plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · menthol. fraksinasi dan ... proses...

OPTIMASI SUHU DAN LAMA PENDINGINAN DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA DARI

DAUN TANAMAN Stevia rebaudiana Bertonii DENGAN FACTORIAL DESIGN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Mencapai Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Fransisca Romana Dyah Kuswantari

NIM : 058114043

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2009

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

OPTIMASI SUHU DAN LAMA PENDINGINAN DALAM PROSES KRISTALISASI STEVIOSIDA DARI

DAUN TANAMANStevia rebaudiana Bertonii DENGAN FACTORIAL DESIGN

SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Mencapai Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh : Fransisca Romana Dyah Kuswantari

NIM : 058114043

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2009

i


ii


iii


“APAPUN yang kita lakukan dan yakini... selama hal itu BENAR

dan selama kita BERUSAHA DENGAN CARA YANG BENAR....

disertai dengan DOA... segalanya akan menjadi mungkin

dan suatu saat akan terjadi KEAJAIBAN

yang akan membuktikan keyakinan kita.....”

Karya ini saya persembahkan untuk:

Keluarga kecil dan Keluarga besarku yang tercinta....

Teman-temanku yang kusayangi.... dan Almamaterku......

iv


v


PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul

“Optimasi Suhu dan Lama Pendinginan dalam Proses Kristalisasi Steviosida

dari Daun Tanaman Stevia Rebaudiana Bertonii dengan Factorial Design”

ini. Skripsi ini merupakan penelitian yang dibiayai oleh Hibah A3.

Penelitian ini dapat terlaksana dengan baik karena adanya dukungan dari

berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada pihak-

pihak yang bersangkutan, antara lain:

1. Ibu Rita Suhardi M.Si., Apt., selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta

2. Ibu Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. dan Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si,

selaku dosen pendamping dan dosen penguji yang telah memberikan

kesempatan, bimbingan, dan dukungannya.

3. Ibu Christine Pramurti, S.Si, Apt. dan yang telah memberikan kemudahan

sarana dan prasarana kepada kami.

4. Ibu Agatha Budi Susiana Lestari, M.Si., Apt dan Bapak Jeffry Julianus,

M.Si, atas ketersediaannya sebagai dosen penguji.

5. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro,

M.Si, Romo Drs. Petrus Sunu Hardiyanta, S.J, S.Si., Drs. Antonius Tri

Priantoro, M.For. Sc, yang telah memberi pencerahan dalam pelaksanaan

penelitian ini.

vi


6. Para Dosen, Laboran, serta Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang secara langsung maupun tak langsung membantu

terlaksananya penelitian ini.

7. Keluargaku tercinta, Bapak, Ibu, Mbak Sari atas pengorbanan, cinta, doa

dan dukungannya.

8. Sahabatku : Nia Detta, Aya, Paulina. Terima kasih atas persahabatan yang

indah dan penghiburannya.

9. Teman-teman “Payung Stevia”: Virginia, Febrian, Totok, Feri, Diana,

Retha, Natalia, Tyas. Terima kasih atas kerjasama, dan kebersamaannya.

10. Seluruh teman-teman Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta.

Terima kasih atas perhatian dan dukungannya dalam upaya keberhasilan

penelitian ini.

11. Seluruh pihak yang ikut serta dan membantu pelaksanaan penelitian ini

yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis juga memahami masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini,

sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran guna kesempurnaan penelitian ini

ini. Akhir kata, semoga laporan ini bermanfaat bagi seluruh pihak yang

menggunakannya.

Yogyakarta, Januari 2009

Penulis

vii


viii


INTISARI

Tumbuhan stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) mengandung steviosida yang berpotensi sebagai pemanis alternatif nonnutritif. Penelitian ini tentang optimasi suhu dan lama pendinginan dalam proses kristalisasi steviosida dari stevia dengan factorial design. Tujuan dari penelitian untuk mengetahui faktor yang dominan serta berat kristal dan kandungan steviosida dalam kristal yang optimum dari kombinasi suhu dan lama pendinginan dalam kristalisasi steviosida.

Penelitian eksperimental ini dengan metode factorial design dua faktor, yaitu suhu pendinginan dan lama pendinginan, dengan dua level yaitu level tinggi dan level rendah. Tiap level kemudian ditetapkan berat kristal dan kandungan steviosida dalam kristal. Contour plot superimposed persamaan factorial design, digunakan untuk memilih kombinasi yang optimal antara suhu dan lama pendinginan.

Penelitian ini menghasilkan persamaan factorial design kandungan steviosida adalah Y = 74,61322 + 0,972842X + 0,462996X – 0,09092X X2 1 2 1dan dari perhitungan Yate’s treatment dihasilkan suhu merupakan faktor dominan dan terdapat interaksi. Persamaan factorial design berat kristal adalah Y = 0,2845812+0,0490953X + 0,0539127X – 0,00336558X X1 2 1 2 dan dari perhitungan Yate’s treatment dihasilkan bahwa tidak ada faktor yang mempengaruhi berat kristal. Kombinasi antara suhu dan lama penyimpanan dapat menghasilkan kristal dengan berat kristal melebihi 1,2%b/b terhadap serbuk stevia, dengan kandungan steviosida dalam kristal melebihi 80% b/b. Kata kunci : Stevia rebaudiana Bertonii, steviosida, suhu pendinginan, lama pendinginan, kristal, factorial design.

ix


ABSTRACT

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) is plant contain stevioside which potential as nonnutritive alternative sweeteners. This research is about optimization of temperature and cooling time in stevioside’s crystallization from stevia by factorial design. The aim of research are to know primary factor and the optimum respons from temperature and cooling time combination in stevioside’s crystallization.

This experimental research with factorial design two factor, that cooling temperature dan cooling time with two level, high and low level. Each level determine the crystal weight and stevioside content in crystal. Contour plot superimpossed from factorial design comparison used to decide the optimal combination of temperature and cooling time.

The result of this research is factorial design comparison of stevioside content in crystal, Y = 74,61322 + 0,972842X + 0,462996X1 2 – 0,09092X X1 2 and result Yate’s treatment calculations that cooling temperature was primary factor dan interaction can be evaluated. Factorial design comparison of crystal weight is Y = 0,2845812+0,0490953X1 + 0,0539127X – 0,00336558X X2 1 2 and result Yate’s treatment calculations that no primary factor. The optimal combination of temperature and cooling time give crystal weight more than 1,2%w/w of stevia powder, and the stevioside content in crystal more than 80%w/w. Keyword : Stevia rebaudiana Bertonii, stevioside, cooling temperature, cooling time, crystal, factorial design.

x


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING............................................ ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv PRAKATA ...................................................................................................v PERNYATAAN KEASLIAAN KARYA .................................................. viii INTISARI ................................................................................................. ix ABSTRACT ...................................................................................................x DAFTAR ISI ................................................................................................ xi DAFTAR TABEL ...................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................xv BAB I PENGANTAR ....................................................................................1 A. Latar Belakang...........................................................................................1 B. Perumusan Masalah ...................................................................................2 C. Keaslian Penelitian.....................................................................................2 D. Manfaat ...................................................................................................3 E. Tujuan ...................................................................................................3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .............................................................4 A. Stevia ...................................................................................................4 B. Steviosida...................................................................................................5 C. Defatisasi ...................................................................................................7 D. Maserasi ...................................................................................................8 E. Elektrokoagulasi ........................................................................................9 F. Kristalisasi ................................................................................................10 G. Kromatografi Lapis Tipis ........................................................................13 H. ImageJ .................................................................................................15 I. Factorial Design .......................................................................................16 J. Landasan Teori..........................................................................................17 K. Hipotesis .................................................................................................18

xi


BAB III METODE PENELITIAN ...............................................................19 A. Jenis Rancangan Penelitian......................................................................19 B. Variabel dan Definisi Operasional...........................................................19 1. Variabel Penelitian .............................................................................19 2. Definisi Operasional............................................................................20 C. Alat Penelitian..........................................................................................21 D. Bahan Penelitian ......................................................................................21 E. Jalan Penelitian.........................................................................................22 1. Defatisasi simplisia..............................................................................22 2. Ekstraksi ..............................................................................................22 3. Deklorofilasi ........................................................................................22 4. Klarifikasi dan kristalisasi ...................................................................22 5. Penetapan kandungan steviosida .........................................................23 F. Analisis Data ............................................................................................24 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................25 A. Defatisasi Sampel ....................................................................................25 B. Ekstraksi .................................................................................................25 C. Deklorofilasi ............................................................................................26 D. Klarifikasi dan kristalisasi .......................................................................26 E. Penentuan respon dan factorial design ....................................................27 F. Contour plot .............................................................................................37 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................41 DAFTAR PUSTAKA...................................................................................42 LAMPIRAN .................................................................................................45 BIOGRAFI PENULIS..................................................................................64

xii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I Jenis percobaan ................................................................................16 Tabel II. Hasil luas bercak seri baku menggunakan program ImageJ..........29 Tabel III. Kandungan steviosida dalam kristal .............................................30 Tabel IV. Hasil Yate’s treatment kandungan steviosida dalam kristal.........32 Tabel V. Berat kristal....................................................................................34 Tabel VI. Hasil Yate’s treatment berat kristal ..............................................35

xiii


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Tanaman stevia ...........................................................................4 Gambar 2. Kandungan glikosida steviol dalam stevia .................................6 Gambar 3. Contoh dampak impurities........................................................13 Gambar 4. KLT seri baku dan sampel ........................................................28 Gambar 5. Kurva baku steviosida...............................................................29 Gambar 6. Hubungan suhu pendinginan terhadap kadar steviosida dalam

kristal. .......................................................................................31 Gambar 7. Hubungan lama pendinginan terhadap kadar steviosida dalam

kristal. .......................................................................................31 Gambar 8. Hubungan suhu pendinginan terhadap berat kristal..................36 Gambar 9. Hubungan lama pendinginan terhadap berat kristal .................36 Gambar 10. Contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap kandungan steviosida dalam kristal ........................................38 Gambar 11. Contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap berat kristal.......................................................................................39 Gambar 12. Contour plot superimposed kandungan steviosida dan berat kristal.......................................................................................40

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi ...................................................46 Lampiran 2. Hasil tahapan untuk memperoleh kristal steviosida.................48 Lampiran 3. Penentuan luas bercak menggunakan program ImageJ ...........49 Lampiran 4. Penentuan kandungan steviosida dalam kristal........................52 Lampiran 5. Perhitungan factorial design : kandungan steviosida dalam

kristal .......................................................................................55 Lampiran 6. Konversi berat kristal ...............................................................61 Lampiran 7. Perhitungan factorial design : berat kristal ..............................63

xv


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) adalah tumbuhan herba famili

Asteraceae. Tumbuhan stevia ditemukan di Paraguay. Indonesia merupakan

salah satu produsen tanaman selain Brazil, Korea, Meksiko, USA, Tanzania

dan Kanada (Megeji, Kumar, Singh, Kaul, dan Ahuja, 2005). Stevia telah

dimanfatkan sebagai pemanis oleh masyarakat Paraguay, Jepang, Brasil,

secara tradisional dimanfaatkan sebagai terapi diabetes oleh masyarakat

Paraguay (Leung, A.Y dan Foster,S., 1996).

