlah siklus PCR (Erlich

1992).

2.8.1. Konsentrasi deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)

Larutan stok dNTP yang akan digunakan dalam PCR sebaiknya

dinetralkan menjadi pH 7. Larutan stok tersebut kemudian perlu dituang dalam

volume kecil (aliquot) dengan konsentrasi 1 mM dan disimpan pada suhu -20 oC.

Konsentrasi masing-masing dNTP yang diperlukan dalam PCR berkisar antara

20-200 M. Keempat dNTP sebaiknya digunakan dalam konsentrasi yang sama

untuk memperkecil kemungkinan kesalahan penggabungan nukleotida selama

proses polimerisasi. Sebagai patokan, konsentrasi masing-masing dNTP sebesar

20 mM dalam 100 l secara teoritis cukup untuk mensintesis 2,6 g atau 10 pmol

DNA yang panjangnya 400 bp.

2.8.2. Konsentrasi enzim

Konsentrasi Taq DNA polimerase yang disarankan untuk melakukan

PCR berkisar antara 1-2 unit per 100 l campuran reaksi, jika parameter lain

dalam keadaan optimum. Untuk reaksi yang berbeda, enzim yang diperlukan

mungkin berbeda. Oleh karena itu sebaiknya dilakukan optimasi dengan variasi

konsentrasi enzim 0,5-5 unit per 100 l reaksi, kemudian dianalisis dengan

elektroforesis pada gel agarosa. Jika konsentrasi enzim terlalu tinggi maka akan




25/29

142

diperoleh produk non spesifik yang terlalu besar, sedangkan jika konsentrasi

enzim terlalu rendah maka akan dihasilkan produk dalam jumlah yang sedikit.

2.8.3. Konsentrasi Mg2+

Aktivitas Taq DNA polimerase dipengaruhi oleh konsentrasi ion

magnesium. Aktivitas TaqDNA polimerase mencapai maksimal pada konsentrasi

MgCl2 sebesar 2,0 mM jika konsentrasi dNTP yang digunakan adalah

0,7-0,8 mM. Konsentrasi Mg2+ yang lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat

aktivitas Taq DNA polimerase.

2.8.4. Oligonukleotida primer

Konsentrasi primer yang optimal berkisar antara 0,1-0,5 M,

meskipun konsentrasi primer sampai 1,0 M masih dapat menghasilkan produk

yang sangat spesifik. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0 M dapat

menyebabkan terakumulasinya produk PCR yang non spesifik. Panjang

oligonukleotida yang digunakan sebagai primerumumnya 18-28 nukleotida dan

mempunyai kandungan G + C sebesar 50-60%. Sekuen oligonukleotida primer

dirancang sedemikian rupa sehingga antara primer yang satu dengan primer

lainnya tidak memiliki kemungkinan membentuk hibrid. Selain itu, jika

memungkinkan sebaiknya dihindari penggunaanprimeryang memiliki nukleotida

C atau G secara berurutan tiga atau lebih pada ujung 3. Primeryang digunakan

sebaiknya memiliki nilai Tm yang serupa.

Suhu dan waktu yang diperlukan untuk annealingprimer tergantung

pada konsentrasi, komposisi basa, dan panjang primer. Suhu annealing yang




26/29

143

digunakan adalah 5 oC lebih rendah dari true Tm primer. Secara umum, suhu

annealing berkisar antara 55-72 oC. Semakin tinggi suhu annealing, maka

semakin memperkecil kesalahan yang terjadi pada nukleotida ujung 3primer.

Oleh karena itu, suhu annealing yang semakin kuat akan meningkatkan

spesifisitas.

Suhu ekstensi yang rendah dan kadar dNTP yang tinggi menyebabkan

kesalahan penggabungan nukleotida. Oleh karena itu, beberapa peneliti

melakukan PCR dengan menggunakan primer yang lebih panjang, dan

menggunakan hanya dua macam suhu, yaitu 55-75 oC untuk annealing dan

ekstensi, serta 94-97 oC untuk denaturasi untai ganda DNA.

2.8.5. Waktu dan suhu denaturasi

Salah satu penyebab kegagalan PCR adalah denaturasi DNA cetakan

dan produk PCR yang berlangsung tidak sempurna. Kondisi denaturasi yang

digunakan pada umumnya adalah 95 oC selama 30 detik, atau 97 oC selama 15

detik. Suhu yang lebih tinggi digunakan untuk denaturasi DNA yang mengandung

G + C dalam jumlah besar.

2.8.6. Larutan bufer

Bufer yang disarankan untuk melakukan PCR adalah 10-50 mM

Tris HCl, pH 8,3-8,8 pada suhu 20 oC.Untuk memudahkan annealing primer,

dapat juga ditambahkan KCl sampai konsentrasi 50 mM. Di atas konsentrasi ini,

KCl justru akan menghambat aktivitas TaqDNA polimerase.




27/29

144

Komponen lain yang perlu ditambahkan adalah gelatin atau BSA

(bovine serum albumin) sebanyak 0,1% (berat/volume) dan deterjen non-ionik

seperti Tween 20 sebanyak 0,05-0,1% untuk mempertahankan kestabilan Taq

DNA polimerase.

