Bab II Tinjauan Pustaka

II.1 Tanaman Jarak

Tanaman jarak merupakan tumbuhan perdu berbatang tegak, tinggi tanaman kira-

kira 1-5 meter. Klasifikasi tanaman jarak berada di bawah regnum Plantae, divisio

Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Malpighiales, Familia Euphorbiaceae,

subfamilia Acalyphoideae, tribe Acalypheae, subtribe Ricininae, genus Ricinus

dan spesies Ricinus communis. Batangnya berkayu, bulat licin, berongga berbuku-

buku dengan tanda bekas tangkai daun yang lepas dan berwarna hijau dengan

semburat merah tua. Tanaman jarak berdaun tunggal dan tumbuh berseling.

Bentuk helai daun bundar, menjari 7 sampai 9, ujung daun runcing dan tepi

bergigi dengan ukuran daun 10-25 cm x 10-25 cm. Warna permukaan atas daun

hijau tua, sedangkan permukaan bawahnya hijau muda. Tangkai daun panjang

dengan ukuran sekitar 30-50 cm, berwarna merah tua, atau coklat kehijauan.

Bunganya merupakan bunga majemuk bentuk tandan, tumbuh di ujung batang.

berwarna kuning dan berkelamin satu. Benang sari banyak dengan tangkai putik

sangat pendek berbentuk benang berwarna merah atau merah muda. Buahnya

berupa buah kotak berbentuk bulat agak lonjong berlekuk tiga dan berkumpul

dalam tandan. Dalam buah terdapat tiga ruang yang masing-masing berisi satu

biji. Buahnya berduri lunak, berwarna hijau muda, dengan rambut berwarna

merah. Setelah tua buah akan berubah menjadi hitam dengan biji yang keras,

lonjong, berwarna coklat berbintik hitam. Tumbuhan ini mudah diperbanyak

dengan biji yang tua.

Tanaman jarak merupakan salah satu tanaman model untuk penelitian proses

transport dalam floem (Milburn, 1970). Hal ini disebabkan cairan floemnya dapat

diperoleh dalam jumlah relatif banyak dibandingkan tanaman lain. Umumnya

tanaman lain mempunyai mekanisme perlindungan yang akan menutup laju alir

cairan floem ketika dilakukan pengirisan pada seludang pembuluh, untuk

menghindari hilangnya nutrien dalam floem. Dengan demikian jalan keluar cairan

floem akan segera tertutup dan cairan yang keluar hanya sedikit (Jongebloed dkk.,

2004). Mekanisme tersebut jarang terjadi pada tanaman jarak, sehingga ketika

11

dilakukan pengirisan pada seludang pembuluh, cairan floem yang keluar dapat

diperoleh dalam jumlah relatif besar yang memungkinkan untuk analisis spesiasi

unsur.

II.2 Anatomi floem

Jaringan floem terdiri dari (i) unsur tapis atau anggota seludang pembuluh, (ii) sel

penyerta (companion cell, CC pada angiosperma) atau sel albumin (pada

gymnosperma), (iii) sel parenkima, dan (iv) sel serat floem (Gambar II.1 dan

Gambar II.2). Anatomi pembuluh minor pada daun, penting untuk memahami

pengangkutan-floem. Pembuluh besar di daun mencabang menjadi pembuluh

yang lebih kecil dan akhirnya menjadi pembuluh minor daun. Tiap pembuluh

minor hanya mempunyai satu pembuluh xilem dan satu atau dua seludang

pembuluh. Pembuluh itu biasanya di atas jaringan floem, dan unsur tapis lebih

kecil daripada sel penyerta yang mengelilinginya. Sel penyerta dan sel parenkima

floem kadang mengandung kloroplas dan sel mesofil yang aktif melakukan

fotosintesis.

Pada beberapa spesies, sel penyerta memiliki banyak dinding sel yang tumbuh ke

dalam, sehingga memperluas daerah permukaan membran sel. Sel dengan dinding

yang tumbuh ke dalam dan permukaan membran yang diperluas seperti ini

dinamakan sel pemindah. Walaupun kebanyakan spesies tak memiliki sel

pemindah dalam pembuluh minor daunnya, sel ini nyata berperan dalam

pemindahan asimilat dari sel mesofil ke seludang pembuluh, misalnya pada

banyak spesies kacang-kacangan dan ester. Sel pemindah tidak hanya ditemukan

dalam floem, tapi di seluruh bagian tumbuhan. Sel pemindah ditemukan di xilem

dan floem parenkima pada buku daun dan pada struktur reproduktif seperti pada

peralihan antara gametofit dan sporofit tumbuhan tingkat tinggi dan tumbuhan

tingkat rendah. Pada sistem floem lain yang ujungnya kosong, sel pemindah

berperan dalam pergerakan gula yang terurai di dalam endosperma biji yang

sedang tumbuh (Porter dkk., 1985 dalam Salisbury dan Ross, 1995).

12

Gambar II.1 Tiga dimensi batang dikotil berkayu, dimana xilem di sebelah dalam lapisan kambium dan floem di sebelah luar (Salisbury dan Ross, 1995).

Gambar II.2 Anatomi jaringan floem (Salisbury dan Ross, 1995). Catatan: SE = sieve element (unsur tapis), CC = companion cell (sel penyerta), V = vacuola (vakuola), N = nucleous (inti sel), SP = sieve plate (papan tapis) dan CW = cell wall (dinding sel).

13

Cara paling sederhana untuk menentukan jenis zat terlarut yang terdapat dalam

cairan floem adalah dengan memotong floem dan membiarkan cairannya keluar,

lalu tetesannya ditampung, kemudian dianalisis. Walaupun perdarahan sering

cepat dihentikan oleh protein-P dan bahan padat lainnya, dengan menyumbat pori

tapis, butir tetesan itu sering sudah terlanjur terbentuk sebelum perdarahan

terhenti. Mengendurnya tekanan dalam floem akibat pemotongan akan

menurunkan potensial air, sehingga air masuk melalui osmosis.

Perbandingan komposisi cairan xilem dan floem dalam tanaman jarak (Ricinus

communis L.) dapat dilihat pada Tabel II.1. Sebagai bahan perbandingan, pada

Tabel II.2 juga ditampilkan komposisi cairan xilem dan floem dalam tanaman

lupinus putih (Lupinus albus). Cairan floem mengandung senyawa hara organik

dan anorganik yang lebih banyak dibanding cairan xilem (Tabel II.1). Seperti

yang terlihat pada Tabel II.1 sekitar 90 %, materi yang ditranslokasikan dalam

floem terdiri dari sukrosa.

Tabel II.1 Perbandingan komposisi cairan xilem dan floem dalam tanaman jarak (Ricinus communis L.)