Daun stevia mengandung glikosida steviol meliputi steviosida,

rebaudiosida, dan dulcosida. Total kandungan glikosida bisa mencapai 10%

berat kering daun (Bruneton, J., 1999). Steviosida dan rebaudiosida

merupakan jenis glikosida steviol yang paling banyak (Gardana, Simonetti,

Canzi, Zanchi, dan Pietta, 2003). Glikosida steviol berwujud kristal

berwarna putih atau kekuningan, berbau lemah, dan berpotensi sebagai

pemanis dengan tingkat kemanisan sampai hingga 300 kali berbanding

sukrosa (Wallin H., 2004,).

Steviosida secara organoleptik memiliki aftertaste pahit dan berasa

menthol. Fraksinasi dan isolasi glikosida steviol dari ekstrak stevia ternyata

dapat menurunkan aftertaste steviosida. Penurunan aftertaste ini karena

terdapat komponen glikosida steviol yang lain, terutama rebaudiosida yang

1


2

memiliki karakter rasa manis yang lebih baik sehingga menutupi aftertaste

steviosida. Sampai saat ini steviosida belum dapat dipisahkan dengan

komponen glikosida steviol yang lain, sehingga melalui isolasi glikosida

steviol dari daun stevia dapat menghasilkan kristal dengan karakter rasa

manis lebih baik dan aftertaste yang minimum (Anonim, 1986a).

Proses kristalisasi terjadi pada larutan supersaturated. Kondisi

supersaturated ini mempengaruhi tingkat kelarutan. Kristal mulai terbentuk

ketika terjadi penurunan kelarutan sehingga tingkat kelarutan sangat

mempengaruhi kristalisasi. Tingkat kelarutan suatu senyawa menurun

seiring dengan penurunan suhu dan peningkatan lama pendinginan

(Cartensen, 2001). Oleh karena itu, perlu dilakukan studi mengenai optimasi

suhu dan lama pendinginan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun

stevia.

B. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas dapat dideskripsikan

permasalahan sebagai berikut :

1. Apakah faktor suhu pendinginan atau lama pendinginan yang lebih

dominan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun tanaman stevia?

2. Apakah diperoleh kombinasi antara suhu dan lama pendinginan untuk

memperoleh kristal steviosida yang baik?


3

C. Keaslian Penelitian

Berdasar studi literatur yang dilakukan penulis, tidak ditemukan

penelitian tentang pengaruh suhu dan lama pendinginan dalam proses

kristalisasi steviosida dari daun tanaman Stevia Rebaudina Bertonii dengan

metode factorial design, sehingga penulis melakukan penelitian ini.

D. Manfaat

Berdasarkan latar belakang di atas, manfaat penelitian ini antara lain:

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini dapat bermanfaat sebagai sumber informasi mengenai

kombinasi secara optimal antara suhu dan lama pendinginan dalam

proses kristalisasi steviosida.

2. Manfaat metodologis

Penelitian ini dapat dijadikan acuan untuk penelitian eksperimen proses

kristalisasi sejenis.

E. Tujuan

Berdasarkan latar belakang di atas maka tujuan penelitian ini antara

lain:

1. Untuk mengetahui faktor yang dominan di antara suhu pendingian dan

lama pendinginan dalam proses kristalisasi steviosida dari daun stevia.

2. Untuk mengetahui kombinasi yang optimum antara suhu dan lama

pendinginan untuk memperoleh kristal steviosida yang baik.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Stevia

Gambar 1. Tanaman stevia (Brandle dan Rosa, 1992).

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii) adalah herba dari Famili

Asteraceae. yang dapat tumbuh hingga mencapai 80 cm. Stevia memiliki

sinonim Eupatorium rebaudianun Bertonii atau dikenal dengan nama

sweet herb (Leung, A.Y dan Foster, S., 1996). Stevia ditemukan di

pegunungan Amambay, Paraguay dengan lebih dari 200 varian (Elkins,

R., 1997).

Beberapa faktor yang mempengaruhi pertumbuhan stevia yaitu,

1. Air untuk irigasi, kandungan air yang terlalu banyak dapat

menginduksi kematangan prematur dan menurunkan produksi daun.

2. Suhu, stevia tumbuh dengan baik pada suhu 20 0C hingga 350C.

3. Tanah, stevia tumbuh lebih baik pada tanah yang sedikit asam.

(Rank, A.H., dan Midmore, D.J., 2006).

Stevia sangat berpotensi sebagai pemanis karena tingkat

kemanisannya 300 kali sukrosa, dan aman bagi penderita diabetes, non

kalori, tidak mempengaruhi kadar gula darah, non toksik, menghambat

4


5

pembentukan plak dan caries. Stevia mengandung glikosida, protein,

serat, karbohidrat, fosfor, zat besi, kalsium, kalium, natrium, magnesium,

rutin (flavonoid), zat besi, vitamin C dan vitamin A (Elkins, R., 1997).

Stevia berpotensi sebagai pemanis karena mengandung glikosida.

Kandungan glikosida ini meningkat sesuai dengan usia tanaman dan

berkorelasi dengan ukuran dan tebal daun. Stevia dapat menghasilkan

kandungan glikosida yang tinggi ketika berada di lingkungan tropis.

Kandungan glikosida menurun drastis ketika daun mulai menguning atau

mati (Rank, A.H., dan Midmore, D.J.,2006).

B. Steviosida

Daun stevia mengandung glikosida steviol yang meliputi

steviosida, rebaudiosida, dan dulcosida (Bruneton, J., 1999). Steviosida

dan rebaudiosida merupakan jenis glikosida steviol yang paling banyak,

dengan kadar hingga 3-10% b/b dan 1% b/b terhadap berat daun kering

(Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).

Beberapa uji toksisitas memberikan hasil bahwa steviosida tidak

toksik, tidak berefek pada fertilitas, dan tidak memberikan efek teratogen

(Leung, A.Y dan Foster, S., 1996).


6

Gambar 2. Kandungan glikosida steviol dalam stevia

(Wallin H. , 2004).

Steviosida memiliki tingkat kemanisan hingga 300 kali bila

dibandingkan 0,4% sukrosa, 150 kali bila dibandingkan 4% sukrosa, 100

kali bila dibandingkan 10% sukrosa (Leung, A.Y dan Foster, S., 1996;

Anonim, 1986a).


7

Steviosida memiliki karakter sebagai berikut :

1. Larut dalam aquadest dan etanol (Anonim, 2007), metanol,

isopropilalkohol, piridin. Tetapi steviosida tidak larut dalam aseton,

kloroform, dan eter (Morita, Takasutki, Fujita, Kashihara, Isamura,

Yao, 1978).

02. Titik leleh 248 sampai dengan 250 C

3. Rotasi dalam metanol : [α]D25 -200 (Morita, et.al, 1978).

Berdasar sifat steviosida maka isolasi steviosida dapat dilakukan dengan

ekstraksi menggunakan pelarut aquadest dan alkanol, seperti metanol,

etanol, n-propil alkohol, dan isopropil alkohol (Morita, et al., 1978).

Steviosida stabil terhadap panas dan asam (Leung, A.Y dan

Foster, S., 1996). Steviosida stabil selama 1 jam hingga suhu 1200C, dan

terdekomposisi pada suhu 1400C. Steviosida stabil pada penyimpanan

suhu kamar dapat hingga kurun waktu 4 bulan. Steviosida tidak

terdekomposisi pada lingkungan asam hingga pH 1 (Felicia, Neli, Mihai,

2003).

C. Defatisasi

Ekstraksi menggunakan soxhlet memiliki prinsip sampel

ditempatkan pada chamber pengekstraksi dan pelarut dipanaskan lalu

direfluks. Pada setiap sirkulasi, sejumlah senyawa nonvolatil (lemak)

terlarut dalam pelarut. Pada akhir ekstraksi senyawa nonvolatil ini

terkonsentrasi pada beker. Waktu ekstraksi ini dapat dikurangi dengan


8

peningkatan temperatur. Pertama kali sampel dipanaskan, lemak terlarut

dalam pelarut, dan diikuti dengan pembersihan sampel selama tahap

pembilasan (Blum-Fretz, Baumann, Feife, 2007).

Proses ekstraksi lemak dari sampel menggunakan soxhlet

meliputi :

1. Ekstraksi : sampel ditempatkan pada pelarut yang mendidih, sampel

dan alat dipanaskan.

2. Pembilasan : katup tanki akan terbuka dan tertutup sesuai dengan

level pelarut.

3. Pengeringan : solven pelarut diuapkan dan ditempatkan di refluks,

sehingga pelarut mengembun dan dapat digunakan lagi.

4. Setelah ekstraksi berakhir, beker yang mengandung ekstrak kemudian

dipisahkan dan dipekatkan

Soxletasi ini umum digunakan untuk mengekstraksi lemak dari sampel

(Blunm-Frenz, et al., 2007).

D. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Penyarian

adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dengan pelarut cair.

Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif

yang mudah larut dalam cairan penyari, dan tidak mengandung zat yang

mudah mengembang dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan

dapat berupa air, etanol, air-etanol atau pelarut lain (Anonim, 1986b).


9

Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara

pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah

diusahakan. Kerugian cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan

penyarian yang kurang sempurna (Anonim, 1986b).

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan

mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani

menggunakan plarut yang sesuai. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia

nabati yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet

atau sebagai pelarut dan pengawet (Anonim, 1995).

E. Elektrokoagulasi

Elektrokoagulasi adalah cara untuk mengkoagulasi bahan koloidal

dalam suatu larutan dengan bantuan Al3+ 3+ dan Fe sebagai koagulan,

dengan bantuan induksi elektrokimia pada elektrode (Mechelhoff, Kelsall,

Graham, 2008). Jika larutan mengandung ion logam maka ion logam akan

direduksi menjadi logamnya dan terdapat pada batang katoda. Dari reaksi

tersebut, pada anoda akan dihasilkan gas, buih dan flok Al(OH)3.

Selanjutnya flok yang terbentuk akan mengikat logam yang ada di dalam

larutan, sehingga flok akan memiliki kecenderungan mengendap (Sunardi,

2007). Pada proses elektrokoagulasi terjadi reaksi berikut :

-3+ + 3e1. Anoda (oksidasi) : Al ↔ Al

-2. Katoda (reduksi) : 2 H2O + 2e ↔ 2OH- + H 2

3. Al (s) + 3H (s) + 1,5 H (AR, Rahmani, 2008). ↔ Al(OH)2 3 2


10

F. Kristalisasi

Padatan dapat dibagi menjadi kristal dan amorf (Cartensen,

J.T, 1998). Amorf adalah padatan terbentuk dari molekul yang tidak

memiliki orientasi lokasi dan pergerakan yang random sehingga yang

kurang stabil (energi) dibandingkan kristal (Cartensen, J.T, 2001). Amorf

bersifat anisotropik karena memiliki sifat mekanik, elektrik, magnetik, dan

optik yang bervariasi (Mullin, J.W, 2001). Kristal terbentuk dari molekul

yang tertata sehingga lebih stabil (Cartensen, J.T, 2001). Berbeda dengan

amorf kristal bersifat isotropik karena memiliki sifat yang seragam

(Mullin, J.W, 2001).