2.8.7. Siklus reaksi

Pada umumnya PCR dilakukan dengan mengulang siklus reaksi

sebanyak 20-30 siklus. Tetapi, banyaknya siklus yang diperlukan tergantung

terutama pada konsentrasi awal molekul DNA target yang akan diamplifikasi.

Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan konsentrasi produk yang

tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas

produk yang diharapkan.

2.9. Mikroorganisme Termofilik

Suhu/temperatur merupakan salah satu faktor yang sangat berperan

dalam kehidupan organisme. Berdasarkan suhu pada lingkungan kehidupannya,

mikroorganisme diklasifikasikan menjadi mikroorganisme psikhrofilik, mesofilik,

termofilik, dan hipertermofilik. Mikroorganisme psikhrofilik tumbuh pada suhu

5-25

o

C, sedangkan mikroorganisme mesofilik, termofilik dan hipertermofilik,

masing-masing tumbuh pada suhu 25-45 oC, 45-80 oC, dan 80-110 oC (Vieille

and Zeikus, 2001).

Mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik sebagian merupakan

domain bacteria dan archea, tetapi sebagian besar mikroorganisme

hipertermofilik adalah archea. Hanya Thermotogales dan Aquificales yang




28/29

145

merupakan bakteri hipertermofilik. Sebagian besar bakteri termofilik yang telah

ditemukan para ahli merupakan genusBacillusyang dapat membentuk spora.

Mikroorganisme termofilik dan hipertermofilik dapat diisolasi dari

lingkungan yang bersuhu sangat tinggi seperti kawah gunung berapi, sumber air

panas, daerah geotermal bumi, dan juga dari lingkungan industri yang bersuhu

sangat tinggi (misalnya : aliran geothermal power plant atau sewage sludge

systems).

Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme termofilik dan

hipertermofilik disebut sebagai enzim termofilik dan enzim hipertermofilik.

Enzim-enzim termofilik dan hipertermofilik dapat pula disebut sebagai termozim

atau ekstrimozim. Ekstrimozim dapat berfungsi di lingkungan dengan kadar

garam tinggi (halozim), pada kondisi alkalin (alkalozim), serta pada kondisi-

kondisi ekstrim lainnya (tekanan, keasaman, dll). Enzim-enzim termofilik dan

hipertermofilik aktif serta stabil pada suhu yang tinggi. Sebagian besar enzim

termofilik dan enzim hipertermofilik yang telah dikarakterisasi, secara optimal

aktif pada suhu yang hampir sama dengan suhu pertumbuhan mikroorganisme

penghasil enzim tersebut, biasanya berkisar 50-80 oC (enzim termofilik) dan 80-

115 oC (enzim hipertermofilik) (Empadinhas and da Costa, 2006). Enzim-enzim

termofilik dan hipertermofilik ekstraseluler (misalnya sakaridase dan protease)

seringkali aktif pada suhu yang jauh lebih tinggi dari suhu pertumbuhan

mikroorganisme penghasil enzimnya, dan enzim-enzim ini memiliki stabilitas

termal yang sangat baik. Contohnya : amilopulunase dari Thermus litoralisaktif

pada suhu 117 oC, sedangkan suhu optimum pertumbuhan mikrobanya hanya




29/29

146

88 oC. Demikian pula fitase dari B. laevolacticus yang aktif pada suhu 70 oC,

sedangkan mikrobanya tumbuh pada suhu 50 oC (Gulati et al., 2007).

Enzim-enzim termofilik dan hipertermofilik intraseluler memiliki

aktivitas optimum pada suhu yang hampir sama dengan suhu optimum

pertumbuhan mikroorganisme penghasil enzim tersebut. Hanya sebagian kecil

enzim yang aktivitas optimumnya terjadi pada suhu di mana 10-20 oC lebih

rendah dari suhu optimum pertumbuhan mikrobanya. Sementara enzim-enzim

termofilik dan hipertermofilik ekstraseluler secara intrinsik sangat stabil, stabilitas

termal tinggi yang dimiliki beberapa enzim termofilik dan hipertermofilik

intraseluler lebih disebabkan faktor-faktor intraseluler seperti garam, konsentrasi

protein yang tinggi, koenzim, substrat, aktivator, atau stabilisator seperti

thermamine (Vieille and Zeikus, 2001).

Memiliki stabilitas termal yang baik dan aktif pada suhu tinggi,

enzim-enzim termofilik dan hipertermofilik menawarkan berbagai keuntungan

untuk aplikasi, terutama di bidang bioteknologi. Enzim termofilik dan

hipertermofilik sangat mudah dimurnikan dengan perlakuan panas (menggunakan

suhu tinggi) jika diekspresikan pada sel inang mesofilik. Enzim-enzim ini juga

memiliki resistensi yang tinggi terhadap zat-zat kimia yang berfungsi sebagai

denaturan (misalnya guanidinium hidroklorida), dan reaksi enzimatik yang

dilaksanakan pada suhu tinggi menyebabkan resiko terkontaminasi dengan

mikroorganisme lain lebih kecil, serta reaksi dapat berlangsung dengan kecepatan

yang lebih tinggi.


gdlhub-gdl-s3-2013-kusumadjaj-26598-14.-bab--a

Documents