Komponen Cairan xilem (mg/mL)* Cairan floem (mg/mL)** Sukrosa Tidak ada data 80 - 106 Asam amino 0, 406 5,2 Asam organik 0,836 2,0 – 3,2 Protein Tidak ada data 1,45 – 2,20 Kalium 0,663 2,3 – 4,4 Klorida 0,014 0,355 – 0,675 Fosfat 0,384 0,350 – 0,550 Magnesium 0,096 0,109 – 0,122 pH 5,4 8,0 * Schurr dan Schulze (1995) ** Hall dan Baker (1972) dalam Taiz dan Zeiger (2002). Selain sukrosa, nitrogen juga ditranslokasikan dalam cairan floem. Pada beberapa

spesies, nitrogen anorganik diangkut dalam xilem sebagai nitrat, dan jarang

ditemukan dalam cairan floem. Pada spesies lain, nitrogen diangkut dalam xilem

sebagai ureida, amida, atau molekul kaya nitrogen lainnya. Molekul nitrogen

organik dari kelompok yang sama mungkin membawa sebagian besar nitrogen

14

dalam saluran xilem dan floem. Namun pada spesies tertentu dapat juga berbeda,

dimana alkaloid (nikotin) membawa serta sejumlah besar nitrogen dalam xilem.

Tabel II.2 Perbandingan komposisi cairan xilem dan floem tanaman lupinus

putih (Lupinus albus)*

Komponen Cairan xilem (mg/mL) Cairan floem (mg/mL) Sukrosa tidak terdeteksi 154 Asam amino 0,700 13 Kalium 0,090 1,540 Natrium 0,060 0,120 Magnesium 0,027 0,085 Kalsium 0,017 0,021 Besi 0,0018 0,0098 Mangan 0,006 0,0014 Seng 0,004 0,0058 Tembaga terdapat dalam jumlah kelumit 0,0004 Nitrat 0,010 tidak terdeteksi pH 6,3 7,9 *Pate (1975) dalam Salisbury dan Ross (1995).

Komposisi cairan floem sangat mudah berubah selama perjalanannya dari daun

menuju wadah penampung, misalnya buah atau umbi yang sedang berkembang.

Pada lupinus putih, Pate dkk. (1979 dalam Salisbury dan Ross, 1995) menemukan

bahwa cairan floem yang masuk ke dalam buah yang sedang berkembang

mengandung sukrosa lebih sedikit tetapi kaya dengan asam amino tertentu

daripada cairan floem yang diperoleh dari daun. Tampaknya, ketika cairan

melewati batang, sukrosa terurai saat berpindah ke jaringan (terhidrolisis), dan

asam amino dimuat ke dalam floem. Nisbah sukrosa terhadap asam amino juga

berubah sejalan dengan waktu.

Unsur hara anorganik dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)

(Schurr dan Schulze, 1995) seperti yang tertera dalam Tabel II.1 adalah kalium

dan magnesium. Kandungan unsur hara tersebut dalam cairan floem lebih tinggi

dibandingkan dalam cairan xilem. Namun sayangnya, kandungan tersebut masih

bersifat total unsur dan belum dibedakan menjadi beberapa spesi yang berbeda.

15

II.3 Analisis Spesiasi

Analisis spesiasi merupakan konsep baru dalam kimia analitik, yang

mengekspresikan bentuk kimia spesifik suatu unsur dalam suatu sampel yang

seharusnya dipandang secara individual dan tidak lagi hanya dalam jumlah total

unsur tersebut. Informasi tentang konsentrasi total suatu unsur tidaklah cukup

untuk menjelaskan mobilitas, ketersediaan, dan pengaruh unsur dalam sistem

ekologi atau organisme hidup. Oleh karena itu pengetahuan tentang spesi unsur

sangat diperlukan untuk memahami proses transformasi kimia dan biokimia,

bioavailability, esensial maupun sifat toksisitas unsur. Spesi unsur meliputi

tingkat oksidasi, bentuk organologam, komposisi isotop, maupun bentuk

persenyawaan atau pembentukan kompleks tertentu suatu unsur. Sebagai contoh,

dalam analisis spesiasi dapat dibedakan spesi arsen anorganik yang toksik dari

spesi arsenobetain yang relatif tidak toksik. Arsenobetain adalah salah satu

senyawa utama arsen dalam makanan dari laut (seafood) (Teräsahde dkk., 1996).

Contoh lain yang terkait dengan tingkat bilangan oksidasinya adalah spesi krom

(VI) yang bersifat racun sedangkan krom (III) merupakan spesi yang esensial.

II.4 Definisi Spesiasi Unsur

The International Union for Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Templeton,

dkk., 2000) telah mendefinisikan spesiasi unsur dalam kimia sebagai berikut:

1. Spesi kimia. Bentuk spesifik suatu unsur yang didefinisikan sebagai komposisi

isotop, keadaan oksidasi atau elektronik, dan atau struktur kompleks/molekul

tertentu.

2. Analisis spesiasi. Aktivitas analitik yang mengidentifikasi dan/atau mengukur

jumlah satu atau beberapa spesi kimia dalam suatu sampel.

3. Spesiasi unsur. Distribusi suatu unsur di antara spesi kimia tertentu dalam

suatu sistem.

4. Fraksinasi. Proses klasifikasi suatu analit atau sekelompok analit dari sampel

tertentu berdasarkan sifat fisika (seperti ukuran, kelarutan) maupun sifat kimia

( pengikatan, kereaktifan).

16

II.5 Pengambilan sampel

Prosedur pengambilan sampel dan preparasi sampel yang tepat merupakan salah

satu topik penting dalam analisis spesiasi, karena tanpa prosedur yang handal,

spesi yang diharapkan dapat mengalami perubahan selama proses analisis,

sehingga dapat mengakibatkan kesalahan dalam mengambil kesimpulan pada

akhirnya. Hal-hal yang dapat menyebabkan kesalahan pada tahap pengambilan

sampel adalah kontaminasi, sampel yang tidak representatif, proses pengawetan

sampel, pengendapan maupun pengaruh dinding tempat sampel. Alterasi dan

kesalahan yang terjadi selama tahap ini umumnya bersifat tidak dapat balik

(Caruso dkk., 2003).

Alterasi spesi merupakan masalah utama dalam tahap spesiasi dan preparasi

sampel. Metode ‘pembekuan’ (‘freezing’) komposisi spesi dengan khelat,

derivatisasi, atau fraksinasi haruslah dilakukan jika sampel tidak dapat diawetkan

dengan metode lain. Selain itu, reaksi kimia yang terjadi dalam proses ini haruslah

terdefinisi secara stoikiometri. Umumnya, metode ekstraksi dibutuhkan untuk

mengurangi resiko alterasi spesi dan untuk menghindari kontaminasi, tempat

sampel harus dibersihkan sebelumnya; menggunakan wadah yang mempunyai

efek dinding terhadap sampel rendah (‘low wall effects’); atau sampel disimpan

dalam wadah berisi gas inert untuk menghindari oksidasi. Kontaminasi juga dapat

berasal dari alat yang digunakan seperti skalpel atau alat logam lainnya, yang

dapat mempengaruhi hasil akhir atau mengubah spesi. Transformasi spesi dapat

juga disebabkan oleh aktivitas bakteri (Emons, 2003).

Penanganan sampel biologi umumnya meliputi proses filtrasi atau sentrifugasi

sampel segar yang diikuti dengan penyimpanan sementara pada -4°C dalam ruang

gelap. Teknik lain adalah pembekuan mendadak (shock-freezing) dan pengawetan

sebagai sampel beku atau liofilisasi dan penyimpanan sebagai sampel kering.

Umumnya, metode terakhir digunakan untuk sampel yang sangat stabil.

