pemurnian dan karakterisasi mananase dari

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI MANANASE DARI Streptacidiphilus luteoalbus

HERMAWAN SEFTIONO

PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2008

ABSTRAK

HERMAWAN SEFTIONO. Pemurnian dan Karakterisasi Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan YOPI.

Komponen utama hemiselulosa adalah hetero -1,4-D-xilan dan hetero -1,4-D-manan. Manan sebagai komponen hemiselulosa dikelompokkan menjadi

4 subfamili yaitu -manan, galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan. -mananase menghidrolisis -1,4-D-manopiranosil dalam rangka utama polimer

manan yang kemudian menghasilkan rantai pendek manooligosakarida. Manan yang telah didegradasi oleh mananase bermanfaat dalam beberapa proses diantaranya dalam bidang farmasi, pangan, pakan, termasuk dalam bubur kertas, dan industri kertas. Penelitian ini bertujuan melakukan pemurnian dan karakterisasi mananase ekstraseluler dari Streptacidiphilus luteoalbus. Hasil percobaan menunjukkan bahwa Streptacidiphilus luteoalbus memproduksi enzim mananase dengan indeks manolitik 4. Waktu produksi optimum mananase pada jam ke-69 dengan aktivitas sebesar 0.2168 U/ml. Mananase ekstraseluler dari Streptacidiphilus luteoalbus yang telah dimurnikan memiliki aktivitas optimum yaitu pada suhu 50 °C dan pH 6.5. Pemurnian mananase dengan aseton 70% dan dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel sephadex G-75 menghasilkan aktivitas spesifik masing-masing sebesar 0.10 U/mg dan 0.19 U/mg, serta kemurniannya meningkat 2.8 kali dibandingkan dengan ekstrak kasarnya. Hasil penentuan berat molekul setelah dimurnikan dengan filtrasi gel diperoleh dua pita dengan bobot molekul 120.06 kD dan 81.24 kD.

ABSTRACT

HERMAWAN SEFTIONO. Purification and Characterization of Mannanase from Streptacidiphilus luteoalbus. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and YOPI.

The major constituents of hemicelluloses are hetero ß-1,4-D-xylan and hetero ß-1,4-D-mannan. Mannan as a major component from hemicelluloses was constituted in four subfamilies such as ß-mannan, galactoglucomannan, galactomannan, and glucomannan. ß-1,4-D-manopiranosil which is inside the main of mannan structure was hydrolyzed by ß-mannanase enzyme, produced short chain of mannooligosaccharides. Mannan which have been degraded by mannanase enzyme have various function in pharmaceutical process, food, feed, include pulp, and paper industries. This research have focused on purification and characterization of extracellular mannanase enzyme from Steptacidiphilus luteoalbus. The result shown that Steptacidiphilus luteoalbus was producing mananase enzyme with mannolitic index of 4.0. Optimum time to produce mannanase was on 69 hour of incubation with the activity was 0.2168 U/ml. Purifed extracelluler mananase of Steptacidiphilus luteoalbus had an optimum activity at temperature 50 °C and pH 6.5. Mananase purification with 70% acetone continued with gel filtration chromatography (sephadex G-75), produced specific activity 0.10 U/mg and 0.19 U/mg, and it is purity rate increased until 2.8 fold compare with former crude extract. The molecular weight of two bands after purified with gel filtration were 120.06 kD and 81.24 kD.

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI MANANASE DARI

Streptacidiphilus luteoalbus

HERMAWAN SEFTIONO

Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2008

Judul Skripsi : Pemurnian dan Karakterisasi Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus Nama : Hermawan Seftiono NIM : G44104016

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S

Dr. Yopi

Ketua Anggota

Diketahui

Dr. drh. Hasim, DEA

Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Tanggal Lulus :

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilaksanakan dari bulan februari 2008 sampai juli 2008 di Laboratorium Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong dengan Judul Pemurnian dan Karakterisasi Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Laksmi Ambarsari, M.S selaku pembimbing pertama atas segala bimbingan dan arahan dan Bapak Dr. Yopi selaku pembimbing kedua atas segala bimbingan, arahan, dan fasilitas selama penelitian. Ucapan terima kasih yang tak terhingga kepada Ayahanda Yusuf Herman widyalesmana (alm), Ibunda Suwarni, kakakku Herni Widhiastuti, dan Herdian Sulaksono atas segala bantuan, motivasi, dan doanya kepada penulis.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Mbak Lia, Mbak Nia, Mas Ozy, seluruh staf laboratorium Bioproses LIPI, dan teman-teman PS Biokimia khususnya angkatan 41, atas kerjasama dan persahabatannya selama ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, September 2008

Hermawan Seftiono

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 19 September 1986 dari ayah Yusuf Herman Widyalesmana (alm) dan ibu Suwarni. Penulis merupakan putra ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 6 Bogor dan pada tahun yang sama diterima masuk di Program Studi Biokimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di beberapa organisasi kemahasiswaan yaitu sebagai sekertaris Unit Kegiatan Mahasiswa Komunitas Peduli Tanaman Obat (KPTO) Zingiber pada periode 2005-2006, staf Departemen Biokimia Tumbuhan Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) pada periode 2005-2006, dan Ketua Biokimia Tumbuhan Community of Research and Education in Biochemistry (CREB’s) pada periode 2006-2007. Penulis pernah mengikuti PKMT dari DIKTI dengan judul Pemanfaatan Zeolit dan Khitosan dalam Pengolahan Bahan Baku Air Minum pada tahun 2007. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Bidang Sarana Bioproses Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, selama periode juli sampai agustus 2007 dan menulis laporan ilmiah yang berjudul Produksi dan Karakterisasi Mananase dari Streptomyces tumescense (Isolat 78) dan Streptacidiphilus luteoalbus (Isolat 210).