Kristal terbentuk karena transformasi fase yaitu:

1. Perubahan fase cair ke padat-kristal terbentuk dari pelelehan atau

larutan.

2. Perubahan dari fase gas ke padat-kristalisasi terjadi melalui sublimasi

3. Perubahan dari fase padat ke fase padat lain, disertai dengan perubahan

bentuk kristal. Fenomena ini disebut rekristalisasi (Flint, Y., 1986).

Pada pembentukan terjadi transformasi senyawa dari fase cair ke

fase padat. Pada umumnya fase cair bersifat isotropik, tetapi pada

transformasi fase cair ke kristal terdapat fase antara yang disebut fase

mesomorf, yaitu fase di mana larutan bersiat anisotropik yang disebut kristal

cair (Mullin, J.W, 2001).

Proses pembentukan kristal terjadi ketika larutan dalam kondisi

supersaturated dan supercooling (Mullin, J.W, 2001). Kondisi


11

supersaturated dapat tercapai dengan penguapan pelarut dan penurunan

suhu, sehingga menurunkan kelarutan suatu senyawa (Flint, Y., 1986).

Hubungan antara suhu dan kelarutan dinyatakan melalui persamaan van’t

Hoff : ⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡−

Δ=

TTfRH

x f 11)ln( (1)

keterangan x : fraksi mol zat terlarut dalam pelarut

T : suhu larutan (K)

Tf : suhu fusi atau titik lebur solute (K)

∆H : entalpi fusi dari solute (J/mol) f

R : konstanta gas (8,314 J/mol.K) (Mullin, J.W, 2001).

Proses kristalisasi juga dipengaruhi oleh lama pendinginan

sehingga terdapat waktu optimum dalam proses kristalisasi senyawa

tertentu. Proses pendinginan untuk memperoleh kristal dimulai pada saat

suhu konstan dan berakhir dalam waktu tertentu. Dengan demikian dapat

diketahui bahwa suhu dan lama pendinginan berpengaruh proses

kristalisasi (Flint, Y., 1986).

Sebelum kristal terbentuk, dalam larutan harus terdapat sejumlah

badan padat atau nukleus yang menjadi pusat pengristalan. Nukleasi dapat

terbentuk secara spontan maupun diinduksi. Nukleasi dapat diinduksi

dengan pengadukan, shok mekanik, friksi, maupun tekanan ekstrim.


12

Sampai saat ini nukleasi dapat dibedakan menjadi:

1. Primer

a. Homogen (spontan)

b. Heterogen (diinduksi dengan partikel asing)

2. Sekunder (diinduksi dengan kristal) (Mullin, J.W, 2001).

Nukleasi dapat terjadi ketika larutan berada pada kondisi

supersaturated dengan ∆G rendah. ∆G didefinisikan sebagai energi yang

dibutuhkan 1 mol senyawa untuk berpindah dari kondisi supersaturated

dengan konsentrasi C ke kondisi saturated.

[ ] [ ]qRTSCRTG ln/ln −=−=Δ (2)

keterangan : R : konstanta gas (8,314 J/mol.K)

T : suhu absolut (K)

C/S = q : rasio supersaturated

S menunjukkan konsentrasi larutan yang setimbang dengan fase padat,

sehingga persamaan di atas menunjukkan energi yang ditransfer oleh 1 mol

senyawa dari larutan ke fase kristal (Cartensen, J.T, 2001).

Setelah nukleasi, terjadi pertumbuhan kristal. Pertumbuhan

kristal ini merupakan proses peningkatan ukuran kristal. Kristal dapat

tumbuh melalui penempelan senyawa dengan sifat yang sama karena

penurunan energi permukaan pada nukleus, adsorbsi, pembentukan lapisan



13

Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh impurities.

Impurities ini dapat mempengaruhi proses nukleasi maupun pertumbuhan

kristal. Pada proses nukleasi peningkatan jumlah impurities dapat

meningkatkan pembentukan lapisan koloidal sehingga menghambat proses

nukleasi. Jika impurities berupa senyawa yang larut maka dapat

menyebabkan perubahan kesetimbangan kelarutan, sedang jika impurities

berupa senyawa tak larut maka efek yang terjadi tidak dapat diprediksi


Pada proses pertumbuhan kristal impurities menyebabkan

pertumbuhan paralel dan twinning atau macle. Pertumbuhan paralel dan

twinning dapat terlihat pada produk akhir kristal. Pertumbuhan paralel

terjadi ketika terjadi pertumbuhan kristal yang tidak normal secara

vertikal, sedang twinning atau macle terjadi secara horisontal (Mullin, J.W,

2001).

(a) (b)

Gambar 3. Contoh dampak impurities (a) pertumbuhan paralel (b) twinning atau macle


14

G. Kromatogafi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan tipe kromatografi

planar. KLT ini mengidentifikasi senyawa berdasar kemampuan migrasi

yang dideskripsikan dalam nilai R (retardation factor). f

R = jarak elusi sampel f . (3) jarak elusi fase gerak

Nilai Rf dapat bervariasi dari 0 hingga 1, atau dari 0 hingga 100 jika

dikalikan dengan 100 disebut hRf (Sherma, J. dan Fried, B., 1996).

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap

berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30µm. Fase gerak

merupakan campuran pelarut yang murni sehingga memiliki daya elusi

sehingga nilai Rf antara 0,2-0,8 (Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007).

Migrasi fase gerak pada lapisan fase gerak disebabkan gaya kapiler dan

kecepatan fase gerak yang menurun sesuai dengan peningkatan jarak elusi

(Sherma, J., dan Fried, B., 1996).

Deteksi senyawa pada plat KLT dapat secara fisika, kimia,

maupun biologi. Deteksi secara kimia menggunakan pereaksi semprot

iodin untuk identifikasi beberapa senyawa organik dengan memberikan

warna coklat (Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007), sedangkan vanilin-

asam sulfat digunakan untuk mendeteksi senyawa organik yang

mengandung alkohol dan keton dengan memberikan warna hitam setelah

dilakukan pemanasan (Gritter, Bobbit, Schwarting, 1991; Gandjar, I.G,

dan Rohman, A., 2007).


15

KLT dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dan

kuantitatif. Parameter KLT yang digunakan untuk identifikasi kualitatif

adalah nilai Rf. Analisis kuantitatif dengan KLT dapat dilakukan dengan 2

cara, yaitu dengan pengukuran luas bercak dan dengan pengerokan bercak

lalu menetapkan kadar senyawa dalam bercak dengan metode lain

(Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007). Pengukuran luas bercak dapat

dilakukan secara visual maupun dengan bantuan alat. Luas bercak

meningkat seiring dengan peningkatan jumlah senyawa. Pengukuran luas

bercak ini dilakukan pada bercak sampel dan standar pada plat yang sama

untuk mengurangi sistematik eror (Stahl, E., 1969).

Steviosida dapat diidentifikasi dengan KLT menggunakan fase

gerak kloroform : metanol : aquadest (30:20:4). Fase diam yang digunakan

ialah Silica gel 60F254, dengan ketebalan lapisan fase diam 0,25 mm.

Metode elusi untuk steviosida adalah dengan teknik asending (Morita, et

al., 1986).

H. ImageJ

ImageJ merupakan program yang dikembangkan oleh National

Institutes of Health (NIH) yang digunakan untuk menganalisis gambar.

Program ImageJ dapat digunakan untuk menganalisis jarak antar partikel,

skala pengukuran, mengukur area, dan mengelompokkan partikel

(Reinking, L., 2001). Dengan demikian program ImageJ ini dapat

digunakan untuk mengukur luas bercak pada KLT, dan dapat digunakan


16

untuk menghitung kadar senyawa pada bercak (Furutani, Itoh, Ijuin,

Tsujita, Takenawa, 2006). Aplikasi ImageJ telah dilakukan oleh Bart, et.al

(2007) pada analisis semikuantitatif lipid dengan menganalisis area bercak

hasil KLT.

I. Factorial Design

Factorial design digunakan untuk menjelaskan pengaruh efek

dari faktor yang berbeda, atau kondisi terhadap respon yang dihasilkan

(Bolton S. , 1990). Factorial design dapat digunakan untuk mengontrol

dua atau lebih variabel bebas dan mendeterminasikan efek pada tiap

variabel tersebut. Oleh karena itu, desain penelitian dengan factorial

design harus memiliki dua atau lebih variabel bebas pada satu waktu dan

efek terhadap variabel tergantung yang sama (De Muth, J. E., 1999).

Level ialah nilai dari masing-masing faktor. Berikut ini

merupakan desain percobaan untuk factorial design dua faktor (22) :

Tabel I. Jenis percobaan Simbol Faktor a Faktor b

1 Level rendah Level rendah a Level tinggi Level rendah b Level rendah Level tinggi ab Level tinggi Level tinggi

Prosedur optimasi dapat diperoleh melalui persamaan yang

mendeskripsikan hasil percobaan sebagai fungsi level faktor. Persamaan

polinomial dapat disusun jika terdapat hubungan antara faktor dan hasil


17

percobaan. Persamaan factorial design yang digunakan untuk menganalisis

percobaan faktorial 22 adalah :

+ β .X + βY = βo 1 1 2.X + β2 12.X .X (4) 1 2

Keterangan :

Y : respon yang diukur

Xi : level faktor

βi : koefisien faktor yang diperoleh dari respon desain formulasi

βo : intersep (Bolton S., 1990).

Factorial design memungkinkan kontrol variabel-variabel bebas,

dan mendeterminasikan efek masing-masing variabel bebas terhadap

variabel tergantung. Keuntungan utama dari factorial design adalah dapat

digunakan untuk mengevaluasi efek lebih dari satu variabel, kedua

variabel secara terpisah, dan kombinasi dari keduanya (De Muth, J. E. ,

1999).

J. Landasan Teori

Stevia merupakan salah satu tumbuhan yang berpotensi sebagai

pemanis pengganti gula karena kandungan glikosida steviol dalam Stevia,

terutama steviosida yang memiliki tingkat kemanisan hingga 300 kali

dibanding gula. Kristal steviosida dapat diperoleh melalui kristalisasi. Prinsip

dari pembentukan kristal adalah terjadi perubahan fase ke fase padat.

Salah satu cara kristalisasi adalah melalui pendinginan larutan.

Kristalisasi dengan proses pendinginan ini dipengaruhi oleh suhu dan lama


18

pendinginan. Kristalisasi dengan proses pendinginan berdasar perubahan fase

cair menjadi fase padat sehingga proses ini terjadi ketika senyawa menjadi

tidak larut. Suhu pendinginan ini mempengaruhi tingkat kelarutan steviosida.

Tingkat kelarutan steviosida menurun seiring dengan penurunan suhu. Lama

pendinginan juga mempengaruhi proses kristalisasi steviosida karena terdapat

range waktu kristalisasi terjadi. Dengan demikian perlu dilakukan penelitian

tentang kondisi pendinginan yaitu suhu dan lama pendinginan yang optimum

dalam proses kristalisasi steviosida dari daun stevia.