Penambahan pengawet bahan kimia, termasuk pengasaman sebaiknya dihindari

(Emons, 2003).

17

II.6 Metode Analisis Spesiasi

Seperti yang telah diuraikan pada sub bab I.1, Analisis spesiasi yang umum

digunakan adalah teknik gabungan (Needham dkk., 2005; Michalke, 2002; Caruso

dkk., 2003) yang terdiri dari metode pemisahan dan pendeteksian. Berikut akan

diuraikan beberapa metode pemisahan dan pendeteksian dalam analisis spesiasi.

II.6.1 Metode Pemisahan

Teknik pemisahan merupakan kunci utama dalam analisis spesiasi (Kuban dkk.,

2005). Beberapa detektor selektif unsur dengan kepekaan tinggi dapat

memberikan informasi tentang total unsur dengan cepat, namun tidak berarti

banyak jika tidak digabungkan dengan teknik pemisahan dimana berbagai spesi

telah didiferensiasi berdasarkan sifat fisika dan atau kimianya. Teknik pemisahan

yang umum digunakan dalam metode gabungan analisis spesiasi adalah

kromatografi cair, kromatografi gas, dan elektroforesis baik elektroforesis kapiler

maupun elektroforesis gel. Kromatografi cair merupakan teknik yang paling

banyak digunakan dalam analisis spesiasi (Pavlikova dkk., 2004).

Kromatografi cair (LC)

Pemisahan kromatografi cair dilakukan dengan memasukkan sampel ke dalam

kolom yang berisi fasa diam padat dimana fasa bergerak dipompakan ke dalam

kolom secara kontinyu. Awalnya fasa diam berupa larutan yang melapisi suatu

padatan pendukung, namun saat ini telah ada fasa diam yang terdiri dari silika

atau polimer termodifikasi. Analit dalam sampel akan berinteraksi dengan fasa

diam dan fasa bergerak selama melewati kolom. Setiap analit mempunyai

interaksi yang berbeda terhadap fasa diam dan fasa bergerak dan interaksi ini

mempengaruhi laju gerak analit dalam kolom. Pemisahan terjadi akibat berbedaan

interaksi tersebut dan setiap analit akan keluar dari kolom pada waktu yang

berbeda.

Kromatografi cair mempunyai beberapa keunggulan dibanding teknik pemisahan

lain yang menyebabkan teknik ini paling populer dalam analisis spesiasi.

Kromatografi cair dapat memisahkan senyawa non volatil, yang tidak dapat

18

dipisahkan dengan teknik kromatografi gas (GC); pemakaiannya sangat luas

karena baik fasa diam maupun fasa bergerak dapat dimodifikasi untuk

mendapatkan pemisahan yang optimal, dan berbagai jenis fasa diam sekarang

tersedia secara komersial. Selain itu, pemisahan dapat lebih dioptimalkan dengan

penambahan aditif terhadap fasa bergerak. Umumnya preparasi sampel juga tidak

rumit; dan saat ini sistem kromatografi cair telah dapat dihubungkan secara

langsung dengan teknik pendeteksian selektif unsur seperti ICP MS.

Polaritas relatif, kelarutan, dan berat molekul spesi yang diinginkan menentukan

tipe kromatogafi cair yang akan digunakan. Beberapa model kromatografi cair

yang dapat digunakan adalah kromatografi fasa normal dan fasa terbalik,

kromatografi pasangan ion-fasa terbalik, kromatografi eksklusi ukuran,

kromatografi misel, kromatografi pertukaran ion, dan kromatografi khiral (Ackley

dan Caruso, 2003; Caruso dkk., 2003; Lobinski, 1997; Michalke, 2002; Szpunar,

2000 ).

Kromatografi fasa normal (Normal phase chromatography, NPC).

Sistem kromatografi fasa normal terdiri dari fasa diam polar dan fasa bergerak

nonpolar seperti heksana. Silika atau alumina polar yang tidak termodifikasi

awalnya digunakan sebagai fasa diam, namun puncak yang dihasilkan terkadang

melebar dengan terbentuknya ekor (tailing) dan kedapat-ulangan (reproducibility)

waktu retensi sulit dicapai. Masalah ini dapat diminimalisasi dengan

menggunakan fasa diam yang berikatan dengan gugus fungsi polar seperti siano

dan diol. Dengan teknik ini, analit terpisahkan akibat teradsorpsi secara reversibel

oleh gugus fungsi polar fasa diam. Keunggulan utama NPC adalah

dimungkinkannya analit yang tidak larut dalam pelarut polar dapat dipisahkan.

Teknik ini telah diaplikasikan oleh Xu dan Lesage (1992 dalam Ackley dan

Caruso, 2003) untuk memisahkan vanadium dan nikel petroporfirin menggunakan

kolom aminopropil. Mekanisme pemisahan ditentukan oleh interaksi ikatan

hidrogen dan Van der Waals antara petroporfirin dan gugus amino dalam fasa

diam. Fasa bergerak yang digunakan terdiri dari campuran heksana, toluena, dan

dikhlorometan (Xu dan Lesage, 1992 dalam Ackley dan Caruso, 2003). Teknik ini

19

juga telah digunakan untuk memisahkan pestisida organotin. Kolom yang

digunakan berisi fasa diam silika yang berikatan dengan sianopropil. Setelah

melewati kolom, analit dikomplekskan lalu dideteksi menggunakan detektor

fluoresensi (Stäb dkk., 1992 dalam Ackley dan Caruso, 2003).

Kromatografi fasa terbalik (Reversed phase chromatography, RPC).

Metode RPC merupakan kebalikan NPC, yang memanfaatkan interaksi analit

dengan fasa diam nonpolar dan fasa bergerak polar. Medote ini umumnya

digunakan untuk memisahkan spesi nonpolar dan atau sedikit polar. Fasa bergerak

polar yang umum digunakan adalah air atau campuran air dengan pelarut organik

seperti metanol atau asetonitril. Fasa diam umumnya silika yang telah

termodifikasi. Gugus silanol-OH pada permukaan silika diganti dengan rantai

alkil menghasilkan fasa diam nonpolar. Alkil yang digunakan umumnya terdiri

dari 2, 8 atau 18 rantai karbon. Pemisahan berdasarkan sifat hidrofobik spesi,

dimana spesi yang paling hidrofobik terelusi paling akhir. Pemisahan dapat

dimodifikasi dengan berbagai variasi misalnya mengganti gugus fungsi fasa diam,

pH, kekuatan ion, aditif pada fasa bergerak maupun gradiensi kepolaran fasa

bergerak. pH merupakan faktor penting dalam RPC. Dalam beberapa kasus, pH

fasa bergerak menentukan apakah suatu senyawa terprotonasi atau tidak. Hal ini

mempengaruhi muatan analit dan retensinya dalam kolom. Fasa diam berbasis

silika tidak dapat berfungsi pada pH di bawah 2 dan di atas 7 karena terjadi

pemutusan atau hidrolisis fasa diam. Namun saat ini, telah tersedia fasa diam

berbasis silika termodifikasi yang tahan pada pH 2-10. Penggunaan teknik RPC

dalam analisis spesiasi misalnya pada pemisahan spesi organologam, studi

spesiasi platina dalam obat kemoterapi (Cairns, 1996 dalam Ackley dan Caruso,

2003), penentuan tellurium dalam air limbah, dan pemisahan senyawa organotin.