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... x

PENDAHULUAN ............................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA Manan ..................................................................................................... 1 Mananase ................................................................................................. 2 Streptacidiphilus luteoalbus ................................................................... 3 Pemurnian Enzim ................................................................................... 3 Karakterisasi Enzim Berdasarkan Suhu dan pH ...................................... 4

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ....................................................................................... 5

Metode Penelitian .................................................................................... 5

HASIL DAN PEMBAHASAN Indeks Manolitik Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus .............. 7

Waktu Optimum Mananase ..................................................................... 7 Ekstrak Mananase Kasar ........................................................................ 8

Mananase Hasil Pengendapan dengan Aseton ...................................... 9 Kromatogram Filtrasi Gel ..................................................................... 10 Karakterisasi Mananase .......................................................................... 11

Elektroforegram Mananase .................................................................... 12

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................. 13

Saran ....................................................................................................... 13

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 13

LAMPIRAN ..................................................................................................... 16

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur locust been gum ............................................................................ 2

2 Posisi pemotongan galaktomanan oleh komplek enzim ........................... 2

3 Mekanisme reaksi yang dikatalis oleh -mananase dari Thermonospora fusca .......................................................................................................... 3

4 Koloni Streptacidiphilus luteoalbus .......................................................... 3

5 Indeks manolitik Streptocidiphilus luteoalbus sebesar 4, dalam media agar mengandung manan setelah diinkubasi selama 5 hari ............................... 7

6 Pertumbuhan dan produksi ß-mananase dari ekstraseluler Streptacidiphilus luteoalbus pada media cair locust bean gum pada suhu ruang dan pH 6 ..... 9

7 Pengendapan mananase ekstrak kasar pada variasi konsentrasi aseton.. 9

8 Kromatogram dari kolom filtrasi gel dengan matriks sephadex G-75, elusi menggunakan 20 mM bufer fosfat pH 7, kecepatan alir 4 menit/ml.... 10

9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas mananase Streptacidiphilus luteoalbus . 12

10 Pengaruh pH terhadap aktivitas mananase Streptacidiphilus luteoalbus pada suhu 50 °C ......................................................................................... 12

11 Elektroforegram dan zimogram hasil pemurnian mananase ..................... 13

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Persamaan penentuan aktivitas mananase .................................................. 17

2 Morfologi Streptacidiphilus luteoalbus ..................................................... 17

3 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian .................. 18

4 Kurva standar protein ................................................................................. 19

5 Kurva standar manosa ................................................................................ 20

6 Perubahan pH media, jumlah mikroba, dan aktivitas mananase pada media locust bean gum 0.5% pada pH 6.0 ............................................................ 20

7 Jumlah aseton yang ditambahkan dalam 10 ml ekstrak mananase kasar.. 21

8 Hasil pengendapan ekstrak mananase kasar dengan aseton secara bertahap. 21

9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas mananase setelah pemurnian ................ 21

10 Pengaruh pH terhadap aktivitas mananase pada suhu 50 °C setelah pemurnian ....................................................................................... 22

11 Pereaksi untuk elektroforesis SDS-PAGE ................................................. 22

12 Pereaksi untuk elektroforesis zimogram .................................................... 23

13 Kurva standar marker elektroforesis dan perhitungan berat molekul sampel ......................................................................................................... 24

1

PENDAHULUAN

Hemiselulosa merupakan polisakarida linier atau bercabang yang banyak ditemukan sebagai heteroglikan pada tumbuhan tingkat tinggi. Dua jenis hemiselulosa yang penting dalam industri ialah hetero-1,4-D-manan dan hetero-1,4-D-xilan (Hilge et al. 1998). Keberadaan hemiselulosa di alam sangat berlimpah dan memiliki potensi yang besar untuk diuraikan menjadi produk akhir yang berguna.

Pengolahan limbah -manan tidak hanya untuk mengurangi limbah -manan tetapi meningkatkan nilai ekonomi. Senyawa tersebut dapat didegradasi menjadi senyawa yang lebih sederhana dengan asam atau secara enzimatik. Penggunana enzim dalam degradasi senyawa manan lebih disukai karena tidak membutuhkan peralatan yang rumit dan mahal serta produk yang dihasilkan lebih ramah lingkungan. Produk hasil pemecahan -manan secara enzimatik dapat berupa manosa, manobiosa, dan manooligosakarida. Manooligosakarida merupakan senyawa yang digunakan dalam industri makanan dan pakan (Sumardi 2004).

Mananase adalah enzim pengurai heteromanan menjadi manosa, glukosa, dan galaktosa. Enzim ini memotong secara acak rantai utama manan dan hetero -D-manan menjadi gula terlarut yaitu monodekstrin dan manosa. Untuk dapat menghidrolisis heteromanan, cendawan dan bakteri harus menghasilkan sedikitnya 3 jenis enzim yaitu

-mananase (EC 3.2.1.78), -manosidase (EC 3.2.1.25), dan -galaktosidase (EC 3.2.1.22) (Hilge et al. 1998).

Enzim mananase dapat dimanfaatkan sebagai campuran dalam pakan ternak sehingga meningkatkan nilai gizi bahan pakan kaya manan seperti bungkil kelapa (Meryandini 2004). Mananase juga berperan dalam mengurangi viskositas pada proses ekstraksi minyak sayur dan biji legum serta ekstraksi kopi pada pembuatan kopi instan (Kansoh & Nagieb 2004; Ambarawati 2005).

Mananase umumnya dihasilkan oleh mikroorganisme yang berasal dari tanah, kompos, atau rumen hewan (Hilge et al. 1998). Tanah merupakan sumber isolasi terbaik bagi beberapa mikrob karena pertumbuhan mikrob secara luas diketahui berada di dalam tanah (Aurora 2003).