Respon berat kristal dan kandungan steviosida dalam kristal yang

diperoleh dianalisis menggunakan Yate’s treatment untuk mengetahui

pengaruh suhu dan lama pendinginan terhadap respon. Kombinasi suhu dan

lama pendinginan untuk menghasilkan kristal steviosida dengan respon

optimum diperoleh melalui contour plot superimposed menggunakan

persamaan factorial design yang diperoleh.

K. Hipotesis

1. Hipotesis 1 : Ada faktor utama penentu berat kristal dan kandungan

steviosida dalam kristal.

2. Hipotesis 2 : Kristal dengan kandungan steviosida dan berat kristal

yang optimum diperoleh melalui contour plot

superimposed.


BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan metode factorial

design.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah suhu (2 dan 140C) dan

lama pendinginan (12 dan 24 jam).

b. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah berat kristal dan

kandungan steviosida dalam kristal.

c. Variabel terkendali

Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah :

1) Simplisia yang digunakan ialah Stevia rebaudiana Bertonii

berumur 4 bulan, dari Tawangmangu, Jawa Tengah.

2) Suhu defatisasi, dikendalikan dengan suhu 55-66oC.

3) pH pada tahap klarifikasi dan kristalisasi

4) Jumlah kaolin yang ditambahkan yaitu 3% b/v.

5) Volume eter untuk ekstraksi, yaitu 70 ml (3 tahap).

19


20

d. Variabel tak terkendali

Variabel tak terkendali dalam penelitian ini adalah :

1) Cara penanaman dan pemeliharaan, yaitu penyiraman,

pemupukan, dan penyiangan.

2) Cara pembuatan simplisia, yaitu kondisi dan cara pengeringan

simplisia.

3) Viskositas larutan

4) Kandungan impurities dalam larutan sampel.

2. Definisi operasional

a. Suhu pendinginan adalah suhu yang digunakan dalam proses

kristalisasi steviosida yaitu 20 0C dan 14 C

b. Lama pendinginan adalah waktu yang digunakan dalam proses

kristalisasi steviosida yaitu 12 jam dan 24 jam.

c. Kristal steviosida adalah kristal yang terbentuk dari daun stevia

dengan perlakuan suhu (2 0C dan 140C) dan lama pendinginan (12

jam dan 24 jam).

d. Berat kristal adalah berat kristal yang terbentuk dengan perlakuan

suhu (2 0 0C dan 14 C) dan lama pendinginan (12 jam dan 24 jam),

dihitung terhadap berat serbuk daun stevia dan dinyatakan dalam

satuan %b/b.

e. Kandungan steviosida adalah kandungan steviosida dalam kristal

yang terbentuk dengan perlakuan suhu (20 0C dan 14 C) dan lama


21

pendinginan (12 jam dan 24 jam), dihitung terhadap berat kristal

dan dinyatakan dalam satuan %b/b.

f. Steviosida yang dimaksud adalah senyawa yang setara dengan

Steviosida p.a (Sigma-Stevioside 53572, 037K47152).

g. Kristal steviosida yang optimum adalah kristal dengan berat kristal

melebihi 1,2% terhadap serbuk daun stevia, dengan kandungan

steviosida dalam kristal melebihi 80%.

C. Alat Penelitian

Alat soxhletasi, Vacuum Rotary Evaporator (IKAVA® VC 2

RV 05-ST), timbangan analitik (ScalTec SB22), oven, corong pisah,

water bath, pipet tetes, dan alat-alat gelas yang lain.

D. Bahan Penelitian

Simplisia stevia dari B2P2TO2T (Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional), Tawangmangu,

Jawa Tengah, Steviosida p.a (Sigma-Stevioside 53572, 037K47152),

heksan, etanol 96%, TLC Aluminium Sheets 20×20cm Kieselgel G F254,

methanol p.a (E. Merck), kloroform p.a (E. Merck), aquabides, aquadest,

eter, kalsium oksida, kaolin, asam sitrat, pereaksi semprot iodin, pereaksi

semprot vanilin asam sulfat.


22

E. Jalan Penelitian

1. Defatisasi simplisia

Simplisia dibersihkan dari tanah dan pengotor lalu

dikeringkan dan diserbuk. 50 g serbuk simplisia kemudian

disoxhletasi dengan pelarut heksan. Soxhletasi dilakukan 2 kali

sirkulasi selama 2 x 8 jam. Residu sampel siap diekstraksi.

2. Ekstraksi

Serbuk hasil defatisasi ditimbang sebanyak 512 g,

kemudian ditambahkan pelarut etanol 96% : aquadest (1:1) 12,8 L

dan dilakukan maserasi selama 6 jam.

3. Deklorofilasi

Maserat dideklorofilasi mengggunakan elektrokoagulasi,

dengan perlakuan voltase 32 Volt, suhu 500C, jarak elektroda 1,5cm.

4. Klarifikasi dan kristalisasi

Ekstrak hasil deklorofilasi diatur hingga pH 3 dengan asam

sitrat. Ekstrak kemudian diklarifikasi menggunakan kaolin 3% b/v

dan disaring. Ekstrak hasil klarifikasi diatur hingga pH 10,5 dengan

CaO. Larutan disaring dan diatur hingga pH 7 dengan asam sitrat.

Filtrat diekstraksi menggunakan eter (3 tahap, masing-masing 70 ml

eter). Fase aquadest diambil dan dipekatkan hingga volume 200 ml.


23

Larutan sampel yang sudah pekat kemudian dibagi menjadi 8

masing-masing 25 ml dan didinginkan hingga terbentuk kristal.

Setiap larutan dikenai perlakuan pendinginan dengan suhu 20C dan

140C, selama 12 jam dan 24 jam. Kristal yang terbentuk kemudian

dikeringkan pada suhu 80 hingga 900C hingga bobot tetap dan

dilakukan penetapan kadar steviosida dalam kristal.

5. Penetapan kandungan steviosida

Penetapan kandungan steviosida menggunakan Kromatografi Lapis

Tipis (KLT), dengan

Fase diam : TLC Aluminium Sheets 20×20cm Kieselgel G F254

Fase gerak : kloroform : metanol: aquabides (30:20:4)

Deteksi : semprot iodin, kemudian semprot vanilin-asam

sulfat dan dipanaskan hingga terbentuk bercak

hitam.

a. Kurva Baku

Larutan standar steviosida 1 mg/ml dalam aquabides.

Larutan standar kemudian ditotolkan pada fase diam dengan

volume 2,4,6,8,10,14 µl, lalu dikembangkan bersamaan dengan

sampel. Analisis luas bercak dilakukan dengan program ImageJ

kemudian dilakuan penentuan persamaan kurva baku.


24

b. Preparasi sampel

Preparasi sampel dilakukan dengan menimbang 10 mg

kristal yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan aquabidest

hingga volume 10 ml. Masing-masing sampel ditotolkan

sebanyak 8µl pada fase diam, lalu dikembangkan. Analisis AUC

bercak dilakukan dengan program ImageJ kemudian penentuan

kandungan steviosida dengan persamaan kurva baku.

F. Analisis Data

Analisis data dilakukan untuk mengetahui faktor yang

mempengaruhi respon serta kondisi proses kristalisasi steviosida dari

daun stevia untuk memperoleh respon optimum. Faktor yang dimaksud

adalah suhu dan lama pendinginan. Respon yang diperoleh yaitu berat

kristal dan kandungan steviosida dianalisis dengan Yate’s treatment

untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi respon.

Persamaan faktorial dua faktor yaitu Y = βo + β1.X + β .X1 2 2 +

β12.X .X1 2 diperoleh pada masing-masing respon. Persamaan ini dibuat

contour plot untuk mengetahui kombinasi faktor dengan respon yang

diinginkan yaitu kandungan steviosida terbesar dan kristal yang terberat.

Contour plot kedua respon digabung untuk memperoleh contour plot

superimposed. Daerah yang gabungan pada contour plot superimposed

menunjukkan kondisi suhu dan lama pendinginan optimum dengan

karakter kristal steviosida yang baik.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Defatisasi Simplisia

Simplisia yang digunakan ialah daun stevia (Stevia Rebaudiana Bertonii)

berasal dari B2P2TO2T (Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman

Obat dan Obat Tradisional), Tawangmangu, Jawa Tengah. Simplisia ini telah

dideterminasi oleh B2P2TO2T (Lampiran 1). Simplisia ini kemudian disortir

untuk memisahkan pengotor dan batang, dikeringkan dan diserbuk. Setelah

diserbuk, simplisia didefatisasi dengan soxhletasi. Defatisasi dilakukan untuk

menghilangkan senyawa non polar (lemak) karena lemak ini dapat menganggu

proses kristalisasi. Defatisasi ini menggunakan pelarut heksan karena merupakan

pelarut sangat non polar dengan polaritas 0,1 (Gandjar, 2007) sehingga

diharapkan semua senyawa non polar dapat dipisahkan.

B. Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan untuk menarik steviosida dari daun stevia. Pemilihan

pelarut aquadest dan etanol karena steviosida sangat larut dalam aquadest dan

etanol (Anonim, 2007). Etanol 96% juga dapat meminimalkan perkembangan

mikroba sesuai dengan ketentuan Farmakope Indonesia edisi IV di mana ekstraksi

menggunakan pelarut aquadest dan etanol. Komposisi pelarut yang digunakan

adalah aquadest : etanol 96% (1:1) dengan volume 100 ml dan suhu 500C.

25


26

C. Deklorofilasi

Deklorofilasi bertujuan untuk menghilangkan klorofil sehingga gangguan

kristalisasi berkurang dan meningkatkan acceptabilitas kristal yang terbentuk.

Deklorofilasi dilakukan menggunakan elektrokoagulasi dengan voltase 32 cm,

jarak elektrode 1,5 cm, dan suhu 50 0C. Elektrokoagulasi bekerja dengan

mengkoagulasi bahan koloidal seperti klorofil dalam suatu larutan dengan bantuan

Al3+ sebagai koagulan. Pada proses ini terjadi reduksi H2O dan oksidasi logam

aluminium menghasilkan gas, buih dan flok logam hidroksida yaitu Al(OH)3.

Selain itu, selama proses ini logam Mg2+ di dalam klorofil tereduksi menjadi

logam Mg0 (Sunardi, 2007). Flok Al(OH)3 memiliki daya adsorbsi yang kuat

terhadap logam sehingga logam Mg (magnesium) akan teradsorbsi.

Teradsorbsinya magnesium ini mengakibatkan klorofil mengendap bersama

dengan AlOH sehingga mudah dipisahkan dari maserat. 3

D. Klarifikasi dan Kristalisasi

Pada tahap ini dilakukan klarifikasi dengan penambahan asam sitrat

hingga pH larutan menjadi 3. Pada pH 3 ini asam sitrat dapat berfungsi sebagai

agen pengkelat logam, protein dan agen pewarna, sehingga senyawa yang tidak

bisa dihilangkan pada tahap deklorofilasi dapat berkurang.

Ekstrak kemudian difiltrasi menggunakan kaolin. Kaolin dipilih karena

merupakan agen pengabsorbsi dye yang kuat karena memiliki banyak pori dan

kerja kaolin sebagai decoloring agent optimum pada pH 3 (Asmatulu, 2002).

Kaolin bekerja dengan menjerap dye pada pori-pori dalam serbuk kaolin.