Zoorob dan Caruso (1997) dalam Ackley dan Caruso (2003) telah menggunakan

kolom berisi fasa diam oktadesil dan fasa bergerak yang terdiri dari 80% air dan

20% metanol untuk memisahkan spesi khrom dalam pewarna azo (Zoorob dan

Caruso, 1997 dalam Ackley dan Caruso, 2003).

20

Kromatografi pasangan ion fasa terbalik (Reversed phase ion pair

chromatography, IPC).

Teknik ini mempunyai kemampuan untuk memisahkan senyawa ionik dan non

ionik dengan cara penambahan pereaksi pasangan ion ke dalam fasa bergerak

polar. Pereaksi pasangan ion mempunyai gugus kepala polar dan ekor non polar,

seperti garam tetraalkilamonium, garam trietil-alkilamonium atau anion

alkilsulfonat. Pereaksi ini akan mengikat analit ionik dan membentuk pasangan

ion, yang kemudian akan tertahan oleh fasa diam sesuai dengan kenetralan

listriknya. Selektivitas analit dapat diatur dengan variasi komposisi fasa bergerak.

Teknik IPC telah digunakan untuk memisahkan spesi Pb(II), trietil timbal

khlorida, trifenil timbal khlorida, dan tetraetil timbal khlorida (Al-Rashdan dkk,

1992 dalam Ackley dan Caruso, 2003). Natrium pentana sulfonat digunakan

sebagai pereaksi pasangan ion. Pada konsentrasi 2 mM pasangan ion, puncak

timbal anorganik dan trietil timbal tumpang tindih secara signifikan. Pada

konsentrasi 8 mM pasangan ion, kedua puncak tersebut terpisahkan dengan baik.

Pemisahan ini dihubungkan dengan ICP MS untuk analisis material rujukan

standar bahan bakar yang mengandung timbal. Pemisahan ini menggambarkan

bagaimana metode IPC telah berhasil memisahkan spesi anorganik yang

bermuatan dan spesi organologam yang tidak bermuatan.

Kromatografi penukar ion (Ion exchange chromatography, IEC).

Prinsip IEC adalah kompetisi ion analit dan ion fasa bergerak bereaksi dengan ion

gugus fungsi fasa diam. Dengan IEC, baik anion maupun kation dapat dipisahkan

dengan menggunakan mode penukar kation atau penukar anion. Pada saat injeksi,

ion fasa bergerak bergabung dengan gugus fungsi ion lawan (counter-ion) fasa

diam dan muatan netral dipertahankan. Pada saat injeksi sampel, ion-ion analit

berkompetisi dengan ion dari fasa bergerak untuk berinteraksi dengan fasa diam.

Pemisahan ion analit terjadi jika spesi analit menggantikan ion fasa bergerak.

Perbedaan kekuatan ion dan interaksi dengan ion fasa diam, menyebabkan

terjadinya pemisahan spesi-spesi ionik dalam analit. Fasa diam biasanya terdiri

dari gugus amina kuarter atau sulfonat yang terikat pada silika atau polimer

21

polistirena-divinilbenzen. Sedangkan fasa bergerak yang umum digunakan adalah

larutan garam anorganik, seperti garam fosfat.

Metode IEC telah digunakan untuk memisahkan spesi arsen. Wang dkk.(1995

dalam Ackley dan Caruso, 2003), telah menggunakan kolom penukar anion untuk

memisahkan arsenat dan arsenit dalam ekstrak abu layang batu bara. Dalam

plasma, Ion Cl- dapat membentuk spesi Ar40Cl35 yang mempunyai massa 75 sama

seperti As. Oleh karena Metode ICP MS digunakan untuk pendeteksian selektif

unsur, maka ion Cl- yang dapat menginterferensi pengukuran As dipisahkan

sebelumnya.. Kolom penukar anion juga telah digunakan untuk memisahkan spesi

arsen dalam tanah dan ekstrak ikan, pada pemisahan bromat dan bromit dalam air

minum, pemisahan spesi Sb anorganik dan organik, dan pemisahan spesi Cr(III)

dan Cr(VI). Kromatografi penukar kation juga telah diaplikasikan dalam analisis

spesiasi. Suyani dkk. (1989) dalam Ackley dan Caruso (2003) telah menggunakan

kromatografi penukar kation untuk memisahkan trimetiltin khlorida, tributiltil

khlorida, dan trifeniltin asetat. Pada kasus lain, kolom penukar kation dan penukar

anion dihubungkan secara seri sehingga dimungkinkan penentuan spesi kation dan

anion. Teräsahde dkk. (1996) telah berhasil memisahkan 6 spesi arsen dengan

menggunakan metode ini. Elusi bergradien digunakan dan kekuatan ion fasa

bergerak ditingkatkan serta pH diturunkan selama proses pemisahan. Fasa

bergerak yang diaplikasikan terdiri dari asam nitrat, air dan buffer karbonat.

Keunggulan IEC adalah penggunaan larutan buffer dalam media air, sehingga

sangat sesuai dengan teknik pendeteksian unsur seperti ICP MS. selain itu, IEC

juga dimanfaatkan dalam analisis spesiasi untuk tujuan pemurnian sampel dan

prekonsentrasi sampel (Ackley dan Caruso, 2003).

Kromatografi eksklusi ukuran (Size exclusion chromatography, SEC).

Teknik SEC memisahkan analit berdasarkan ukuran berat molekulnya.

Mekanisme pemisahan tidak berdasarkan interaksi kimia seperti metode

kromatografi cair lainnya, melainkan berdasarkan kemampuan suatu analit

berpenetrasi ke dalam pori fasa diam. Prinsipnya, analit akan berdifusi melewati

fasa diam yang berpori. Molekul yang lebih besar dari ukuran pori fasa diam tidak

22

tertahan oleh fasa diam dan terelusi keluar dari kolom pertama kali. Sedangkan

molekul yang lebih kecil akan berpenetrasi ke dalam pori fasa diam, sehingga

tertahan oleh kolom tergantung dari ukuran molekulnya. Fasa bergerak tidak

berperanan penting dalam proses pemisahan dan biasanya dipilih berdasarkan

kemampuan untuk melarutkan analit yang akan difraksinasi. Metode SEC dapat

dikelompokkan menjadi dua bagian yaitu kromatografi permeasi gel (Gel

permeation chromatography, GPC) yang mengacu pada pemisahan makromolekul

yang larut dalam air dan kromatografi filtrasi gel (Gel filtration chromatography,

GFC) untuk pemisahan makromolekul yang larut dalam pelarut organik. Sistem

SEC harus dikalibrasi dengan penanda berat molekul yang mempunyai sifat fisika

yang mirip dengan analit yang akan dianalisis. Penggunaan SEC dalam analisis

spesiasi antara lain pemisahan metalloprotein (Mason dkk., 1990; Dean dkk.,

1987) dan metabolit obat yang mengandung logam (Matz, 1989 dalam Ackley dan

Caruso, 2003). Metode SEC dapat juga digunakan memisahkan analit dari

senyawaan bermolekul rendah dalam matriks sampel, contoh kasus untuk

memisahkan protein yang mengikat tembaga dalam serum dari ion natrium dan

fosfat yang dapat mengganggu pendeteksian Cu dengan ICP MS (Lyon dan Fell,

1990 dalam Ackley dan Caruso, 2003). Penggabungan SEC dengan ICP MS

merupakan teknik yang sangat populer sebagai tahap pertama pemisahan spesiasi.