Biotechnology Cultur Colection (BTCC) telah mengidentifikasi kemampuan bakteri koleksi tersebut dalam mendegradasi polisakarida diantaranya merupakan ordo

aktinomisetes seperti Streptomyces purpurascens, Streptomyces alboniger, Streptomyces tumescens, Streptomyces lipmani, Streptacidiphilus luteoalbus, dan sebagainya. Kesemua isolat ini merupakan isolat dari Indonesia. Pemilihan Streptacidiphilus luteoalbus karena isolat ini belum diteliti dan diharapkan isolat ini menghasilkan enzim mananase yang potensial dalam mendegradasi heteromanan.

Penelitian ini bertujuan melakukan pemurnian dan karakterisasi mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus. Hipotesis penelitian ini adalah Streptacidiphilus luteoalbus dapat menghasilkan enzim mananase yang merupakan enzim ekstraseluler yang berperan dalam menghidrolisis ikatan glikosidik dari heteromanan. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai potensi Streptacidiphilus luteoalbus sebagai penghasil mananase ekstraseluler serta memberikan data mengenai mananase.

TINJAUAN PUSTAKA

Manan

Hemiselulosa merupakan polisakarida kedua yang sangat melimpah di alam setelah selulosa. Berbentuk linier atau bercabang yang ditemukan sebagai heteroglikan pada tumbuhan tingkat tinggi (Hilge et al. 1998). Komponen utama hemiselulosa adalah hetero-

-1,4-D-xilan dan hetero- -1,4-D-manan. Manan sebagai komponen hemiselulosa dikelompokkan menjadi 4 subfamili yaitu

-manan, galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan (Petkowicz et al. 2001). ß-manan (hanya terdiri atas manosa), galaktomanan (tersusun dari manosa dan galaktosa), glukomanan (tersusun dari manosa dan glukosa), galaktoglukomanan (tersusun dari manosa, galaktosa, dan glukosa). Heteroxilan terutama ditemukan pada rumput-rumputan, biji sereal, dan kayu keras. Manan terutama terdapat pada kayu lunak, endosperma kopra, kelapa sawit, kopi, dan locust been gum (Ooi & Kikuchi 1995).

Locust been gum adalah substrat yang mengandung galaktomanan yang berasal dari tanaman Ceratonia siliqua. Locust been gum memiliki struktur seperti galaktomanan seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Substrat ini dapat menginduksi sekresi enzim mananase yang dapat menghidrolisis rantai tulang punggung galaktomanan maupun rantai sampingnya.

2

Locust been gum terdiri atas komponen galakto-D-manoglikan 88%, pentan 4%, protein 6%, selulosa 1%, dan mineral 1% (Sumardi 2004).

Gambar 1 Struktur Locust been gum (Moreira & Filho 2008).

Mananase

Mananase merupakan enzim pengurai heteromanan menjadi manosa, glukosa, dan galaktosa. -mananase ( -1,4-D-manan manohidrolase, EC 3.2.1.78) menghidrolisis

-1,4-D-manopirosil dalam rangka utama polimer manan yang kemudian menghasilkan rantai pendek manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dipecah oleh kerja enzim

-manosidase (EC 3.2.1.25) dan -galaktosidase (EC 3.2.1.22) menghasilkan manosa dan galaktosa (Duffaud et al. 1997). Gambar 2 menunjukkan molekul galaktomanan dengan ikatan glikosidik yang dihidrolisis oleh ketiga enzim.

Mekanisme reaksi degradasi manan oleh -mananase dari Thermomonospora fusca

dapat diilustrasikan oleh Hilge et al. (1998) pada Gambar 3. Manan merupakan polimer manosa yang mempunyai ujung pereduksi dan nonpereduksi (Gambar 3a). Enzim -mananase adalah endoenzim yang bekerja memotong bagian tengah polimer tersebut (di antara +1 dan -1). Situs aktif -mananase adalah asam glutamat nomor 128 dan 225. Asam amino glutamat nomor 128 (Glu 128) pada enzim -mananase bertindak sebagai donor proton dengan memberikan H+ pada oksigen glikosidik. Gugus _COO- pada asam amino glutamat nomor 225 (Glu 225) bekerjasama dengan _COOH pada Glu 128 menyerang atom karbon anomerik dengan membelah ikatan manosil. Akibatnya Glu 128 kehilangan H+

sehingga bermuatan negatif. Selanjutnya atom C-1 diserang oleh Glu 225 dan terjadi ikatan antara enzim dan substrat. Ikatan tersebut kemudian diserang oleh molekul air. Setelah terpotong senyawa manooligosakarida lepas. Jarak situs aktif glu 128 dan glu 225 sebesar 3.5 A (Gambar 3b) (Hilge et al. 1998).

Mananase diproduksi oleh berbagai organisme seperti bakteri, khamir, cendawan, benih berkecambah, alga laut, dan hewan (Dekker & Richards 1979). Beberapa mikroorganisme dari kelompok cendawan maupun bakteri dilaporkan banyak menghasilkan enzim -mananase. -mananase dihasilkan oleh cendawan dan bakteri dengan kisaran aktivitas pada suhu sedang (30 °C) sampai suhu tinggi (90 °C) dengan pH antara 4 sampai 7.1. Hasil aktivitasnya bervariasi antara 0.04 U/mg sampai 252.3 U/mg. Berat molekul -mananase berkisar antara 39 kD sampai 116 kD (Sumardi 2004).

Beberapa bakteri dan khamir yang diketahui menghasilkan enzim mananase adalah Bacillus pumilus DYP 2 (Aurora 2003), Bacillus pumilus (Meryandini et al. 2004), Steptomyces sp. Galur 451-3 (Ambarawati 2005), Geobacillus stearothermophilus (Sumardi 2004), Thermomonospora fusca (Hilge et al. 1998), Thermotoga neopolitana (Duffaud et al. 1997), Bacillus subtilis WY34 (Jiang et al. 2006), Sclerotium (Athelia) rolfsii (Sachslehner & Haltrich 1999), Bacteroides ovartus (Gherardini & Salyers 1987), Vibrio sp. Galur MA-138 (Tamaru et al. 1995), Trichorderma reesei C-30 (Atac et al. 1993), Bacillus stearothermophilus (Talbot & Sygusch 1990), Bacillus licheniformis (Zhang et al. 2000), Aspergilus awomori K4 (Kurakake & Komaki 2001), Aspergillus fumigatus IMI 385708 (Puchart et al. 2004).

