DEMONTRASI PIGMENT DAN PENCELUPANNYA

SUBJEK : PATOLOGI ANATOMI III

NO.KOD : MLAA 3112

KOLEJ SAINS KESIHATAN BERSEKUTU

KUCHING SARAWAK. (JTMP)

BATU 13 ½ , JALAN PUNCAK BORNEO

93250 KUCHING

NAMA PELATIH : YOGARANI A/P M.VADIVULU

NO. MATRIKS : BJTMP 2007- 4663

15.10.2009 HINGGA 15.11.2009

PRESPTOR TEMPATAN : EN.PATRICK NGU

TANDATANGAN(TT) :

ISI KANDUGAN

BIL. KANDUNGAN MUKA SURAT

1. Penghargaan 2

2. Pegenalan 3

3. EndogenousHemosiderin

4

5. Prosedur pencelupan Perl’s Prussion Blue 5

6. Hematoidin (bila pigment) 6

7. Prosedur pencelupan Fouchet 7

8. Melanin 8

9. Prosedur pencelupan Masson-Fontana 9

10. Penutup 10

11. Rujukan 11

12. Lampiran 12-14

PEGENALAN

Sebarang agen yang hadir dalam mendakan (deposited) sebagai ‘cytoplasmic

inclusions’ atau granul dalam sel dan tisu dikenali sebagai pigmen. Oloeh kerana

terdapat banyak jenis pigmen ia memerlukan teknik pencelupan khas bagi

mengenalpasti atau membezakan jenis pigmen tersebut.

Pigmen dikelaskan kepada tiga kumpulan besar iaitu

Pigment artifak .

Pigment exogenous.

Pigment endogenous.

Kewujudan artifak dan pigmen sering dikaitkan berlaku dalam penyediaan

tisu. Ini menjadi satu permasalahan semasa pemerosesan tisu. Sekiranya terdapat

seksyen tisu yang kehadiran artifak atau pigemn ianya perlu disisihkan daripaga

seksyen. Ini adalah kerana memudahkan pencelupan keatas sel-sel yang

terselindung olehnya. Pencelupan keatas pigmen dilakukan supaya kehadiran serta

jenis pigmen dikenalpastikan.

3

ENDOGENOUS

Pigmen yang berasal daripada darah atau hemoglobin. Ianya juga dipanggil

pigmen hematogenous. Oleh itu, ia terus disatukan dengan pigmen-pigmen

normal yang terdapat pada kulit, otot, dan lain-lain bahagian badan. Antaranya

ialah:

Hemosiderin:

Hemosiderin merupakan free iron, boleh didapati dalam kuantiti yang sedikit

dalam bone marrow dan limfa. Sekiranya pigment ini terjadi dalam kuantiti yang

tinggi ini adalah disebabkan keadaan berpenyakit seperti Hemorrhage, scelorosing

hemangioma, hemochromatosis dan sebagainya. Biasanya berbentuk granular atau

globular halus dan berwarna kuning perang dalam keadaan asal.

Pencelupan

Pigment hemosiderin menggunakan teknik pencelupan Perl’s Prussian

Bluereaction for ferric salts. Pencelupan ini berdasarkan kepada pembentukkan

mendapan oleh Prussian Blue yang tidak larut dan apabila disatukan dengan

Potassium ferrocyanide:

4Fe Cl3 + 3K4Fe (CN)6 Fe4 [Fe(CN)6]3 + 12K Cl

. Tujuan pencelupan ni adalah untuk mengenalpasti pigment hemosiderin

iaitu besi bebas ataupun Ferum III.

Prinsip pencelupan ini melibatkan Besi ferum (III) yang dibebaskan oleh asid

dari protein iaitu Ferritin bergabung dengan Kalsium Ferosianide(potassium

Ferrocyanide) dalam larutam berasid dan membentuk Ferum (III) Ferosianide. Ia

merupakan suatu kompoun mendapan biru yang tidak larut. Warna biru ini dikenali

sebagai Prussian Blue.

Keputusan : Ferric ion-mengadungi pigment --- biru

Nuclei --- merah

4

Haematoidin (Bile Pigment):

Bile pigment juga dikenali sebagai bilirubin atau biliverdin. Pigment ini tedapat

di sel atau diantara sel. Bilirubin atau biliverdin dikaitkan didalam penyakit

hempedu. Hematoidin juga berkaitan dengan pendarahan lama. Ini menunjukkan

seksyen beku lebih baik digunakan berbanding seksyen paraffin. Haematoidin ini

hadir dalam bentuk granul berwarna kekuningan. Pigment ini boleh didapati dalam

otak dan limfa.