Pemisahan lebih lanjut dapat dilakukan dengan metode lain seperti elektroforesis.

Encinar dkk. (2003) telah mengidentifikasi protein yang mengandung Se dalam

ragi terselenisasi dengan menggunakan LC gabungan SEC dan RPC dan

pendeteksian dengan ICP MS, MALDI TOF dan ESI Q-TOF MS. Mihucz dkk.

(2001) telah mengkarakterisasi cairan xilem timun yang terkontaminasi nikel

dengan menggunakan HPLC eksklusi ukuran dan fasa terbalik. Pendeteksian

dilakukan dengan metode spektrometri fluoresensi sinar X refleksi total (Total-

reflection X-ray fluorescence spectrometry, TXRFS).

Kromatografi cair khiral (Chiral liquid chromatography, CLC).

Molekul khiral mempunyai stereoisomer yang merupakan bayangan cermin satu

sama lainnya. Tipe stereoisomer ini biasa disebut enantiomer. Molekul khiral

umumnya mempunyai atom karbon tetrahedral dengan 4 gugus yang berbeda

23

yang terikat padanya. Namun suatu molekul dapat juga disebut molekul khiral

walaupun tidak memiliki atom karbon asimetri jika stereoisomernya merupakan

bayangan cermin satu sama lain, contohnya 2,3-pentadiena (March, 1992; Loudo,

1995). Saat ini, pemisahan khiral merupakan hal yang penting dalam

farmaseutikal disebabkan sistem biologis cenderung merupakan sistem khiral

dimana satu enantiomer suatu obat mempunyai efek biologis in vivo yang berbeda

dengan pasangan khiralnya. Beberapa strategi telah ditempuh untuk pemisahan

khiral misalnya penggunaan fasa diam khiral, gugus derivat khiral untuk

membentuk diasteriomers, dan penggunaan aditif fasa bergerak khiral. Teknik

CLC memanfaatkan enantiomer yang mungkin muncul dari suatu atom C khiral

analit. Pemisahan isomer optik ini terjadi dengan pembentukan diasteriomer atau

diasteriomer temporer tergantung teknik khiral spesifik yang digunakan.

Khromatografi khiral pertama kali digunakan dalam analisis spesiasi untuk

memisahkan asam selenoamino khiral. Mendez dkk., 1998 (dalam Ackley dan

Caruso, 2003) telah memisahkan enantiomer selenomethionin menggunakan

kolom ß-siklodekstrin. O-ftalaldehid dan 2,3-naftalenedikarboksaldehid

merupakan pereaksi penderivat fluoroiongenik yang digunakan untuk

menderivatisasi enantiomer selenomethionin sebelum pemisahan. Pendeteksian

fluorimetri dan hibrid generasi ICP MS digunakan untuk mendeteksi enantiomer

yang telah dipisahkan. Asam selenoamino khiral juga telah dipisahkan dengan

menggunakan fasa diam eter mahkota khiral.

Kromatografi gas (GC)

Kromatografi gas merupakan teknik partisi dimana pemisahan dipengaruhi oleh

kemampuan analit dalam bentuk gas yang berinteraksi dengan fasa diam cair.

Kombinasi GC dengan pendeteksian spesifik unsur merupakan metode yang baik

untuk spesiasi organologam dalam sampel lingkungan yang kompleks (Szpunar

dkk., 2000; Alonso dan Encinar, 2003). Feldmann dkk., 1993 (dalam Alonso dan

Encinar, 2003) telah mengidentifikasi spesi volatil seperti dimetil merkuri

(Me2Hg), dimetilselen (Me2Se), tetrametiltin (Me4Sn), trimetilantimon (Me3Sb),

trimetilbismut (Me3Bi), arsin termetilasi (MexAsHy, x + y = 3), dimetiltellurium

(Me2Te), senyawaan timbal tertetraalkilasi (EtxMeyPb, x + y = 4) dalam limbah

24

gas buangan. Sebagian besar spesi ini merupakan bahan B3 dan keberadaannya

dalam sampel belum tuntas dibahas. Sayangnya, analisis kuantitatif spesi ini

sangat sulit karena masih kurangnya material rujukan tersertifikasi untuk spesi

tersebut. Oleh karena itu, Feldmann dkk., 1993 (dalam Alonso dan Encinar, 2003)

mengembangkan metode semikuantitatif dengan cara penambahan air yang

terkabutkan pada akhir kolom GC dengan tujuan untuk memperoleh respon yang

sama unsur tersebut dari senyawa volatil dan larutan standar dalam media air.

Elektroforesis gel (Gel electrophoresis,GE)

Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan makromolekul bermuatan

dimana logam atau semilogam terikat, baik secara kovalen maupun tidak. Selain

protein, makromolekul seperti DNA dan asam humat dapat dipisahkan dengan

metode ini. Dalam medan listrik, molekul bermuatan atau kompleks akan

bergerak ke elektroda yang muatannya berlawanan. Jika tegangan V diaplikasikan

antara dua elektroda yang berjarak L, medan E akan muncul sesuai dengan

persamaan II.1. laju migrasi, ν suatu partikel dalam medan setara dengan

mobilitas (µ) partikel dan kekuatan medan E (persamaan II.2), dimana µ

merupakan parameter intrinsik partikel.

E = V/L (II.1)

ν = µ E (II.2)

Satuan yang digunakan dalam elektroforesis adalah volt jam (V h), yang

proporsional dengan perpindahan (d) partikel. Dengan demikian laju ν menjadi

d/t dan dengan penggabungan Persamaan II.1 dan II.2 diperoleh:

d = ν t = (µ/L) V t (II.3)

Migrasi terjadi dalam media cair, yaitu buffer, yang merupakan hal penting dalam

pemisahan terutama untuk mempertahankan kestabilan ikatan logam dengan

makromolekul .

25

Gel merupakan parameter kedua untuk mendapatkan pemisahan yang baik. Hal

ini menentukan pendekatan pertama bagaimana mekanisme pemisahan terjadi.

Saat ini tersedia berbagai gel, namun yang paling umum digunakan adalah

agarosa dan poliakrilamid. Agarosa biasanya digunakan untuk partikel berukuran

diameter besar dari 10 nm seperti DNA atau RNA sedangkan gel poliakrilamid

untuk protein. Polimer ini diperoleh dari kopolimerisasi akrilamid dan suatu

gugus ikatan silang, seperti N,N’-metilenebisakrilamid, yang menghasilkan

struktur tiga dimensi pada gel. Ukuran pori ditentukan oleh dua parameter C dan

T yang dinyatakan dalam satuan persen. T menyatakan massa akrilamid

pervolume gel dan C adalah persen gugus ikatan silang dalam gel. Jika T

meningkat maka ukuran pori menurun karena semakin banyak polimer pervolume

semakin sedikit volume ruang kosong.