Mananase bermanfaat dalam beberapa proses diantaranya dalam bidang farmasi, pangan, pakan, termasuk dalam industri kertas, dan bubur kertas (Sachslehner & Haltrich 1999; Moreira & Filho 2008). Mananase dikombinasikan dengan xilanase pada industri pulp dan kertas berperan sebagai agen prebleaching (Sachslehner & Haltrich 1999).

Gambar 2 Posisi pemotongan galaktomanan oleh komplek enzim (Duffaud et al. 1997).

3

Gambar 3 Mekanisme reaksi yang dikatalisis oleh -mananase Thermonospora fusca (a) -manan (polimer manosa yang diikat oleh ikatan -1,4-manosidik) dan (b) pemotongan ikatan

-1,4- manosidik oleh -mananase (Hilge et al. 1998).

Streptacidiphilus luteoalbus

Streptocidiphilus luteoalbus termasuk kelompok aktinomisetes. Kelompok bakteri aktinomisetes memiliki ciri pemersatu berupa pleomorfisme sel-selnya dan kecendrungan membentuk filamen (hifa) bercabang. Morfologi sel sangat beragam dan pleomorfik, bentuk batang tak beragam, filamen, filamen bercabang, struktur miselium, non mortal, dan gram positif (Pelczar 1986).

Koloni Streptocidiphilus luteoalbus berbentuk bulat dan berwarna putih ketika masih muda dan menjadi abu-abu bila sudah tua (Gambar 4). Isolat ini diperoleh dari biotechnology culture collection (BTCC) yang diidentifikasi menghasilkan enzim mananase. Taksonomi bakteri ini adalah sebagai berikut, domain bacteria, kingdom bakteria, filum Actinobakteria, kelas Actinobakteria, ordo Actinomycetales, famili Streptomycetaceae, genus Streptacidiphilus, spesies Streptacidiphilus luteoalbus.

Gambar 4 Koloni Streptacidiphilus luteoalbus.

Pemurnian Enzim

Pemekatan Enzim

Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses pemurnian enzim sebelum tahap pemurnian selanjutnya atau dapat digunakan untuk keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan asam (misalnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik, ultrafiltrasi, liofiliasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pengendapan protein yang biasa dilakukan dalam pengendapan mananase adalah menggunakan garam amonium sulfat dan pelarut organik aseton.

Pengendapan protein menggunakan pelarut organik berdasarkan pada pengurangan kelarutan protein dan konstanta dielektrik pelarut. Semakin banyak pelarut yang ditambahkan, semakin berkurang daya solvasi air dan muatan pada molekul permukaan protein hidrofilik. Hal ini akan menjadikan molekul protein saling berinteraksi dengan sesamanya sehingga protein mengendap. Prosedur pengendapan protein dengan pelarut

(b)

(a)

4

organik dilakukan pada suhu di bawah 0 °C. Pada suhu di atas 10 °C, konformasi protein berubah karena kinetika yang memungkinkan molekul-molekul pelarut organik mendapatkan jalan masuk ke dalam struktur protein, kemudian akan merusak interaksi hidrofobik dan akhirnya akan terjadi denaturasi (Scopes 1987). Etanol dan aseton mempengaruhi aktivitas air dengan cara mereduksi kelarutan protein sehingga terjadi agregasi dan pengendapan. Struktur air di sekeliling area hidrofobik pada permukaan protein dapat ditempati oleh molekul pelarut organik sehingga agregasi terjadi akibat interaksi antara muatan berlawanan pada permukaan protein (Wijaya 2002).

Kromatografi Filtrasi Gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang makin kecil ukuran pori.

Polimer yang membentuk gel matrik harus mempunyai syarat : tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH yang lebar, suhu, dan kekuatan ionik; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam.

Komposisi dan pori-pori partikel gel dapat diatur dengan memilih bahan dan kepekatan yang sesuai. Prinsip filtrasi gel dengan contoh sephadex yang merupakan salah satu dari sejumlah bahan yang tersedia secara komersial. Sephadex terdiri atas partikel kecil dari senyawa yang tidak larut, bersifat hidrofilik, yang dibuat dengan ikatan silang polisakarida dekstran sehingga terbentuk jala tiga dimensi dari rantai polisakrida tersebut. Molekul ini bersifat sangat polar karena kandungan gugus hidroksilnya yang tinggi dan menggelembung cukup besar bila direndam dalam air. Sephadex bersifat stabil tidak dipengaruhi oleh basa dan asam lemah tetapi asam kuat pekat harus dihindari karena dapat menghidrolisis ikatan glikosidik. Keuntungan dalam penggunaan sephadex adalah bahan ini dapat digunakan berulang kali. Setelah

digunakan, kolom dapat dicuci dengan cermat menggunakan air dan disimpan dalam ruang dingin (Nur 1992).

Setiap gel terbuat dari polimer yang berbeda tetapi dalam kisaran yang serupa. Nama dagang sephadex yaitu suatu polimer dekstran, sepharose yaitu suatu polimer agarosa, bio-gel yaitu akrilamida yang berikatan silang, dan bio-gel A yaitu suatu polimer agarosa, selain itu terdapat gel yang di produksi perusahaan lain. Ikatan silang dan sebagainya diatur dengan cermat sehingga dihasilkan kisaran produk tertentu. Sebagai contoh untuk sephadex disajikan pada Tabel 1.

Kisaran fraksi yamg berguna pada pemisahan molekul hanya suatu pendekatan karena pemisahan bergantung pada bentuk, muatan serta ukuran molekul. Sephadex G-25 dan Sephadex G-50 dibuat dengan beberapa ukuran partikel yakni dalam kualitas halus, kasar, medium, dan super halus. Partikel halus sesuai untuk sebagian besar kerja laboratorium yang memerlukan resolusi tinggi sedangkan bahan kasar sesuai untuk kerja preparatif dengan kolom besar oleh karena kecepatan alirannya lebih cepat.