27

Setelah filtrasi dengan kaolin, filtrat ditambahkan CaO. CaO dapat

mengurangi impurities yang bersifat basa dengan mengikat senyawa basa pada

permukaan CaO sehingga senyawa basa teradsorbsi di permukaaan CaO. CaO ini

tidak larut air sehingga mudah mengendap dan dapat dipisahkan. Setelah

penambahan CaO dilakukan ekstraksi dengan eter untuk senyawa non polar yang

belum dapat dipisahkan pada proses sebelumnya. Ekstraksi ini merupakan tahap

terakhir proses klarifikasi.

Fase aquadest hasil ekstraksi kemudian diambil dan diberi perlakuan

suhu dan lama pendinginan untuk proses kristalisasi. Suhu yang digunakan adalah

20C dan 140C sedang lama pendinginan yang digunakan 12 dan 24 jam. Perlakuan

suhu dan lama pendinginan ini dipilih berdasar penelitian Kumar, S. (1986)

sehingga suhu dan lama pendinginan tersebut merupakan kondisi pembentukan

kristal steviosida.

E. Penentuan Respon dan Factorial Design

Respon yang diukur adalah berat kristal yang diperoleh dan kandungan

steviosida dalam kristal.

1. Kandungan steviosida dalam kristal

Kandungan steviosida diperoleh melalui pengukuran luas bercak hasil

KLT (gambar 4) yang diolah menggunakan program ImageJ. Bercak kurva

baku dan sampel dilakukan pada satu lempeng untuk mengendalikan faktor

yang mempengaruhi elusidasi pada plat KLT. Luas bercak tiap totolan pada

kurva baku diukur untuk menentukan persamaan kurva baku (Tabel II).


28

Rf

1,00

0,50

2 4 6 8 10 12 14 1 11 2 b b a a1 2 1 2 ab ab 0,00 1 2 seri baku sampel

Gambar 4. KLT seri baku dan sampel

Keterangan : Fase diam : TLC Aluminium Sheets 20×20cm Silica gel GF254 Fase gerak : kloroform : metanol: aquabides (30:20:4) Deteksi : semprot iodin, kemudian semprot vanilin-asam sulfat dan

dipanaskan. Seri baku : massa 2 µg, 4 µg, 6 µg, 8 µg, 10 µg, 12 µg, 14 µg. Sampel : 1 : suhu level rendah (20C) dan lama pendinginan level rendah (12 jam) b : suhu level rendah (20C) dan lama pendinginan level tinggi (24 jam) a : suhu level tinggi (140C) dan lama pendinginan level rendah (12 jam) ab: suhu level tinggi (140C) dan lama pendinginan level tinggi (24 jam)

: percobaan utama 1 : replikasi 1 2 Pelarut baku steviosida dan sampel kristal : aquabides


29

Tabel II. Hasil luas bercak seri baku menggunakan program ImageJ RNo. Volume totolan (μl) Massa (μg) Luas bercak f

1 2 2 1261,3100 0,79 2 4 4 1567,4576 0,79 3 6 6 2449,3299 0,80 4 8 8 4213,5904 0,81 5 10 10 6381,6295 0,82 6 12 12 8236,6460 0,82 7 14 14 9024,3325 0,82

Dari penelitian diperoleh persamaan kurva baku Y = 724,2811X –

1060,7783. Persamaan kurva baku ini dapat digunakan untuk perhitungan

kandungan steviosida dalam sampel karena memiliki nilai r : 0,9817 yang

melebihi nilai r tabel dengan α : 0,001, yaitu 0,925.

Gambar 5. Kurva baku steviosida


30

Persamaan kurva baku yang diperoleh kemudian digunakan untuk

perhitungan kandungan steviosida dalam kristal (Tabel III). Kandungan

steviosida dalam kristal ini kemudian digunakan untuk menentukan persamaan

factorial design (Lampiran 4).

Tabel III. Kandungan steviosida dalam kristal

Keterangan : T : suhu pendinginan.

Perlakuan % steviosida (%b/b)

Rata-rata 0 RNo Notasi % steviosida SD T ( C) t(jam) f

Y Y X X1 2

t : lama pendinginan. 1 : suhu level rendah dan lama pendinginan level rendah. b : suhu level rendah dan lama pendinginan level tinggi. a : suhu level tinggi dan lama pendinginan level rendah. ab : suhu level tinggi dan lama pendinginan level tinggi.

Persamaan factorial design yang diperoleh adalah Y = 72,2798 +

1,1395X1 + 0,5602X2 – 0,0979X1X2. Persamaan ini digunakan untuk membuat

grafik hubungan faktor dengan respon (Gambar 6 dan Gambar 7).

79,5072 0,82 1 1 2 12 78,3581 0,82

78,9327 0,8125

78,1219 0,81 2 a 14 12 78,9059 0,81

78,5139 0,5544

81,7017 0,82 3 b 2 24 84,9113 0,82

83,3065 2,2695

68,6202 0,80 4 ab 14 24 68,9695 0,79

68,7948 0,2470


31

Gambar 6. Hubungan suhu pendinginan terhadap kandungan steviosida

dalam kristal

Gambar 7. Hubungan lama pendinginan terhadap kandungan steviosida

dalam kristal

Koefisien faktor pada persamaan factorial design menujukkan

bahwa suhu merupakan faktor paling menentukan dan meningkatkan

kandungan steviosida dari pada lama pendinginan. Hal ini tidak sesuai dengan


32

hasil perhitungan efek faktor terhadap respon (Lampiran 4), karena diperoleh

hasil bahwa suhu merupakan faktor dengan efek dominan tetapi suhu bersifat

menurunkan kandungan steviosida dalam kristal. Suhu merupakan faktor

dominan karena memiliki nilai efek paling besar yaitu -14,9304 dibandingkan

efek lama pendinginan (-5,3452) dan efek interaksi (-14,0929). Nilai negatif

pada masing-masing efek faktor dan interaksi ini menunjukkan bahwa faktor

dan interaksi bersifat menurunkan respon. Oleh karena itu, seiring peningkatan

level suhu maka kadar steviosida menurun, sesuai dengan Gambar 6. Analisis

dengan Yate’s treatment dilakukan pada penelitian ini karena faktor yang

benar-benar berpengaruh pada kadar steviosida belum dapat diketahui pasti.

Tabel IV. Hasil Yate’s treatment kandungan steviosida dalam kristal

source of variation sum of square mean square df Fhitung

Replikasi 1 1,2750 Treatments 3 225,0489 75,0163

a 1 111,4584 111,4584 68,1804 b 1 14,2856 14,2856 8,7387 ab 1 99,3049 99,3049 60,7460

1,6348 Experimental error 3 4,9043 Total 7 231,2282

Keterangan : a : suhu pendinginan b: lama pendinginan ab : interaksi

Berdasar perhitungan Yate’s treatment diperoleh bahwa Fhitung faktor

suhu lebih besar dari Ftabel(1,3) dengan taraf kepercayaan 95% yaitu 10, 128

sehingga menunjukkan bahwa Ho dan Ho ditolak. Ho1 3 1 ditolak menunjukkan

bahwa kandungan steviosida level rendah tidak sama dengan level tinggi,

sehingga faktor suhu merupakan faktor yang mempengaruhi kandungan

steviosida. Ho ditolak menunjukkan terdapat interaksi. Interaksi ini dapat 3


33

terlihat pada gambar 6 dan 7. Gambar 6 mengindikasi terdapat interaksi tetapi

interaksi ini tidak berada pada range level suhu pendinginan karena garis level

tinggi dan level rendah tidak sejajar. Pada gambar 7 dapat terlihat adanya

interaksi sehingga mendukung hasil perhitungan Yate’s treatment.

Perpotongan garis level rendah dan level tinggi suhu mengindikasikan terdapat

interaksi. Di sisi lain faktor lama pendinginan tidak mempengaruhi kandungan

steviosida karena memiliki Fhitung faktor suhu lebih kecil dari Ftabel(1,3),

meskipun terjadi perubahan kandungan steviosida terhadap lama pendinginan

tetapi perubahan ini dapat diabaikan.

Proses kristalisasi ditentukan oleh tingkat kelarutan senyawa tersebut

karena kristalisasi terjadi ketika senyawa menjadi tidak larut. Menurut Mullin

(2001) kelarutan senyawa selain dipengaruhi kekuatan pelarut untuk

melarutkan senyawa, juga dipengaruhi oleh suhu. Suhu memiliki pengaruh

pada tingkat kelarutan suatu senyawa di mana semakin turun suhu maka

tingkat kelarutan senyawa menjadi menurun. Berdasar hasil penelitian

diperoleh bahwa kandungan steviosida meningkat seiring dengan peningkatan

suhu, sehingga dapat diketahui bahwa kristal dengan kandungan steviosida

terbesar berada di sekitar suhu pendingan level tinggi.

Selain itu lama pendinginan juga mempengaruhi kristal terbentuk

karena menurut Flint, Y. (1989) kristalisasi membutuhkan waktu hingga kristal

terbentuk. Kandungan senyawa dalam kristal akan meningkat seiring dengan

peningkatan lama pendinginan hingga senyawa tersebut tidak dapat

mengendap lagi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa range waktu 12 dan 24


34

jam termasuk dalam range waktu yang dibutuhkan steviosida untuk mengristal

meskipun tidak mempengaruhi kandungan steviosida.

2. Berat kristal

Berat kristal diperoleh dengan cara penimbangan setelah kristal

mencapai bobot tetap di mana selisih 2 kali penimbangan setiap jam kurang

dari 0,25% (Anonim, 1995). Berat kristal ini dihitung terhadap serbuk daun

stevia yang digunakan pada tiap perlakuan (Tabel V).

Tabel V. Berat kristal Perlakuan Berat

kristal (%b/b)

Rata-rata berat kristal (%b/b) 0No Notasi SD T ( C) t(jam)

Y X X1 21,0371 1 1 2 12

0,9110 0,1783 0,7849 1,1409 2 a 14 12

1,0114 0,1832 0,8818 1,4125 3 b 2 24

1,4545 0,0594 1,4965 1,1641 4 ab 14 24

1,0896 0,1054 1,0150 Keterangan :

T : suhu pendinginan t : lama pendinginan

Pada tabel V terlihat bahwa faktor lama pendinginan memiliki

pengaruh lebih besar dibanding faktor suhu tetapi pengaruh ini dapat diketahui

dengan pasti melalui perhitungan Yate’s treatment. Perhitungan efek

(Lampiran 6) menunjukkan bahwa lama pendinginan merupakan efek yang

dominan karena memiliki nilai efek terbesar yaitu 0,6217 dibandingkan nilai


35

efek faktor suhu pendinginan (-0,2646) dan interaksi (-0,4653). Hasil

perhitungan ini sesuai dengan persamaan factorial design yang diperoleh yaitu

Y = 0,2732 + 0,0471X + 0,0518 X – 0,0032X X1 2 1 2, yang menunjukkan

koefisien terbesar ialah faktor lama pendinginan yaitu 0,0518. Nilai efek antar

faktor dan koefisien antar faktor memiliki nilai yang serupa, maka perlu

dilakukan perhitungan Yate’s treatment utuk mengetahui faktor yang benar-

benar mempengaruhi berat kristal steviosida.