Ada dua tipe elektroforesis gel yang biasa digunakan yaitu: (1) elektroforesis

nativ (nondenaturasi) satu dimensi dan (2) elektroforesis 2-dimensi (Chery, 2003).

Berikut akan dijelaskan kedua metode tersebut.

Elektroforesis nativ/nondenaturasi (Nondenaturing electrophoresis).

Walaupun elektroforesis satu dimensi tidak selalu berarti metode nondenaturasi,

asosiasi ini umum dengan alasan penyederhanaan. Hal ini disebabkan karena

sampai saat ini, elektroforesis nativ umumnya adalah metode elektroforesis satu

dimensi. Kastenholz (2004; 2006), telah mengembangkan metode elektroforesis

poliakrilamid nativ preparatif untuk analisis spesi Cd berberat molekul tinggi

(High molecular mass cadmium species, HMM-Cd-Sp) dalam Arabidopsis dan

sayuran. Sistem buffer yang digunakan adalah 20 mM Tris-HCl/ 1 mM NaN3 pH

10,0. Derajat polimerisasi poliakrilamid 4% T dan 2,67 % C, dan panjang gel 40

mm. Adapun pelarut yang digunakan adalah 20 mM Tris-HCl/ 1 mM NaN3 pH

8,0. Pendeteksian selektif unsur dilakukan dengan ICP MS.

Elektroforesis dua dimensi ((Two-dimensional gel electrophoresis, 2DE).

Teknik 2DE sangat berkembang dan populer saat ini karena teknik ini dapat

memetakan hampir semua protein yang ada dalam sampel. Untuk analisis spesiasi,

26

2DE dapat diterapkan jika logam yang diteliti berikatan kovalen, karena

umumnya metode ini adalah metode denaturasi. Metode 2DE nondenaturasi juga

telah dikembangkan namun aplikasinya masih sangat terbatas. Ada dua

mekanisme pemisahan 2DE yaitu: (1) isoelectric focusing (IEF) dan sodium

dodesil sulfat- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE). Pemisahan ini

berdasarkan pI pada tahap pertama dan berdasarkan ukuran pada tahap kedua.

Aplikasi metode 2DE dalam analisis spesiasi contohnya adalah pemisahan ekstrak

ragi yang diperkaya dengan Se. Radiotracer 75Se digunakan untuk memungkinkan

pendeteksian dengan teknologi screen fosfor (Chery dkk., 2001 dalam Chery,

2003). Kunci utama pemisahan ini adalah menghindari oksidasi asam

selenoamino dengan cara derivatisasi kimiawi. Tanpa proses ini, spesi tersebut

tidak stabil selama proses elektroforesis. Setelah pemisahan, protein dan protein

yang mengandung selen dideteksi dengan screen fosfor selama sepekan. Setelah

pendeteksian unsur runut, gel diberi penanda perak (silver-stained) dan 2 gambar,

yaitu autoradiogram dan penandaan perak dapat dibandingkan.

Elektroforesis kapiler (Capillary electrophoresis, CE)

Elektroforesis kapiler merupakan suatu teknik pemisahan yang cepat, beresolusi

tinggi, mempunyai kemampuan untuk memisahkan beragam analit mulai dari

biomolekul besar sampai ion anorganik sederhana. Metode ini juga dapat

memisahkan ion positif, negative dan molekul netral dalam satu eksperimen

dengan tingkat efesiensi pemisahan tinggi. Keunggulan lain jika dibandingkan

dengan metode kromatografi cair, volume sampel yang dibutuhkan dalam satuan

nanoliter (10-6 cm3), penggunaan pereaksi sedikit, dan harga kolom kapiler yang

relatif murah.

Prinsip pemisahan CE berdasarkan perbedaan mobilitas analit yang tergerak

secara elektrik. Dalam hal ini medan listrik diaplikasikan sepanjang kolom kapiler

pada tegangan tinggi biasanya antara 15-30 kV pada elektroda positif atau negatif.

Pemisahan analit terjadi sebagai hasil dari pengaruh aliran elektroosmotik

(electroosmotic flow = EOF) dan aliran elektroforetik (electrophoretic flow). Hal

27

tersebut menyebabkan waktu analisis jauh lebih singkat dan efisiensi pemisahan

sangat tinggi, yaitu sekitar 200.000 – 700.000 plat teoritis.

Selain itu, metode CE tidak membutuhkan fasa diam. Molekul-molekul bergerak

berdasarkan perbedaan lajunya dalam medan listrik. Batas pita analit tidak

menampilkan profil laminar, melainkan pita tajam vertikal. Hal ini menambah

resolusi dan rasio sinyal – noise sehingga menambah sensitivitas detektor.

Resolusi pemisahan dapat dipertinggi dengan memvariasikan elektrolit, pH, dan

penggunaan modifiers (Michalke, 2003a).

Aplikasi metode CE dalam analisis spesiasi antara lain analisis kestabilan spesi

yang mengandung Pt dalam sampel tanah (Michalke dkk., 1997); Karakterisasi

kompleks logam dengan metallothionein menggunakan CE dengan pendeteksian

selektif unsur ICP MS dan pendeteksian struktur molekul ESI MS (Mounicou

dkk., 2000); Spesiasi arsen dengan pendeteksian UV tak langsung (Lin dkk.,

1995); Spesiasi multiunsur juga telah dilakukan oleh Costa-fernandez dkk. (2000)

menggunakan CE – ICP MS. Pemisahan elektroforesis campuran spesi anionik

dan kompleks metal sianida bermuatan negatif dicapai dengan menggunakan

kapiler poliakrilamid terlapis. Pemisahan tiga spesi arsen dan dua kompleks Co-

sianida berlangsung kurang dari 70 detik. Pemisahan ini berlangsung dengan baik

walaupun dalam sampel terdapat anion lain dan kompleks sianida dari logam

Cu(II), Cr(VI), Ni(II), dan V(V). Pendeteksian selektif unsur secara simultan

dilakukan dengan metode ICP TOF MS.

II.6.2 Metode Pendeteksian

Detektor selektif unsur

Pendeteksian selektif-unsur pada pemisahan kromatografi menggunakan metode

spektrometri atom menjanjikan selektifitas dan kemampuan deteksi yang tinggi.

Batas deteksi teknik ini memungkinkan sampai tingkat nanogram sampai

femtogram. Keunggulan lain, pendeteksian selektif unsur memungkinkan

tumpang tindih dua atau lebih spesi dapat dipisahkan yang oleh metode

28

kromatografi tidak dapat dipisahkan. Sebagai contoh dua peak kromatografi Se

dan As yang tumpang tindih dapat dipisahkan oleh spektrometri massa (Caruso,

dkk. 2003).

Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP MS)

Teknik ICP MS merupakan metode pendeteksian unsur yang sangat handal dan

serbaguna untuk penentuan unsur (ultra) runut, dimana hal ini disebabkan ICP MS

mempunyai banyak keunggulan dibandingkan metode pendeteksian selektif unsur

lain seperti AAS, AES dan AFS. Keunggulan tersebut antara lain: batas deteksi

yang sangat rendah dengan sensitivitas tinggi, range konsentrasi analit yang dapat

diukur cukup luas yaitu orde ppm sampai ppt, kemampuan analisis multi unsur,

spektranya sederhana dan dapat digunakan untuk analisis isotop.