Tabel 1 Sifat beberapa gel sephadex Kisaran Fraksi Bobot

Molekul

Tipe Polisakarida

Peptida dan

Protein

Air yang

diserap (g/g gel kering)

Volume Kolom

Gel (mg/g

gel kering)

G10 Sampai 700 sampai 700

1.0 2

G15 sampai 1500 sampai 1500

1.5 3

G25 100-5000 100-5000

2.5 5

G50 500-10000 1500-30000

5.0 10

G75 1000-50000 3000-80000

7.5 12-15

G100 1000-100000

4000-150000

10.0 15-20

G150 1000-150000

5000-400000

15.0 20-30

G200 1000-200000

5000-800000

20.0 30-40

Karakterisasi Enzim Berdasarkan Suhu dan pH

Kestabilan molekul enzim dipengaruhi oleh kestabilan ikatan yang ada pada molekul enzim yakni ikatan hidrogen antara atom hidrogen, oksigen, nitrogen, dan sulfur pada molekul asam amino penyusun, ikatan van der walls, interaksi hidrofobik, maupun gaya tarik listrik antar muatan yang berbeda. Kestabilan molekul enzim dengan sendirinya

5

mempengaruhi pengikatan enzim dan substrat, baik secara langsung pada lokasi aktifnya maupun secara tidak langsung melalui perubahan konformasi struktur tiga dimensi enzim tersebut (Suhartono 1988).

Bertambahnya suhu sampai dengan suhu optimum akan menaikkan kecepatan reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrational, translational, dan rotational enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bertumbukan dan bereaksi. Suhu yang lebih besar dari suhu optimum menyebabkan protein enzim mengalami perubahan konformasi yang bersifat detrimental. Substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi sehingga sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami hambatan dalam memasuki lokasi aktif enzim pada suhu tinggi (Suhartono 1988).

Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium tempat reaksi sehingga pada setiap percobaan dengan enzim diperlukan bufer untuk mengontrol pH reaksi. Umumnya enzim aktif pada pH netral yakni pH cairan makhluk hidup, akan tetapi kisaran keaktifan enzim dapat mencapai pH 5-9 atau pada konsentrasi ion hidrogen 10-9-10-5 M. Percobaan yang mempergunakan enzim murni hasil isolasi, biasanya memakai bufer buatan seperti bufer fosfat, asetat, dan sebagainya. Percobaan yang mempergunakan enzim yang masih tercampur dengan komponen lain dari sel tempat asal enzim atau ekstrak kasar biasanya media larutan tersebut sudah mengandung bufer alam yang berasal dari cairan di dalam sel (Suhartono 1988).

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan antara lain, biakan berupa Streptacidiphilus lutecalbus yang merupakan koleksi BTCC. Reagen berupa reagen dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH padat, fenol, Na2SO3, dan kalium natrium tartrat (KNa-tartrat). Bufer fosfat 0.02 M, dan bufer asetat 0.02 M. Media prekultur dan media produksi terdiri atas locust bean gum (Sigma-Aldrich) 0.5 %, ekstrak khamir 0.05%, bacto pepton 0.075%, (NH4)2SO4 0.14%, KH2PO4 0.2%, MgSO4.7H2O 0.03%, CO(NH4)2 0.03%, CaCl2

0.03%, FeSO4.7H2O 0.0005%, MnSO4.7H2O 0.00016%, ZnSO4.7H2O 0.00014%, CoCl2

0.0002%, dan akuades. Pengisi kolom berupa sephadex G-75 dan glasswol.

Bahan elektroforesis berupa coomasie briliant blue R-250, metanol, asam asetat glasial, amonium persulfat (APS), akrilamida, tetrametiletilendiamina (TEMED), bis-akrilamida, TrisCl, sodium dedocyll sulphates (SDS), 2-merkaptoetanol, gliserol, biru bromofenol, congo red, NaCl, dan marker xl-ladder broad range apro. Pemekatan dengan aseton. Standar berupa manosa dan bovine serum albumin (BSA)

Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis (Beckman DU 650), sentrifus (Jouan MR 1812), autoklaf (Everlight TA-630), piranti elektroforesis protein (Atto Pagerun AE-6531), kolom kromatografi, timbangan analitik, cawan petri, penangas bergoyang, rak tabung, tabung, tabung sentrifus, gelas piala, gelas ukur, labu Erlenmeyer, pH meter, vorteks, botol Schott penangas air, dan autopipet.

Metode Penelitian

Uji Kualitatif Aktivitas Manolitik

Sebanyak 1 koloni Streptacidiphilus lutecalbus ditumbuhkan pada medium agar yang mengandung 0.5% locust bean gum. Kemudian diiinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari lalu dilakukan pewarnaan dengan larutan congo red 0.1% selama 30 menit. Setelah itu dibilas dengan larutan NaCl 2%, dilakukan sebanyak 3 kali setiap 15 menit. Pengamatan zona bening sebagai indikator aktivitas enzim.

Penentuan Waktu Produksi Optimum

Sebanyak 2 mata ose kultur Streptacidiphilus lutecalbus diinokulasikan pada 20 ml media prekultur. Kemudian diinkubasi dan diagitasi dengan penangas bergoyang pada suhu ruang selama 1 hari.

Media prekultur yang berisi isolat dipindahkan ke dalam 180 ml media kultur kemudian dilakukan sampling 2 kali sehari pada hari ke-1 hingga hari ke-4 dan sekali sampling pada hari ke-5 sebanyak 10 ml. Kemudian diukur pH dan jumlah bakteri pada OD660, setelah itu disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Supernatannya diambil dan dimasukkan dalam tabung sentrifus 15 ml dan disimpan dalam ruang pendingin pada suhu 4 °C. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas mananase dan kadar protein.

