TEKNIK ASEPTIK

• Kultur jaringan meliputi penanaman sel atau agrerat sel, jaringan, dan organ tanaman pada medium

• Komposisi medium tumbuh ternyata sangat menguntungkan bagi pertumbuhan mikroorganisme

• Mikroorganisme dapat menyerang eksplan sehingga mengakibatkan kematian eksplan

Sumber kontaminan• Medium; sebagai akibat proses sterilisasi yang

tidak sempurna• Lingkungan kerja dan pelaksanaan penanaman

yang kurang hati-hati dan kurang teliti• Eksplan1. internal (kontaminan terbawa di dalam jaringan) 2.Eksternal (kontaminan berada di permukaan

eksplan)• Serangga atau hewan kecil

Prosedur aseptik

• Sterilisasi lingkungan kerja• Sterilisasi alat-alat dan media• Sterilisasi bahan tanaman

Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan Umum1.Membatasi personil2.Membersihkan ruangan (desinfektan)3.Memakai alas kaki dan jas lab khusus untuk di

dalam ruangan4.Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti

isolasi protoplasma, dilakukan di dalam transfer box

Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan spesifik (transfer box;LAFC)1.Sebelum mulai bekerja permukaan dilap

dengan alkohol 70%, lampu UV dinyalakan ½ - 1 jam

2.Setelah kerja, prosesnya sama

Sterilisasi alat-alat dan media

• Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril : pembakaran (pinset, gunting, scalpel), otoklaf (media, aquadest, alat-alat, kertas saring), oven (botol-botol, tabung reaksi, erlenmeyer,dll).

Sterilisasi bahan tanaman

• Harus bebas kontaminan, selain debu dan kotoran; ada kontaminan hidup (cendawan, bakteri, serangga, spora); kontaminan internal yang berasal dari jaringan tanaman (bakteri) sangat sulit diatasi harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida

Tingkat kontaminasi permukaan pada tanaman tergantung pada :• Jenis tanaman• Bagian tanaman yang digunakan• Morfologi permukaan (berbulu;berduri)• Lingkungan tumbuhnya• Waktu pengambilan• Umur tanaman• Kondisi tanaman

• Pada prinsipnya, sukar untuk menentukan suatu metode baku yang berlaku untuk semua jenis tanaman dan semua bagian tanaman.

• Secara garis besar ada ketentuan umum, namun secara spesifik metode sterilisasi yang paling tepat akan diperoleh dari trial and error;percobaan pendahuluan

• Proses sterilisasi bahan tanaman harus dilakukan dalam beberapa tahap

Bahan sterilisasiBahan konsentrasi waktuCa.hipoklorit 1-10 % 5-30’Na.hipoklorit 1-2 % 7-15’Hydrogen peroksidaGas klorin

10-12 %-

5-15’60-240’

Perak nitrat 1 % 5-30’Merkuri klorida 0,1-0,2 % 10-20’Betadine 2,5-10 % 5-10’Fungisida 2 g/l 20-30’Antibiotik 50 mg/l 30-60’alkohol 70 % ½-1’

Prosedur sterilisasi bahan dapat dimodifikasi sebagai berikut:1.fungisida / ab – merkuri klorida – aquadest

steril2. alkohol - sodium hipoklorit – merkuri klorida –

aquadest steril3. alkohol – sodium klorida – betadin – aquadest

steril

Untuk menghindari pemborosan media perlakuan maka :• Eksplan tidak langsung ditanam didalam

media perlakuan, tetapi pada media preconditioning ( media dasar tanpa hormon) u/ menguji efektifitas sterilisasi

• Selama 3-7 hari pada media preconditioning dan tidak menunjukkan adanya gejala kontaminasi, eksplan siap ke media perlakuan yang sesungguhnya

• Eksplan yang terkontaminasi dibuang

Cara sterilisasi organ/ eksplan dgn bahan kimia:1. Ambil organ yang akan dijadikan eksplan, cuci

sampai bersih dgn air (2-3x) letakkan dalam petridish atau erlenmeyer

2. Timbang zat kimia untuk sterilisasi larutkan dalam aquadest sesuai dengan kebutuhan

3. Selanjutnya kedua bahan tersebut dimasukkan ke dalam laminar air flow yang sudah dibasahi dengan alkohol atau spiritus

4. Masukkan potongan organ / eksplan yang akan disterilsasi ke petri / erlenmenyer ;digoyang secara perlahan agar eksplan terbasahi secara sempurna

5. Apabila eksplan masih mengandung daun pembungkus, sisik, bulu, duri, ataupun bahan lain maka harus dibersihkan sampai yang muda yang berwarna tampak keputihan

6. Cuci eksplan dengan aquadest steril 2-3 kali kemudian dipotong kecil2 dengan ukuran 1-5 mm eksplan siap ditabur

Penanaman eksplan

• Eksplan diambil dengan pinset, diletakkan dalam petridish, kemudian dipotong-potong dengan skalpel

• Potongan eksplan dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi media hingga permukaan yang teriris dapat bersentuhan dengan media

• Erlenmeyer ditutup kembali dan disimpan dalam ruang inkubator dengan suhu dan intensitas cahaya yang sesuai

KULTUR SUSPENSI SEL

Inisiasi kultur suspensi sel

• Bahan awal adalah kalus yang meremah (friable)

• Media yang digunakan adalah media cair (tanpa agar)

• Wadah berupa labu erlenmeyer• Labu erlenmeyer yang digunakan hanya diisi

media seperlima kapasitas• Zat pengatur tumbuh ditambahkan sebanyak

sepersepuluh kadar dalam media padat

Kondisi kultur suspensi sel• Digojog berputar pada penggojog berpusing

(gyrotory shaker), disebut aerasi• Kecepatan berpusing 80-100 rpm, dengan

simpangan ± 3 cm• Suhu ruang inkubasi (25±3)°C• Pencahayaan dengan lampu TL-day light 40 w

atau gelap• Subkultur dilakukan setiap sekitar 7 hari, setelah

diketahui kurva pertumbuhannya• Pengukuran tinggi enapan dengan alat tertentu

Subkultur suspensi sel

• Suspensi sel dienapkan, bila tidak terjadi kontaminasi cairan di atas enapan jernih

• Secara aseptis media lama dituang, kemudian diganti dengan media segar sebanyak 2 kali volume media yang dituang, dipindah dalam wadah dengan kapasitas 2xlipat

• Wadah media ditutup kembali dan diinkubasi pada penggojok berpusing

• Subkultur diulang sampai diperoleh biomassa yang dikehendaki

Pembuatan kurva pertumbuhan

• Diukur tinggi enapan pada saat inisiasi kultur suspensi sel

• Diukur tinggi enapan setelah setiap 3-5 hari• Disarankan agar kultur suspensi sel sudah

dalam wadah dengan kapasitas 250-300 mm• Pengukuran endapan dengan alat, dihitung

sampai mm saja• Buat poligon antara waktu vs tinggi enapan