Umumnya sampel ICP MS berupa larutan dalam air. Dalam ICP MS, larutan

sampel diubah menjadi aerosol. Partikel yang lebih besar (d >10 µm) akan

terseleksi dari aerosol untuk mencegah terjadinya ketidak stabilan plasma dan

untuk mendapatkan atomisasi dan ionisasi yang efektif. Kemudian aerosol dibawa

oleh gas argon ke plasma, yaitu nyala listrik yang sangat panas (temperatur

plasma sekitar 7500 K). Selama di plasma, partikel aerosol terdesolvasi dan

molekul sampel terdisosiasi menjadi atom gas, yang kemudian tereksitasi dan

terionisasi. Efisiensi ionisasi dalam plasma argon lebih dari 90 % untuk sebagian

besar unsur, bahkan unsur-unsur seperti As, Se, S, atau Cl yang mempunyai

potensial ionisasi pertama yang tinggi dapat terionisasi dengan baik. Bagan alat

ICP MS dapat dilihat pada Gambar II.2.

29

Gambar II.3 Bagan Alat ICP MS.

Penganalisis massa (mass spectrometer, MS) yang umum digunakan pada ICP

MS adalah filter quadrupole. Saat ini, dikembangkan juga MS lain seperti sektor

magnet (magnetic sector), pemfokusan ganda (double-focusing sector field), time-

of-flight atau ion trap. Namun demikian, sebagian besar ICP MS yang berfungsi

di seluruh dunia masih menggunakan filter quadrupole. Perbedaan antar MS

tersebut adalah resolusi dan waktu scanning. Resolusi (R) suatu penganalisa

massa didefinisikan sebagai,

R = m/Δm (II.4)

Dimana, m adalah massa nominal dan Δm adalah perbedaan massa yang dapat

dipisahkan.

Filter quadrupole terdiri dari 4 batang silindris, seperti yang diilustrasikan pada

Gambar II.3. Prinsip kerjanya adalah sebagai filter massa dan hanya meneruskan

ion-ion dengan rasio massa/muatan tertentu melewati celah (`jendela`) massa yang

sempit (sekitar 1 u). Dengan mengubah tegangan yang diaplikasikan terhadap

batang quadrupole, posisi celah massa dapat diseleksi. Analisis massa dapat

Detektor ion

Ion optikAlat pemisah

massa

Pompa

molekular

Pompa

molekular

Ruang semprot

pengabut

Sumber

arus RF

Antarmuka MS

Pompa

mekanik

Torch ICP

Detektor ion

Ion optikAlat pemisah

massa

Pompa

molekular

Pompa

molekular

Ruang semprot

pengabut

Sumber

arus RF

Antarmuka MS

Pompa

mekanik

Torch ICP

Detektor ion

Ion optikAlat pemisah

massa

Pompa

molekular

Pompa

molekular

Ruang semprot

pengabut

Sumber

arus RF

Antarmuka MS

Pompa

mekanik

Torch ICP

30

dilakukan dengan metode scanning, memilih daerah massa tertentu sesuai dengan

analit yang diukur maupun dengan mengamati intensitas sinyal analit.

Gambar II.4 Penganalisis massa quadrupole

Penganalisis massa sektor magnet digunakan juga dalam ICP MS. Prinsip kerja

alat ini berdasarkan pembelokan ion dalam medan magnet. Ion-ion dengan m/z

tertentu diteruskan menuju detektor sedangkan yang lain akan dibelokkan. Alat

fokus ganda juga digunakan dalam ICP MS. Pada alat ini, berkas ion melewati

medan listrik terlebih dahulu baru memasuki medan magnet. Prinsipnya adalah

medan elektrostatik memfokuskan berkas ion yang mempunyai rentang energi

kinetik sempit melewati suatu celah menuju medan magnet. Resolusi alat ini dapat

mencapai 10.000 lebih besar dari filter quadrupole.

Penganalisis massa yang lain adalah time of flight (TOF MS). Prinsip kerja alat ini

adalah ion-ion ditarik dengan sangat cepat melewati daerah bebas medan listrik

dan magnet dengan energi kinetik yang identik. Waktu yang dibutuhkan oleh ion

untuk mencapai detektor berbending terbalik dengan massa ion. Ion dengan m/z

rendah akan mencapai detektor lebih cepat dibandingkan dengan ion dengan m/z

besar. Setiap nilai m/z kemudian dideteksi.

Pendeteksi ion yang umum digunakan dalam ICP MS adalah pengganda elektron.

Ada dua tipe pengganda elektron, yaitu pengganda elektron diskrit dan kontinu.

Pada detektor pengganda elektron diskrit elektron menubruk katoda sehingga

31

dilepaskan elektron sekunder. Elektron yang dilepaskan tersebut tertangkap oleh

dinoda yang mempunyai tegangan positif lebih tinggi. Adapun detektor

pengganda elektron kontinu terdiri dari gelas yang didoping dengan timbal. Pada

alat ini potensial sebesar 1,8 – 2,0 kV dilewatkan sepanjang detektor. Ion-ion

yang menubruk permukaan gelas, yang menolak elektron yang melewati

sepanjang permukaan bagian dalam gelas, akan menolak elektron lebih banyak

untuk setiap tubrukan (Skoog dkk., 2004).

Detektor ICP MS Perkin Elmer 6100 yang digunakan dalam penelitian ini

menggunakan 21 dinoda, sehingga dapat menggandakan sinyal hingga faktor 107.

Selain itu, detektor ini mempunyai keunggulan efisiensi konversi yang tinggi,

waktu pakai lama, dan didisain dua tahap, yaitu tahap analog untuk ion dengan

intensitas tinggi dan tahap pulsa untuk intensitas rendah, dimana sinyal analog dan

pulsa dapat diukur secara simultan.

Aplikasi ICP MS untuk analisis spesiasi

ICP MS telah banyak digunakan dalam analisis spesiasi sebagai detektor spesifik

unsur (Gasparics dkk., 2002; Rosen dan Hieftje, 2004; Szpunar, 2005). Beberapa

publikasi spesiasi arsen (As) dilaporkan menggunakan teknik HPLC-ICP MS

(Teräsahde, dkk., 1996; B'Hymer dan Caruso, 2004). Bahkan sejak 1993, Larsen

(1993) telah menggunakan teknik HPLC-ICP MS untuk menentukan 8 spesi As

dalam urin manusia. Pada fasa awal, dimetilarsinat (DMA), As (III),

monometilarsonat (MMA) dan As (V) dapat dipisahkan menggunakan resin

penukar anion. Pada fasa kedua, arsenobetain (AsB), oksida trimetilarsin

(TMAO), arsenokolin (AsC), dan ion tetrametilarsonium (TMAs) dipisahkan dari

spesi bermuatan negatif menggunakan resin penukar kation (Vanhaecke dan

Köllensperger, 2003).

Saat ini, studi HPLC-ICP MS banyak dilakukan untuk elusidasi mekanisme

biotransformasi ion logam anorganik dan spesi anorganik sederhana, terutama

untuk identifikasi kompleks logam-ligan dalam sampel biologis, seperti

metalloprotein, pengkompleksan unsur runut dalam darah dan plasma darah, dan

32

selenoprotein dalam jaringan tubuh manusia dan hewan (Matsuara dkk., 2003;

Encinar dkk., 2004; Szpunar, 2000; 2005; Bresson dkk., 2005).