6

Uji Aktivitas Enzim Mananase, Kadar Protein dan Karakterisasi Enzim Mananase

Aktivitas enzim mananase diuji dengan cara sebanyak 0.5 ml substrat locust bean gum 0.5% dicampur dengan 0.5 ml enzim mananase lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1.5 ml reagen dinitrosalisilat (DNS). Perlakuan kontrol dengan cara substrat direaksikan dengan DNS lalu ditambahkan enzim. Kemudian sampel dan kontrol dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya pada ?= 540 nm (Miller 1959). Satu unit aktivitas enzim mananase didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 µmol manosa dalam 1 menit. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara, berbagai konsentrasi manosa dari 0-0.35 mg/ml direaksikan dengan 1.5 ml DNS lalu dididihkan selama 15 menit dan didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya pada ?= 540 nm.

Penentuan kadar protein dengan cara, enzim divorteks lalu diukur absorbannya pada ?=280 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan ialah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari 0-0.5 mg/ml dengan perlakuan yang sama dengan penentuan kadar protein.

Enzim hasil kromatografi filtrasi gel diujikan pada berbagai suhu inkubasi (30-80 °C) dengan selang 10 °C dan pada berbagai selang pH (4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, dan 8.0). Bufer yang digunakan adalah bufer asetat (pH 4.0-5.0) 0.02 M dan bufer fosfat (pH 6.0-8.0) 0.02 M.

Produksi Enzim Mananase Ekstrak kasar

Sebanyak 2 mata ose kultur Streptacidiphilus lutecalbus diinokulasikan pada 100 ml media prekultur. Kemudian diinkubasi dan diagitasi dengan penangas bergoyang pada suhu ruang selama 1 hari. Media prekultur yang berisi kultur Streptacidiphilus lutecalbus dipindahkan ke dalam 900 ml media produksi. Suspensi diinkubasi dan diagitasi dengan penangas bergoyang pada suhu ruang selama 69 jam berdasarkan waktu produksi optimum.

Kultur kemudian disentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 °C. Supernatannya diambil dan dimasukkan dalam botol Schott 1000 ml dan disimpan dalam ruang pendingin pada suhu 4 °C. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas mananase dan kadar protein.

Purifikasi Mananase

Pengendapan dengan Aseton. Sebanyak 10 ml supernatan ekstrak kasar mananase diendapkan dengan aseton. Aseton ditambahkan secara bertahap dengan konsentrasi yaitu 30, 40, 50, 60, 70, 80, dan 90% lalu diaduk menggunakan pengaduk magnetik (Scopes 1987). Campuran disimpan dalam ruang pendingin selama 2 jam. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm, suhu 4 °C selama 15 menit.

Endapan enzim dipisahkan dan dilarutkan dalam 0.02 bufer fosfat pH 7.0 dengan volume seminimal mungkin. Kemudian aktivitas mananase dan kadar proteinnya ditentukan. Aktivitas yang tinggi menunjukkan persentase kejenuhan aseton yang optimum yang selanjutnya digunakan dalam tahap pemurnian.

Kromatografi Filtrasi Gel. Pemurnian dilakukan menggunakan matriks sephadex G-75. Matriks ini dikembangkan dengan cara 10 g matriks direndam dalam 200 ml 0.02 M bufer fosfat pH 7.0, diaduk perlahan dengan batang pengaduk, kemudian dipanaskan pada suhu 90 °C selama 2 jam. Setelah dingin disimpan pada ruang pendingin selama semalam. Dekantasi dilakukan untuk menghilangkan serbuk yang terapung.

Matriks dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 1 cm dan tinggi 60 cm, pada bagian dasar kolom diberi glasswool sebagai penahan. Volume mananase yang dimurnikan sebanyak 0.5 ml. Matriks sephadex G-75 dielusi dengan 0.02 M bufer fosfat pH 7.0 dengan kecepatan 4 menit/ml. Volume fraksi yang ditampung masing-masing sebanyak 1 ml. Fraksi eluen sebanyak 1 ml ditampung dalam tabung dan diukur pada ? 280 nm dan aktivitas mananase setiap fraksi diukur dengan metode DNS. Kemurnian enzim dianalisis dengan SDS-PAGE dan Zimogram.

Analisis Elektroforesisi SDS-PAGE dan Zimogram Nondenaturan (native)

Elektroforesis protein dengan SDS-PAGE menggunakan gel pemisah 10% poliakrilamida dan gel penahan 4% poliakrilamida (Laemmli l970). Ke dalam tabung mikro dimasukkan 20 µl sampel protein dan 5 µl bufer sampel. Campuran lalu dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Sampel dimasukkan ke dalam sumur gel penahan menggunakan autopipet. Selanjutnya piranti elektroforesis Atta Pagerun AE-6531

7

dipasang, dan 300 ml bufer elektroforesis dituangkan ke dalam bejana elektroforesis. Proses elektroforesis berlangsung kurang lebih selama 4 jam pada arus 10 mA. Gel hasil elektroforesis dilepas dari cetakan dan jarak migrasi protein diukur dari batas atas gel pemisah. Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan coomasie briliant blue. Gel diwarnai dengan pewarna ini dan diinkubasi selama 2 jam lalu dicuci dengan larutan destaining (Lampiran 11).