Pencelupan

Menggunakan teknik pencelupan Fouchet reaction dimana paraffin atau

frozen seksyen dicampurkan terus dengan reagen pencelupan fouchet. Tujuan

pencelupan ini adalah untuk mencelup bile pigmen dalam tisu

Pencelupanini menyebabkan bile pigmen akan dioksidakan dengan oleh Feric

chloride dengan kehadiran Trikloroasitik dan membentuk satu campuran bilirubin

hijau dan Cholecyanin biru.

.

Keputusan:

Bile pigment ........................ berwarna hijau

6

MELANIN

Melanin biasanya hadir dalm bentuk granul yang berwarna kuning

keperangan atau berwarna hitam di kulit, rambut, mata dan ,substania nigra. Melanin

juga merupakan satu pigment perlindungan ku;it yang baik terhadap pancaran

matahari. Pigment melanin ini memberi kesan patologikal kepada penyakit

kulit(tumor kulit), benign naevi dan malignat melanomas serta metastatisnya.

Melanin terhasil daripada enzim tyrosine dimana enzim ini akan menghasilkan

dihydroxyphenalylaline untuk membentuk pigment melanin. Melanin dikenalpasti

dengan mengguna pencelupan Masson-Fontana. Melanin juga boleh dihilangkan

dengan proses pelunturan(mewarnakan sel-sel atau komponen tisu yang

terselindung disebaliknya). Melanin juga dihitamkan dengan asid nitrat silver pada

pH 4 dimana masa pewarnaannya kurang daripada 1 jam.

Pencelupan

Tujuan pencelupan ini adalah untuk mencelup pigment melanin dan

argentaffin.

Pencelupan Masson-Fontana mempunyai keupayaan untuk melanin

menurunkan larutan beramonia silver nitrat kepada metallic siver.

Keputusan

Melanin................ hitam.

Nuclei................... merah.

8

PENUTUP

Kewujudan artifak dan pigmen pada seksyen tisu merupakan perkara yang

bakal ditemui dalam pemprosesan tisu. ianya menjadi satu inisiatif dalam

pendiagnosan penyakit. Pigmen endogenous antaranya adalah Hemosiderin,

Haemazoin (Malaria ),Haematoidin (Bile Pigment), Hemoglobin, Melanin,

Lipofuscin. Manakala pigmen exogenous, mineral dan inorganic adalah

Karbon, Silica, Asbestos, silver, tattoo, iron-ore, lead and copper, Bismuth,

Calcium, Alluminium dan beryllium, Barium, dan Urates. Manakala artifak deposit

adalah Acid formaldehyde hematin Mercuric chloride Chromic Oxide Deposit

pencelupan Paraffin wax Air Melanosis coli.

Setiap kewujudan pigmen tersebut mempunyai cara untuk menyingkirkannya

bagi melihat keadaan seksyen betul. Malahan, terdapat cara untuk mengenalpasti

pigment seperti Solubility studies, reaksi pencelupan dan histokimia, Polarizing

microscopy, Micro- incineration, Electron mikroskop mikroprobe analisis.

10

PROSEDUR PENCELUPAN PERL’S PRUSSIAN BLUE

Bahan- bahan pencelupan

Hirisan tisu control positi tisu haemosiderin-laden

2% Potassium Ferocyanide

2% Asid Hidroklorik(analar)

1% Neutral Red Depex

Seksyen tisu

Slaid

Air suling

Cara kerja

1. Seksyen tisu diletakkan di dalam air suling

2. Campurkan larutan 2% Potassium Ferocyanide dan 2% Asid Hidroklorik

3. Celupkan seksyen tisu dalam campuran tadi

4. Biarkan selama 20-30 minit

5. Kemudian, basuhkan dengan air suling

6. Celupbalas dengan Neutral Red selama 3-5 minit

7. Slaid tisu perlu dicelup dengan alkohol untuk proses dehidrasi

8. Elepas itu, celup dengan Xyelene untuk proses pencerahan

9. Mountkan slaid tisu dengan depex

Kewaspadaan:

Kewaspadaannya ialah,tisu yang mempunyai besi hendak di lekat dalam

bekas bukan metallic danair suling yang digunakan mestilah bebas besi untuk

mengelakkan pencemaran.Pengawet yang berasid akan menanggalkan besi atau

membantutkan reaksi besi tersebut.