Teknik gabungan LC-ICP MS yang paling berkembang dalam analisis spesiasi

adalah SEC-ICP MS (Koplik dkk., 2002; Michalke, 2002). Contohnya studi

tentang metalloprotein (Mason dkk., 1990), spesiasi Cd dalam sayuran yang

terkontaminasi (Ji, 1997), metabolit Pt dalam tanaman (Klueppel dkk., 1998),

spesiasi Cd dalam jaringan tanaman (Vacchina dkk., 1999), spesiasi multi unsur

dalam teh hitam (Matsuura dkk., 2001), dan spesiasi iod dalam susu (Sanchez dan

Szpunar, 1999). Sanchez dan Szpunar menggunakan buffer Tris 30 mM sebagai

fasa bergerak dan fasa diam superdex-75 dan superdex-200. Spesi iod dalam

sampel susu sapi dan kambing serta susu formula bayi terelusi dalam waktu 40

menit dan langsung on-line dideteksi dengan ICP MS.

Gabungan HPLC penukar anion dengan ICP MS pengenceran isotop (isotope

dilution ICP MS) juga telah diaplikasikan oleh Rodriguez-Cea dkk. (2003) untuk

analisis metallothionein (MT) dalam belut (Anguilla anguilla). Belut dimasukkan

dalam aquarium yang mengandung 100 µg/L Cd selama tiga pekan. Pemisahan

tahap I isoform MT dilakukan dengan menggunakan SEC untuk memfraksinasi

citosol hati belut yang kemudian dipisahkan lebih lanjut dengan HPLC penukar

anion untuk protein (anion exchange fast protein liquid chromatography, AE-

FPLC). Setelah proses pemisahan, larutan yang mengandung isotop 111Cd, 65Cu,

dan 67Zn dipompakan pada ujung kolom AEC dan ratio 114Cd/111Cd, 63Cu/65Cu,

dan 64Zn/67Zn dimonitor secara on-line menggunakan ICP QMS.

Aplikasi GC-ICP MS umumnya digunakan untuk penentuan senyawa

organologam Sn, Hg, dan Pb dalam matriks lingkungan (Vanhaecke dan

Köllensperger, 2003). Grüter dkk. (2000, dalam Alonso dan Encinar, 2003) telah

membuktikan keunggulan teknik GC-ICP MS untuk menentukan spesi

organologam As, Bi, Ge, Hg, I, Mo, Pb, Sb, Se, Sn, Te dan W dengan batas

deteksi di bawah 1 pikogram. Derivatisasi dilakukan dengan generator hibrid, dan

spesi volatil ditampung dalam cryogenic trap. Pemanasan trap secara perlahan

33

dari -196 sampai 150°C yang diikuti pengaliran analit ke dalam kolom GC

memungkinkan pemisahan spesi unsur secara sempurna.

Aplikasi teknik elektroforesis gel dan ablasi laser ICP MS (laser ablation ICP

MS, LA ICP MS) telah dilakukan oleh Binet dkk. (2003) untuk deteksi dan

karakterisasi protein yang mengikat Zn dan Cd dalam Escherichia coli. Teknik

yang sama juga telah diaplikasikan oleh kelompok spesiasi Pusat Penelitian

Jülich, Jerman untuk mendeteksi fosfor dan beberapa logam dalam protein otak

manusia ( Becker dkk., 2003; Becker, 2004).

Teknik gabungan CE-ICP MS juga telah dikembangkan dalam analisis spesiasi

(Costa-fernandez dkk., 2000; Llamas dkk., 2001; Lobinsky, 2001; Sonke dan

Salters, 2004). Contoh aplikasi CE-ICP MS adalah elusidasi spesi Se dalam serum

manusia dan air susu ibu (Michalke dan Schramel, 1998), spesiasi Cd (Llamas

dkk., 2001), spesiasi Sb dalam sampel lingkungan (Michalke dan Schramel,

1999), spesiasi Mn (Michalke, 2004), serta spesiasi Cr dan Co (Carbonaro dan

Stone, 2005).

Pemisahan multidimensional dalam analisis spesiasi juga telah banyak

diaplikasikan dalam mempelajari spesi suatu unsur. Kelompok peneliti dari

Institut Kimia Analitik Bio-Anorganik, Pau, Prancis telah melakukan analisis

spesiasi nikel dalam getah pohon hiperakumulasi Sebertia acuminata dengan

menggunakan HPLC dan CZE dan pendeteksian ICP MS dan ESI MS/MS

(Schaumlöffel dkk., 2003). Pertama getah pohon dilarutkan dalam air. Kemudian,

dua metode pemisahan yaitu SEC dan CZE dilakukan untuk mengisolasi

kompleks Ni. Kolom yang digunakan pada SEC adalah Superdex peptida HR

10/30 dengan range pemisahan antara 100 – 7000 Da. Fasa bergerak adalah 5 mM

buffer amonium asetat pH 6,8. analit yang terelusi dideteksi dengan detektor UV

dan ICP MS. Metode CZE diaplikasikan sebagai komplementer pemisahan

sebelumnya untuk membuktikan keberadaan nikel sitrat. Kompleks nikel tersebut

dianalisis lebih lanjut menggunakan ESI MS untuk menentukan struktur

molekulnya. Sebagai hasil penelitian, gabungan teknik ini telah berhasil

34

mengisolasi 6 spesi Ni. Selain itu, diperoleh juga informasi bahwa kompleks Ni

dengan berat molekul 360 diduga mengandung 3 gugus karboksil dan satu gugus

amino.

II.7 Validasi Metode Analisis

Kontrol kualitas dan validasi metode analisis yang digunakan merupakan bagian

esensial dalam analisis spesiasi. Validasi metode tersebut meliputi proses

pengambilan sampel, penanganan dan efek matriks sampel, proses kalibrasi dan

penambahan standar, estimasi presisi, batas deteksi dan penggunaan standar

material rujukan jika memungkinkan (Thompson dkk., 2002). Sampai saat ini

belum ada standar material untuk cairan floem, sehingga standar material yang

digunakan hanyalah dari bagian lain tanaman seperti daun dan ranting.

Untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan antara total Mg, Ca, Mn,

Zn, Mo, dan Cd dalam sampel rujukan standar menggunakan metoda destruksi

microwave tertutup dan pendeteksian selektif unsur ICP-QMS yang

dikembangkan dengan nilai tersertifikasi sampel rujukan standar dilakukan uji

statistik T-tes satu sampel. Prosedur T-tes satu sampel menguji apakah rata-rata

sampel dari satu variabel X berbeda dari suatu konstanta tertentu 0μ . Sampel

harus diambil secara acak dan data berdistribusi normal (Bhattacharya dan

Johnson, 1977; Moore, 1995; Moore dan McCabe, 1998). Langkah-langkah dalam

pengujian satu sampel t-test adalah (1) merumuskan hipotesis, (2) menentukan

tingkat signifikansi alpha ( )α ; (3) Menghitung uji statistik, (4) Menentukan nilai

tabelt (output komputer), dan (5) mengambil kesimpulan.