Cara kerja zimogram non denaturan sama seperti yang dilakukan pada cara kerja elektroforesis SDS-PAGE, namun enzim mananase tidak didenaturasi serta komposisi gel yang digunakan dalam zimogram ditambahkan substrat locust bean gum dan komposisi gel dan bufer elektroforesisnya tidak menggunakan SDS. Komposisi untuk gel zimogram terdapat pada Lampiran 12. Setelah selesai elektroforesis, gel diinkubasi selama 30 menit dalam 0.02 M bufer fosfat pH 6.5 pada suhu ruang. Untuk memunculkan pita protein ß-mananase, gel diwarnai dengan larutan 0.2% congo red selama 30 menit pada suhu ruang dan terakhir gel dicuci dengan larutan 2% NaCl.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Indeks Manolitik Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus

Koloni Streptacidiphilus luteoalbus yang ditumbuhkan pada media agar yang mengandung locust bean gum (manan) setelah diinkubasi selama 5 hari seperti yang ditunjukkan Gambar 5 akan mendifusikan enzim mananase. Mananase yang merupakan enzim ekstraseluler akan mendegradasi substrat manan yang terdapat dalam agar menjadi bentuk manooligosakarida atau manosa. Fungsi utama enzim ekstraselular adalah melangsungkan perubahan-perubahan pada nutrien disekitarnya sehingga memungkinkan nutrien tersebut memasuki sel (Pelczar 1986).

Substrat yang telah dihidrolisis oleh mananase akan membentuk zona bening. Zona bening akan semakin jelas setelah penambahan congo red (Downie et al. 1994). Peranan congo red dapat dijelaskan sebagai berikut: congo red (C32H22N6O6S2Na2) akan berikatan dengan substrat manan dalam media agar karena manan mempunyai ikatan ß-1,4-D- manopiranosil, congo red yang terikat pada manan akan mewarnai media agar yang

mengandung manan sehingga berwarna merah. Enzim mananase yang menghidrolisis manan di sekitar koloni menghasilkan manosa atau manooligosakarida. Manosa merupakan monosakarida sehingga tidak mempunyai ikatan ß-1,4-D-manopiranosil sedangkan manooligosakarida mempunyai sedikit ikatan ß1-4-D-manopiranosil sehingga tidak dapat mengikat congo red dengan kuat. Pembilasan dengan NaCl akan melunturkan congo red terutama di daerah sekitar koloni yang mengandung manosa atau manooligosakarida karena congo red tidak terikat secara kuat sehingga terlihat zona bening (Sumardi 2004).

Zona bening dapat diukur berdasarkan indeks manolitik (IM) yaitu perbandingan antara diameter zona bening dengan diameter koloni. Hasil Perhitungan diperoleh IM mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus sebesar 4 dengan diameter zona bening 1.2 cm dan diameter koloni 0.3 cm. Bila dibandingkan dengan IM dari Bacillus pumilus DYP2 sebesar 16 (Aurora 2003) maka IM dari dari Streptacidiphilus luteoalbus relatif rendah. Adanya indeks manolitik ini menunjukkan bahwa adanya mananase ekstraseluler yang dihasilkan Streptacidiphilus luteoalbus.

Gambar 5 Indeks manolitik Streptacidiphilus luteoalbus sebesar 4, dalam media agar mengandung manan setelah diinkubasi selama 5 hari.

Waktu Optimum Mananase

Kultur Streptacidiphilus luteoalbus ditumbuhkan pada media cair yang mengandung substrat locust bean gum 0.5% yang berperan sebagai sumber karbon serta untuk menginduksi produksi mananase. Locust bean gum merupakan galaktomanan dengan perbandingan manosa:galaktosa adalah 4:1 (Sachslehner & Haltrich 1999). Keberadaan suatu substrat dapat memacu suatu mikroorganisme untuk mensekresi metabolit selnya.

Penentuan waktu produksi optimum dilihat dari aktivitas mananase tertinggi. Satu unit aktivitas enzim mananase didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat memproduksi 1 µmol manosa dalam 1 menit.

8

Gambar 6 memperlihatkan bahwa pada awal inkubasi yaitu hari pertama telah menunjukkan adanya aktivitas mananase dari jam ke-0 hingga jam ke-23 dan mengalami penurunan pada jam ke-29 hingga jam ke-46. Penurunan aktivitas dikarenakan telah terbentuknya produk berupa manosa atau manooligosakarida. Produk ini akan menghambat kerja mananase dalam menghidrolisis substrat manan, selain itu penurunan aktivitas mananase juga dapat disebabkan oleh proses adaptasi bakteri dalam menghasilkan mananase. Hal ini terlihat dari perubahan pH media (Lampiran 6) karena media awal menggunakan pH 6 dan mengalami kenaikan menjadi pH 8.16 pada jam ke-69. Awal inkubasi mulai terlihat adanya aktivitas tetapi karena pHnya belum sesuai dengan habitat bakteri tersebut tumbuh maka bakteri ini mengeluarkan metabolit mananase dalam jumlah sedikit, setelah mampu beradaptasi dengan mengubah pH media menjadi pH basa maka bakteri ini menghasilkan mananase. Kenaikan pH dikarenakan sel bakteri banyak menggunakan senyawa amino organik untuk pertumbuhannya. Senyawa-senyawa tersebut akan dideaminasi menghasilkan NH3 yang selanjutnya akan bereaksi dengan H+ yang ada di medium dan akan menghasilkan NH4

+ yang bersifat basa (Said 1987).

Aktivitas mananase akan meningkat ketika produk berupa manosa atau manooligosakarida berkurang. Berkurangnya manosa atau manooligosakarida karena produk ini digunakan oleh bakteri sebagai sumber karbon untuk nutrisi dan bereproduksi. Hasil menunjukkan adanya peningkatan aktivitas mananase dari jam 52 hingga puncak optimum pada jam ke-69 dengan aktivitas tertinggi sebesar 0.2168 U/ml. Produk yang telah terbentuk selanjutnya digunakan oleh bakteri untuk bereproduksi hal ini dapat terlihat dari jumlah bakteri yang diukur pada OD 660 memiliki nilai yang tinggi pada jam ke 75 yaitu sebesar 1.3430.

Ekstrak Mananase Kasar

Produksi mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus dilakukan pada media cair yang mengandung 0.5% manan lalu diinkubasi berdasarkan penentuan waktu produksi optimum yaitu pada suhu ruang selama 69 jam dengan pengocokan. Pemisahan enzim mananase relatif mudah, karena sel bakteri tidak perlu dihancurkan terlebih dahulu.