5

PROSEDUR PENCELUPAN FOUCHET

Bahan-bahan

25% tricloroasetic acid

10% ferric chloride-25ml

Cara kerja:

1. Seksyen diwaxkan dulu.

2. Basuh seksyen dengan alcohol diikuti dengan air dan air suling

3. Kemudian celup dengan pencelupan Fouchet’s selama 5 minit

4. Basuh dengan air suling

5. Kemudian celupbalas dengan pencelupan Van Gieson’s selama 2 minit

6. Basuh dengan air suling dan keringkannya

7. Basuh cepat dengan alcohol

8. Celup dalam xyelene

9. Maountkan slaid.

KEWASPADAAN

Kewaspadaannya ialah Fouchet reagen perlu digunakan serta-merta selepas

disediakan.

7

PROSEDUR PENCELUPAN MANSON-FONTANA

PENYEDIAAN LARUTAN SILVER

Campurkan larutan ammonia titik demi titik 20ml 10% Silver Nitrat sehingga

pembetukkan persiptasi larut. Kemudian tambahkan 20ml air suling, tapis dan

simpan dalam botol gelap.

PROSEDUR PENCELUPAN

1. Dewax seksyen tisu dan menjalankan proses dehidrasi dalam air suling

2. Kemudian,celup dalam larutan Silver selama 5minit pada 56°C untuk

mendemontrasikan melanin ataupun pada suhu bilik semalaman untuk

mendemostrasikan Argentaffin.

3. Basuh dalam beberapa tukaran air suling.

4. Celup dengan 5% Sodium Thiosulphate selama 2 minit.

5. Kemudian, basuh dalam air paip mengalir.

6. Celupbalas dengan 1% Neutral Red Aqueous selama 3 minit.

7. Basuh dengan air paip mengalir dan mountkannya.

KEWASPADAAN

Elakkan larutan Silver daripada pendedahan pada cahaya. Simpan larutan ini

pada 4 °C.

9

PENGHARGAAN

Salam sejahterah diucapkan kepada semua pengajar-pengajar. Terlebih

dahulu jutaan terima kasih diucapkan kepada En. Patrick Ngu kerana tunjukajar

beliau untuk menyiapkan kerja kursus yang bertajuk Demontrasi Pigment Dan

Pencelupannya.

Ribuan terima kasih juga diucapkan kepada En.Maxion Bantut untuk

kerjasama beliau serta tunjukajar untuk menyiapkan tugasan ini. Tidak ketinggalan

juga semua tenaga pengajar yang memberi tunjukajar mereka dalam menjayakan

tugasan ini.

Sekali lagi.jutaan terima kasih diucapkan kepada semua yang terlibat secara

langsung dan tidak langsung untuk menyiapkan kerja kursus ini.

Sekian terima kasih

2

LAMPIRAN

PENCELUPAN MASSON-FONTANA

Pemendapan extensive intra-alveolar diikuti pulmonary hemorrhage,pencelupan Prussian Blue,veno-occlosive disease

Tubular Renal mengandungi kandungan hemosidrin yang banyak dalam kes pesakit Chronik Hematuria

12

LAMPIRAN

Hemasidrosis dalam kes “Cell Injury” didemonstrasikan dengan pencelupan Prussian Blue.

Bile pigment dalam pencelupan Fouchet

13

LAMPIRAN

Focal incontinen melanin dengan limfosit dan eosinofil. Dendrit melanosit dalam superficial lamina popria dengan pencelupan Masson-Fontana (ditunjukkan dalam anak panah).

Masson-Fontana untuk melanin,Argentaffin,Chromaffin dan Lipofusin dicelup hitan dan nuklei merah.

14

RUJUKAN

1. C.F.A Culling,R.T Allison and W.T Barr,Cellular Pathology Technique.4th Ed (1985)

2. Thomas s.Leeson & C.Roland Leeson,Histopathology. 2nd Ed(1970) W.B Saunders Company Philadelphia,London.

3. R.A Thomas Bielref and Alexander mof Imunohistology Laboratory4. HC Cook, Manual of Histogical Demonstration Techqunies.(1974) Butterworts

& Co Publisher Ltd, The Great Britain5. http://nationaldiagnostic.com/article info.php/articles id/104 6. http://www.bristol.ac.uk/vetpath/cpl/pigment.html

11