Tabel VI. Hasil Yate’s treatment berat kristal

Source of variation sum of squares mean squares df Fhitung1,0042 Replikasi 1 0,3365 0,3365 Treatments 3

a 1 0,0350 0,0350 0,1136b 1 0,1933 0,1933 0,6273ab 1 0,1083 0,1083 0,3514

-0,9242 -0,3081 Experimental error 3 Total 7 0,4165 Keterangan : a : suhu pendinginan b: lama pendinginan ab : interaksi

Tabel VI menunjukkan bahwa tidak ada faktor mempengaruhi berat

kristal karena nilai Fhitung baik faktor suhu, faktor lama pendinginan, dan

interaksi memiliki lebih kecil dari pada Ftabel (1,3) dengan taraf kepercayaan

95% yaitu 10,128. Hal ini menunjukkan bahwa tidak faktor dominan yang

mempengaruhi berat kristal. Pernyataan ini tidak sesuai dengan dugaan

sebelumnya yang menyatakan lama pendinginan merupakan faktor dominan.

Hal ini disebabkan oleh selisih berat kristal tiap level, nilai efek, dan koefisien

pada tiap faktor menujukkan nilai yang serupa.


36

Hubungan suhu pendinginan terhadap berat kristal dan lama

pendinginan terhadap berat kristal dapat terlihat pada gambar 8 dan 9.

Gambar 8. Hubungan suhu pendinginan terhadap berat kristal

Gambar 9. Hubungan lama pendinginan terhadap berat kristal


37

Pada gambar 8 menunjukkan bahwa terdapat interaksi yang dapat

mempengaruhi berat kristal sedangkan gambar 9 menunjukkan bahwa

peningkatan level lama pendinginan dapat menurunkan berat kristal. Gambar 9

juga tidak menunjukkan adanya interaksi pada range level lama pendinginan

karena tidak terdapat perpotongan garis level rendah dan level tinggi lama

pendinginan, tetapi interaksi ini terjadi di luar level lama pendinginan. Akan

tetapi perhitungan Yate’s treatment menyatakan tidak terdapat faktor yang

mempengaruhi berat kristal sehingga perubahan berat kristal yang terlihat pada

gambar 8 dan 9 dapat diabaikan.

F. Contour Plot

Persamaan factorial design yang diperoleh dapat digunakan untuk

penentuan respon karena berdasar perhitungan Yate’s treatment, interaksi

memberikan pengaruh baik terhadap kandungan steviosida dalam kristal

maupun berat kristal. Interaksi merupakan variabel yang tak terkendali

sehingga jika interaksi memberikan pengaruh pada respon maka persamaan

factorial design tidak mencerminkan kondisi yang sebenarnya jika dilakukan

ekstrapolasi. Oleh karena itu, persamaan factorial design yang diperoleh dapat

digunakan hanya pada kondisi yang sama dengan kondisi penelitian.

Masing-masing persamaan factorial design yang diperoleh

kemudian dibuat contour plot, untuk mengetahui pengaruh kombinasi faktor

suhu dan lama pendinginan terhadap respon untuk memperoleh kristal yang

diinginkan. Kristal dianggap memiliki karakter yang baik ialah kristal dengan


38

berat kristal melebihi 1,2% terhadap serbuk daun stevia, dengan kandungan

steviosida dalam kristal melebihi 80%.

Gambar 10. Contour plot suhu dan lama penyimpanan terhadap kandungan

steviosida dalam kristal

Gambar 10 merupakan contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap

kandungan steviosida dalam kristal. Kandungan steviosida yang diperoleh

pada kondisi percobaan berada di sekitar 69 %b/b sampai dengan 83% b/b.

Area yang diarsir merupakan kombinasi suhu dan lama pendinginan yang

menghasilkan kandungan steviosida melebihi 80%.


39

Gambar 11. Contour plot suhu dan lama pendinginan terhadap berat kristal

Contour plot suhu dan lama pendinginan dapat dilihat pada gambar

11. Gambar 11 menunjukkan bahwa dengan perlakuan suhu dan lama

pendinginan dapat menghasilkan berat kristal terhadap berat serbuk daun

stevia di sekitar 1,0 %b/b hingga 1,5%b/b. Area yang diarsir pada gambar 11

ialah area suhu dan lama pendinginan yang menghasilkan berat kristal

melebihi 1,2%.


40

Gambar 12. Contour plot superimposed kandungan steviosida dan

berat kristal

Dari kedua contour plot di atas kemudian dibuat contour plot

superimposed untuk memperoleh daerah optimum hasil kombinasi faktor

suhu dan lama pendinginan. Daerah optimum ini memiliki karakter kristal

dengan berat kristal dan kandungan steviosida dalam kristal yang diinginkan

yaitu kristal dengan berat kristal melebihi 1,2 %, dengan kandungan

steviosida dalam kristal melebihi 80%. Kombinasi suhu dan lama

pendinginan untuk memperoleh kristal dengan kriteria di atas terletak pada

daerah yang diarsir pada gambar 12.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Dari penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

a. Faktor dominan terhadap kandungan steviosida dalam kristal adalah

faktor suhu pendinginan dan terdapat interaksi, tetapi tidak ada faktor

yang dominan terhadap berat kristal yang diperoleh.

b. Kombinasi antara suhu dan lama pendinginan dapat menghasilkan kristal

dengan berat kristal lebih dari 1,2 % terhadap serbuk daun stevia, dengan

kandungan steviosida dalam kristal lebih dari 80%.

B. Saran

a. Perlu dilakukan penentuan kandungan steviosida menggunakan metode

kuantitatif lain seperti HPLC (High Performance Liquid

Chromatography), karena metode KLT dengan analisis ImageJ ini

merupakan metode semikuantitatif.

b. Perlu dilakukan studi mengenai pengaruh suhu dan lama penyimpanan

terhadap kualitas kristal yang diperoleh (misal kelarutan, bentuk

kristal).

41


42

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1986a, edited by G Lyn O'brien Nabors dan Robert C, Alternative

Sweeteners, 295-305, Marcell Dekker Inc, New York. Anonim, 1986b, Sediaan Galenik, 10-13, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia IV, 7, 1002, 1036, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2007, Compendium Of Food Additive Specifications, 61-64, Food And

Agriculture Organization Of The United Nations. AR, Rahmani, 2008, Removal of Water Turbidity by the Electrocoagulation

Method, J Res Health Sci, Vol. 8, No. 1, 18-24. Asmatulu, R., 2002, Removal of the Discoloring Contaminants of an East

GeorgiaKaolin Clay and its Dewatering Turkish J. Eng. Env. Sci., 26, 447 -453.

Bartz, R., Li, Wen-Hong, Venables, B., Zehmer, J.K, Roth, M.R., Welti, R.,

et.al., 2007, Lipidomics Reveals That Adiposomes Store Ether Lipids and Mediate Phospholipid Traffic, Journal of Lipid Research, 48, 837-847.

Blum-Fretz, C., Baumann, A., dan Feife, S., 2007, Fat determination, automated

extraction, Soxhlet, hot extraction, BÜTCHI Labortechnik AG, Switzerland.

Bolton S. , 1990, Pharmaceutical Statistic, Practical and Clinical Applications

2nd ed., Revised and Expanded, 308-334, Marcel Dekker Inc., New York.

Brandle, J.E., dan Rosa, N, 1992, Heritability for yield, leaf stem ratio and stevioside content estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana, Can. J. Plant Sci, 72: 1263-1266.

Bruneton, J., diterjemahkan Caroline K. Halton, 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants 2nd ed., 653, Lavoisier Publishing, France.

Cartensen, J.T, 1998, Pharmaceutical Preformulation, 129, Tecnomic Publishing

Co. Inc., Pennsylvania. Cartensen, J.T, 2001, Advanced Pharmaceutical Solid, 109, 133-156, 268-278,

Marcel Dekker Inc., New York.


43

De Muth, J. E. , 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Aplications,

265-266, Marcel Dekker, New York. Elkins, R., 1997, Stevia Nature’s Sweeteners, 6-10, Wooslang Publishing,

Pleasant Grove, UT. Felicia, O.C, Neli, D., Mihai, O., 2003, The New Low Calorie Sweetener Review,

Acta Universitatis Cibiniensis, 2003, 1, 7, 3-10. Flint, Y., 1986, translated by V. Snigirevskaya, Essential of Crystallography, 7-

34, Peace Publishers, Moscow. Furutani, M., Itoh, T., Ijuin, T., Tsujita, K., Takenawa, T., 2006, Thin Layer

Chromatography–Blotting, a Novel Method for the Detection of Phosphoinositides , J. Biochem. 139, 663–670.

Gandjar, I.G, dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, 353-370, 382,

Pustaka Pelajar, Yogyakarta. Gardana, C., Simonetti, P., Canzi, E., Zanchi, R., Pietta, P., 2003, Metabolism of

Stevioside and Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Extracts by Human Microflora, J. Agric. Food Chem, 51, 6618-6622.

Gritter, R.J, Bobbit, J.M, Schwarting, A.E, 1991, Pengantar Kromatografi edisi

kedua, 135, Penerbit ITB, Bandung. Kumar, S., 1986, Method for Recovery of Stevioside, United Stated Patent

Document. Leung, A.Y dan Foster, S., 1996, Encyclopedia of Common Natural Ingredients

Used in Food, Drug, and Cosmetics 2nd ed., 478-480, John Wiley & Sons Inc., New York.

Mechelhoff, M. , Kelsall, G., Graham, N. , 2008, Electrocoagulation for Water

Treatment, http://www3.imperial.ac.uk/electrochemicalengineering/research/ projects/electrocoagulation, diakses tanggal 7 November 2008.

Megeji, N.W., Kumar, J. K., Singh,V., Kaul, V. K., dan Ahuja, P.S. 2005,

Introducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener, Current Science, Vol. 88, No. 5, 801-804.

Morita, T., Takasutki, Fujita, I., Kashihara, Isamura, J., dan Yao, 1978,,

Sweetening Compound, Method of Recovery, And Use There Of, United Stated Patent.


http://www3.imperial.ac.uk/electrochemicalengineering/

44

Mullin, J.W, 2001, Crystallization 4th ed., 86-132, 181-268, Butterworth

Heinemann,Oxford. Rank, A.H., dan Midmore, D.J., 2006, Stevia-An Intenses, natural sweetener, 3-6,

Rural Industries Research and Development Corporation, Australia. Reinking, L., 2001, ImageJ Basics, Department of Biology, Millersville

University, Millersville Sherma, J. dan Fried, B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, edisi

2, 7-8, Marcel Dekker Inc., New York Stahl, E., 1969, Thin Layer Chromatography, 135-138, Spinger Verlag, New

York. Sunardi, 2007, Pengaruh Tegangan Listrik dan Kecepatan Alir Terhadap Hasil

Pengolahan Limbah Cair yang Mengandung Logam Pb, Cd, dan TSS Menggunakan Alat Elektrokoagulasi, Seminar Nasional III SDM Teknologi Nuklir Yogyakarta, 442-446.

Wallin H., 2004, STEVIOL GLYCOSIDES Chemical and Technical Assessment,

Prepared by © FAO Chemical and Technical Assessment 63rdJECFA.


45

LAMPIRAN


46

Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi


47


48

Lampiran 2. Hasil tahapan untuk memperoleh kristal steviosida

1. Maserat 2. Hasil deklorofilasi

3. Sebelum penambahan kaolin 4. Setelah penambahan kaolin

5. Larutan jenuh sampel 6. Kristal


49

Lampiran 3. Penentuan luas bercak menggunakan program ImageJ Proses penentuan luas bercak :

1. Scan plat KLT dan simpan dalam format .tiff.

2. File berisi hasil scan plat KLT dibuka melalui program ImageJ dengan cara

pilih File lalu Open.

3. Plat KLT dibersihkan menggunakan Picture Tools pada program ImageJ.

Sebelum dibersihkan Setelah dibersihkan

4. Setelah bercak terlihat tunggal, kemudian pilih Process, pilih Binary, Make

Binary.

Hasil Binary


50

5. Jika plat masih kotor, dilakukan pembersihan ulang dengan menggulangi

langkah 3.

6. Setelah Binary, pilih menu Analyze, pilih Uncalibrated. Pada kolom Function

pilih Uncalibrated OD yang menghasilkan grafik Calibration Function.

7. Area yang akan dihitung luas arenya ditentukan menggunakan icon

Rectangular Selection. Area bercak pertama ditentukan kemudian pilih menu

Analyze, Gels, pilih Select First Line Ctrl +1.

8. Area Rectangular Selection digeser ke bercak selanjutnya, kemudian pilih

menu Analyze, Gels, pilih Select Next Line Ctrl +2. Ulangi langkah 8 pada

seluruh bercak.

9. Pilih menu Analyze, Gels, pilih Plot Lanes Ctrl +3 sehingga menghasilkan

plot luas area bercak.


51


52

10. Dengan menggunakan Wand (Tracing) Tools, pilih area yang akan ditentukan

luasnya sehingga memberikan hasil luas area sebagai berikut :

Bercak ke Area

1261,3100 1 1567,4576 2 2449,3299 3 4213,5904 4 6381,6295 5 8236,6460 6 9024,3325 7

8 3122,2360 9 4051,5600 10 2972,3997 11 3675,8210 12 3299,2335 13 2880,1191 14 3487,7924 15 3331,1165


53

Lampiran 4. Penentuan kadar steviosida dalam kristal

1. Kadar baku steviosida

Massa steviosida = 10 mg

Kadar baku steviosida = massa/volume = 10 mg/10 ml = 1 mg/ml

Massa steviosida dalam 1 totolan (1μl) = 1 µg

2. Kurva baku steviosida

RNo. Volume totolan (μl) Massa (μg) Luas bercak f

1 2 2 1261,3100 0,79 2 4 4 1567,4576 0,79 3 6 6 2449,3299 0,80 4 8 8 4213,5904 0,81 5 10 10 6381,6295 0,82 6 12 12 8236,6460 0,82 7 14 14 9024,3325 0,82

Persamaan kurva baku : Y = BX + A

A : -1060,7783

B : 724,2811

r : 0,9817

Nilai r tabel dengan derajat bebas(df) : 6 adalah 0,925 (α : 0,001)

Persamaan kurva baku : Y = 724,2811X – 1060,7783


54

3. Grafik kurva baku steviosida

4. Kadar steviosida dalam kristal

Perlakuan Massa steviosida

% steviosida dalam kristal

(%b/b)

RNo Luas bercak Massa steviosida

Berat kristal per10ml

f

T (0 C) t(jam) per 8µl(μg) per 10 ml (mg) (mg) X X1 2

1 3122,2360 0,82 5,7754 7,2193 9,0800 79,5072 2 12 2 4051,5600 0,82 7,0585 8,8231 11,2600 78,3581

3 2972,3997 0,81 5,5685 6,9607 8,9100 78,1219 14 12 4 3675,8210 0,81 6,5397 8,1747 10,3600 78,9059

5 3299,2335 0,82 6,0198 7,5247 9,2100 81,7017 2 24 6 2880,1191 0,82 5,4411 6,8014 8,0100 84,9113

7 3487,7924 0,80 6,2801 7,8501 11,4400 68,6202 14 24 8 3331,1165 0,79 6,0638 7,5797 10,9900 68,9695

Keterangan : Rumus perhitungan kandungan steviosida dalam kristal (%b/b):

%100(mg) ml 10per kristalberat

)(ml 10per steviosidaberat xmg

% steviosida dalam kristal =


55

Contoh perhitungan konversi berat kristal :

No.1; perlakuan 20C, 12 jam

Berat steviosida per 10 ml : 7,2193 mg

Berat kristal per 10 ml : 9,0800 mg

%1009,0800mg

2193,7 xmg

% steviosida dalam kristal = = 79,5072 %b/b


56

Lampiran 5. Perhitungan factorial design: kandungan steviosida dalam kristal

Perlakuan % steviosida (%b/b)

Rata-rata % steviosida 0No Notasi SD T ( C) t(jam)

Y Y X X1 2

a. Perhitungan efek faktor

1) Efek faktor suhu pendinginan

Efek X1 = ½ [{ab + a} – {b + (1)}] = ½ [{(68,6202 + 68,9695) + (78,1219 + 78,9059)} – {(81,7017 + 84,9113) + (79,5072 + 78,3581)}] = -14,9304 2) Efek faktor lama pendinginan

Efek X2 = ½ [{ab + b} – {a + (1)}] = ½ [{(68,6202 + 68,9695) + (81,7017 + 84,9113)} – {(78,1219 + 78,9059)+ (79,5072 + 78,3581)}] = -5,3452

79,5072 1 1 2 12 78,9327 0,8125 78,3581

78,1219 2 a 14 12 78,5139 0,5544 78,9059

81,7017 3 b 2 24 83,3065 2,2695 84,9113

68,6202 4 ab 14 24 68,7949 0,2470 68,9695

0 T ( C) T(jam) Interaksi % steviosida Notasi X X X X Y 1 2 1 2

(1) - - + 79,9327 a + - - 78,5139 b - + - 83,3065 ab + + + 68,7949


57

3) Efek interaksi

Efek interaksi = ½ [{(1) + ab} – { a + b}] = ½ [{(79,5072 + 78,3581) + (68,6202 + 68,9695)} – {(78,1219 + 78,9059) + (81,7017 + 84,9113)}]

= -14,0929

b. Persamaan factorial design : Y = b + b X + b X + b0 1 1 2 2 12X X1 2 (1) : 78,9327 = b0 + 2b1 + 12b + 24b 2 12a : 78,5139 = b0 + 14b1 + 12b + 168b 2 12 b : 83,3065 = b0 + 2b1 + 24b + 48b 2 12ab : 68,7949 = b0 + 14b1 + 24b + 336b 2 12 Eliminasi b0 dan b1 dari persamaan b dan (1)

b : 83,3065 = b0 + 2b1 + 24b + 48b 2 12(1) : 78,9327 = b0 + 2b1 + 12b 2 + 24b12 _ 4,3739 = 12b + 24b2 12 ...(2) Eliminasi b0 dan b1 dari persamaan ab dan a

ab : 68,7949 = b0 + 14b1 + 24b + 336b 2 12 a : 78,5139 = b0 + 14b1 + 12b 2 + 168b12 _ -9,7191 = 12b2 + 168b12 ...(3) Eliminasi b2 dari persamaan (3) dan (2)

(2) : 4,3739 = 12b + 24b2 12 (3) : -9,7191 = 12b2 + 168b12 _ 14,0929 = -144 b12

b12 = -0,0979 Substitusi b12 = -0,0979 ke persamaan (2)

4,3739 = 12b + 24b2 12 4,3739 = 12b + 24(-0,0979) 26,7227 = 12b2

= 0,5602 b2 Substitusi b12 = -0,0979 dan b2 = 0,5602 ke persamaan (1) dan a

(1) : 78,9327 = b0 + 2b1 + 12b + 24b 2 12 78,9327 = b0 + 2b1 + 12(0,5602) + 24(-0,0979) 74,5588 = b0 + 2b ...(4) 1


58

a : 78,5139 = b0 + 14b1 + 12b + 168b 2 12 78,5139 = b0 + 14b1 + 12(0,5602) + 168(-0,0979)

88,2330 = b + 14b ...(5) o 1 Eliminasi b0 dari persamaan (4) dan (5)

(4) : 74,5588 = b0 + 2b1(5) : 88,2330 = bo + 14b1 _ -13,6742 = -12b1

b = 1,1395 1 Substitusi b = 1,1395 ke persamaan (4) 1

74,5588 = b0 + 2b1 74,5588 = b0 + 2(1,1395) b = 72,2798 0 Persamaan factorial design :

Y = 72,2798 + 1,1395X + 0,5602X – 0,0979X X1 2 1 2 b. Yate’s treatment

A : suhu pendinginan level rendah 1

: suhu pendinginan level tinggi A2

B : lama pendinginan level rendah B1

B : lama pendinginan level tinggi B2

AA1 2Keterangan

B B B BB1 B2 B1 B2

Percobaan 79,5072 81,7017 78,1219 68,6202 Replikasi 78,3581 84,9113 78,9059 68,9695


59

Hipotesis :

1) Ho

: µA = µA(a) Ho1 1 2

Rata-rata kandungan steviosida faktor suhu pendinginan level rendah

sama dengan rata-rata kandungan steviosida faktor suhu level tinggi.

(b) Ho : µB = µB2 1 2

Rata-rata kandungan steviosida faktor lama pendinginan level rendah

sama dengan rata-rata kandungan steviosida faktor suhu level tinggi.

(c) Ho : µA3 1,B - µAB1 1,B2 = µAB 2,B - µAB1 2,B2 B

Rata-rata selisih kandungan steviosida antar level sama.

2) Hi

(a) Hi : Ho1 1 salah

(b) Hi : Ho2 2 salah

(c) Hi : Ho3 3 salah

Σ y2 = total sum of squares Σ y2 = (79,5072)2 2 2 2 2+ (78,3581) +(81,7017) + (84,9113) +(78,1219) +

(78,9059) 819,0958)6( 2

2 + (68,6202)2 +(68,9695)2 - = 48.141,17943 – 47.909,9512 = 231,22823

Ryy = replicate sum of squares

Ryy =

( ) ( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

311,1448307,951 22

819,0958)6( 2

- = 47.911,22624 – 47.909,9512

= 1,27504


60

Tyy = treatment sum of squares

Tyy = ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +++2

(137,5897)(157,0278)(166,613)(157,8653) 2222

-

819,0958)6( 2

= 48.135,0001 – 47.909,9512 = 225,0489

Eyy = experiment all error sum of squares

= Σ y2 – Ryy – Tyy = 231,22823 - 1,2750 – (225,0489) = 4,9043

Ayy = sum of squares associated with the different level of a

=

( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

294,6175)324,4783( 22

819,0958)6( 2

- = 48.021,4096 – 47.909,9512 = 111,4584

Byy = sum of squares associated with the different level of b

=

( ) ( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

304,2027314,8931 22

819,0958)6( 2

- = 47.924,2368 – 47.909,9512

= 14,2856

AByy = Tyy – (Ayy + Byy) = 225,0489 – (111,4584 – 14,2856) = 99,3049

Analisis Variansi

source of variation sum of square mean square df Replikasi 1 1,2750

Treatments 3 225,0489 75,0163 a 1 111,4584 111,4584 b 1 14,2856 14,2856 ab 1 99,3049 99,3049

1,6348 Experimental error 3 4,9043 Total 7 231,2282


61

Fa = error alexperiment for squaresmeaneffect for squaresmean a

= 1,6348111,4584

= 68,1804

Fb = error alexperiment for squaresmeaneffect for squaresmean b

1,634814,2856

= = 8,7387

Fab = error alexperiment for squaresmeaneffect for squaresmean ab

1,634899,3049

= = 60,7460

Syarat : Ho ditolak jika Fhitung > Ftabel

Ftabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128

Hasil : Fa > Fab> Ftabel(1,3) > Fb

Kesimpulan :

(a) Ho ditolak 1

(b) Ho diterima 2

(c) Ho ditolak 3


62

Lampiran 6. Konversi berat kristal

Pada tahap maserasi sebanyak 512 gram serbuk stevia diekstrak

dengan pelarut sebanyak 12,8 L. Tahap terakhir sebelum kristalisasi dilakukan

pemekatan sampel hingga membentuk larutan jenuh dan diperoleh filtrat

sebanyak 200 ml. Filtrat dibagi menjadi 8 (4 perlakuan, 2 replikasi) dengan

volume masing-masing 25 ml.

Berdasar perlakuan di atas maka :

512 gram serbuk stevia ∼ 200 ml filtrat

64 gram serbuk stevia ∼ 25 ml filtrat

Berat kristal terhadap serbuk stevia dihitung dengan rumus :

%100(g)serbuk berat

)( xgalberatkrist %100gram 64

)( xgalberatkrist

%b/b = = Contoh : Notasi 1, percobaan utama

Berat kristal : 0,66375 g

%100g 64

66375,0 xg

%b/b = = 1,0371 %b/b


63

Hasil perhitungan berat kristal terhadap serbuk stevia(%b/b)

Perlakuan No Notasi T (0C) t(jam)

Berat kristal Berat kristal (%b/b) (g)

0,66375 1,0371 1 1 2 12 0,50232 0,7849 0,90400 1,4125 2 a 14 12 0,95779 1,4965 0,73015 1,1409 3 b 2 24 0,56433 0,8818 0,74505 1,1641 4 ab 14 24 0,64962 1,0150


64

Lampiran 7. Perhitungan factorial design : berat kristal

Perlakuan Berat kristal (%b/b)

Rata-rata berat kristal (%b/b) 0 SD No Notasi T ( C) t(jam)

Y Y X X1 21,0371 1 1 2 12

0,9110 0,17830,7849 1,1409 2 a 14 12

1,0114 0,18320,8818 1,4125 3 b 2 24

1,4545 0,05941,4965 1,1641 4 ab 14 24

1,0896 0,10541,0150

a. Perhitungan efek faktor

1) Efek faktor suhu pendinginan

Efek X1 = ½ [{ab + a} – {b + (1)}] = ½ [{(1,1641 + 1,0150) + (1,1409 + 0,8818)} – {(1,4125 + 1,4965) + (1,0371 + 0,7849)}] = -0,2646 2) Efek faktor lama pendinginan

Efek X2 = ½ [{ab + b} – {a + (1)}] = ½ [{(1,1641 + 1,0150) + (1,4125 + 1,4965)} – {(1,1409 + 0,8818) + (1,0371 + 0,7849)}] = 0,6217

Notasi T (0C) T(jam) Interaksi Berat kristal X X X Y X1 2 1 2

(1) - - + 0,9110 a + - - 1,0114 b - + - 1,4545 ab + + + 1,0896


65

3) Efek interaksi

Efek interaksi = ½ [{(1) + ab} – { a + b}] = ½ [{(1,0371 + 0,7849)+ (1,1641 + 1,0150)} – {(1,1409 + 0,8818) + (1,4125 + 1,4965)}] = -0,4653

b. Persamaan factorial design : Y = b + b X + b X + b0 1 1 2 2 12X X1 2

(1) : 0,9110 = b0 + 2b1 + 12b + 24b 2 12a : 1,0114 = b0 + 14b1 + 12b + 168b 2 12 b : 1,4545 = b0 + 2b1 + 24b + 48b 2 12ab : 1,0896 = b0 + 14b1 + 24b + 336b 2 12 Eliminasi b0 dan b1 dari persamaan b dan (1)

b : 1,4545 = b0 + 2b1 + 24b + 48b 2 12 (1) : 0,9110 = b0 + 2b1 + 12b 2 + 24b _ 12

0,5435 = 12b + 24b2 12 ...(2) Eliminasi b0 dan b1 dari persamaan ab dan a

ab : 1,0896 = b0 + 14b1 + 24b + 336b 2 12 a : 1,0114 = b0 + 14b1 + 12b 2 + 168b12 _

0,0782 = 12b + 168b2 12 ...(3) Eliminasi b2 dari persamaan (3) dan (2)

(2) : 0,5435 = 12b + 24b2 12 (3) : 0,0782 = 12b2 + 168b12 _

0,4653 = -144 b12

b12 = -0,0032

Substitusi b12 = -0,0032 ke persamaan (2)

0,5435 = 12b + 24b2 12 0,5435 = 12b + 24(-0,00207) 20,6211 = 12b2

b = 0,0518 2

Substitusi b12 = -0,0032 dan b2 = 0,0518 ke persamaan (1) dan a


66

(1) : 0,9110 = b0 + 2b1 + 12b + 24b 2 12 0,9110 = b0 + 2b1 + 12(0,0518) + 24(-0,0032) 0,3675 = b0 + 2b ...(4) 1

a : 1,0114 = b0 + 14b1 + 12b + 168b 2 121,0114 = b0 + 14b1 + 12(0,0518) + 168(-0,0032)

0,9332 = bo + 14b ...(5) 1 Eliminasi b0 dari persamaan (4) dan (5)

(4) : 0,3675 = b0 + 2b1 (5) : 0,9332 = bo + 14b1 _

-0,5657 = -12b1b = 0,0471 1

Substitusi b = 0,0471 ke persamaan (4) 1

0,3675 = b0 + 2b1 0,3675 = b0 + 2(0,0471)

b = 0,2732 0

Persamaan factorial design:

Y = 0,2732 + 0,0471X + 0,0518 X – 0,0032X X1 2 1 2

b. Yate’s treatment

A : level suhu rendah 1

A : level suhu tinggi 2

B : level lama pendinginan rendah B1

B : level lama pendinginan tinggi B2

A A1 2Keterangan

B B BBB1 B2 B1 B2

Percobaan 1,0371 1,4125 1,1409 1,1641 Replikasi 0,7849 1,4965 0,8818 1,0150


67

Hipotesis :

1) Ho

(a) Ho : µA = µA1 1 2

Rata-rata berat kristal faktor suhu pendinginan level rendah sama

dengan rata-rata berat kristal faktor suhu level tinggi.

(b) Ho : µB = µB2 1 2

Rata-rata berat kristal faktor lama pendinginan level rendah sama

dengan rata-rata berat kristal faktor suhu level tinggi.

(c) Ho : µA3 1,B - µAB1 1,B2 = µAB 2,B - µAB1 2,B2 B

Rata-rata selisih berat kristal antar level sama.

2) Hi

(a) Hi : Ho1 1 salah

(b) Hi : Ho2 2 salah

(c) Hi : Ho3 3 salah

yΣ 2 = total sum of squares Σ y2 = (1,0371)2 + (0,7849)2 2 2 2 + (1,4125) + (1,4965) + (1,1409) +

(0,8818)( )

88,9328 2

2 + (1,1641)2 2 +(1,0150) - = 10,3909 – 9,9744

= 0,4165

Ryy = replicate sum of squares

Ryy =

( ) ( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

4,17824,7546 22( )

88,9328 2

- = 10,0159 – 9,9744


68

= 1,0041 Tyy = treatment sum of squares

Tyy = ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +++2

,1791)2(,9090)2(,0227)2(,8220)1( 2222 ( )8

8,9328 2

- = 10,3109 – 9,9744 = 0,3365

Eyy = experiment all error sum of squares

= Σ y2 – Ryy – Tyy = 0,4165 – 1,0041 – 0,3365

= -0,9242 Ayy = sum of squares associated with the different level of a

=

( ) ( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

4,20184,7310 22( )

88,9328 2

- = 10,0094 – 9,9744 = 0,0350

Byy = sum of squares associated with the different level of b

=

( ) ( )⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +4

5,08813,8447 22( )

88,9328 2

- = 10,1676 – 9,9744

= 0,1933

AByy = Tyy – (Ayy + Byy) = 0,4165 – (0,0350 + 0,1933)

= 0,1083

Analisis Variansi Source of variation sum of squares mean squares df

Replikasi 1 1,0042 0,3365 0,3365 Treatments 3

a 1 0,0350 0,0350 b 1 0,1933 0,1933 ab 1 0,1083 0,1083

-0,9242 -0,3081 Experimental error 3


69

Total 7 0,4165

error alexperiment for squareseffect for squaresmean a

Fa = mean

= 0,3081-0,0350

= -0,1136 = I-0,1136I = 0,1136

Fb = error alexperiment for squaresmeaneffect for squaresmean b

0,3081-0,1933

= = -0,6273 = I-0,6273I = 0,6273

Fab = error alexperiment for squaresmeaneffect for squaresmean ab

0,3081-0,1083

= = -0,3514 = I-0,3514I = 0,3514

Syarat : Ho ditolak jika Fhitung > Ftabel

Ftabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128

Hasil : Ftabel (1,3) >Fb > Fab > Fa

Kesimpulan :

(a) Ho diterima 1

(b) Ho diterima 2

(c) Ho diterima 3


70

BIOGRAFI

Penulis bernama lengkap Fransisca Romana Dyah

Kuswantari lahir di Yogyakarta, 4 September 1987,

putri kedua dari pasangan Laurentius Pardjito dan

Caecilia Kumalasiwi. Penulis menyelesaikan

pendidikan TK Kanisius Wirobrajan Yogyakarta tahun

1991-1993, SD Kanisius Wirobrajan Yogyakarta tahun

1993-1999, kemudian pendidikan SMP Negeri 2

Yogyakarta tahun1999-2002, dilanjutkan SMA Santa

Maria Yogyakarta tahun 2002-2005. Selepas SMA

penulis masuk ke Fakultas Farmasi Sanata Dharma Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta sampai tahun 2009 dan menyelesaikan skripsi berjudul OPTIMASI

SUHU DAN LAMA PENDINGINAN DALAM PROSES KRISTALISASI

STEVIOSIDA DARI DAUN TANAMAN Stevia rebaudiana Bertonii DENGAN

FACTORIAL DESIGN. Selama belajar di Fakultas Farmasi, penulis pernah

menjadi Koordinator UKF Tari (tahun ajaran 2007/2008), Koordinator Program

Pengabdian Masyarakat (tahun 2008), dan asisten praktikum Biokimia (tahun

ajaran 2006/2007 dan 2007/2008) serta Farmakognosi Fitokimia I dan II (tahun

ajaran 2007/2008 dan 2008/2009).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · menthol. fraksinasi dan ... proses...

Documents