Mananase dipisahkan dari sel bakteri dengan sentrifugasi dalam keadaan dingin (4 °C) agar denaturasi protein dapat dihindari. Proses sentrifugasi akan mengendapkan sel bakteri sedangkan enzim akan terlarut dalam supernatan sehingga supernatan (ekstrak enzim kasar) yang digunakan untuk proses selanjutnya.

Prinsip pengujian aktivitas mananase merupakan reaksi antara enzim dan substrat yang akan menghasilkan produk berupa manosa atau manooligosakarida. Produk ini akan bereaksi dengan reagen dinitrosalisilat kemudian konsentrasi produk diukur dengan spektrofotometer. Prosesnya sebagai berikut: ekstrak enzim kasar yang berisi enzim mananase direaksikan dengan substrat locust been gum 0.5% dan diinkubasi selama 30 menit, maksud dari inkubasi adalah agar mananase dapat menghidrolisis substrat locust been gum sehingga menghasilkan produk berupa manosa atau manooligosakarida yang kemudian kadar manosa ditentukan dengan mengukur absorban larutan menggunakan spektrofotometer sinar tampak.

Reaksi antara enzim dan substrat dihentikan dengan menambahkan DNS. Selanjutnya reagen dinitrosalisilat yang terdiri atas komponen utama asam 3,5-dinitrosalisilat yang berwarna kuning akan mengalami reaksi reduksi menjadi asam 3-amino-5-nitrosalisilat.

Reaksi reduksi pada gugus nitro dikarenakan adanya gula pereduksi yang merupakan hasil hidrolisis substrat oleh mananase (Miller 1959). Selain untuk menghentikan reaksi, reagen DNS berfungsi untuk memberikan warna pada larutan sehingga absorbannya dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Warna yang terbentuk dari kuning sampai jingga bergantung pada kadar manosa dalam larutan, semakin banyak kadar manosa maka warnanya akan semakin pekat. Untuk lebih memastikan bahwa enzim dan substrat tidak lagi bereaksi maka setelah penambahan DNS, dididihkan selama 15 menit.

Proses yang sama dilakukan untuk larutan kontrol tetapi berbeda urutan penambahannya yaitu substrat ditambahkan DNS setelah itu ditambahkan enzim lalu dididihkan. Adanya larutan kontol adalah untuk memastikan bahwa manosa yang dihasilkan benar berasal dari reaksi antara enzim dan substrat, bukan manosa yang berasal pada saat proses produksi mananase sehingga pada saat mencari konsentrasi manosa, nilai absorban sampel dikurangi nilai absorban kontrol.

9

0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.4001.6001.8002.0002.2002.400

0 6 23 29 46 52 69 75 92

Waktu (Jam)

OD

660

0.0000.0200.0400.0600.0800.1000.1200.1400.1600.1800.2000.2200.240

Akt

ivita

s M

anan

ase

(U/m

l)

Jumlah Sel Bakteri Aktivitas Mananase (U/ml)

Gambar 6 Pertumbuhan dan produksi ß-mananase ekstraseluler dari Streptacidiphilus luteoalbus pada media cair locust bean gum pada suhu ruang dan pH 6.

Mananase Hasil Pengendapan dengan Aseton

Pemurnian protein dilakukan berdasarkan sifat kelarutan, ukuran, muatan, dan afinitas pengikatan spesifik dari protein itu sendiri. Campuran protein selanjutnya dipisahkan dengan berbagai tahap pemisahan (Stryer et al. 2002). Pengendapan protein pada awal pemurnian berfungsi untuk memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim kontaminan yang tidak dikehendaki (Fahrurrozi 2007; Widhyastuti 2007). Pemilihan aseton untuk pengendapan enzim karena syarat yang harus dipertimbangkan dalam memilih senyawa untuk pengendapan yaitu kemudahan pemisahan agregat protein target dari cairan.

Penambahan pelarut organik akan menurunkan konstanta dielektrik larutan sehingga kelarutan protein menurun dan terjadi agregasi karena tarik-menarik elektrostatik (Suhartono 1989). Pengendapan protein dengan pelarut organik yaitu aseton berdasarkan sifat yang tidak saling larut antara aseton (nonpolar) dan air (polar). Penambahan aseton ke dalam larutan protein akan mengurangi solvasi air terhadap residu hidrofilik enzim sehingga terjadi penurunan konstanta dielektrik pelarut. Air yang berada di sekitar daerah hidrofobik dari permukaan protein akan digantikan oleh pelarut aseton sehingga terjadi interaksi hidrofobik.

Protein membran pada umumnya mempunyai sifat hidrofobisitas yang cukup tinggi dibandingkan protein sitoplasma. Protein membran lebih bersifat nonpolar

sehingga lebih stabil bila diendapkan dengan pelarut organik seperti aseton (Scopes 1987). Pada proses pengendapan, terjadi penurunan kadar protein dalam supernatan, dan sebaliknya akan terjadi peningkatan protein dalam endapan.

Proses pegendapan dilakukan dalam suasana dingin agar tidak terjadi peningkatan suhu karena pembebasan energi selama penambahan aseton, mencegah agar aseton cepat menguap, dan mencegah terjadinya denaturasi protein. Aseton dingin ditambahkan sedikit demi sedikit dengan kecepatan pengadukan yang konstan agar konsentrasi aseton dapat merata dalam berinteraksi dengan enzim. Enzim mananase diperoleh dengan cara sentrifugasi karena enzim ini akan mengendap. Pelet kemudian diambil lalu dilarutkan dengan 20 mM bufer fosfat pH 7.

Pengendapan dilakukan dengan cara penambahan aseton dengan beberapa konsentrasi dimulai dari 30 sampai 90%. Gambar 7 menunjukkan bahwa pengendapan enzim dengan aseton 70% mempunyai aktivitas yang paling tinggi yaitu 0.2670 U/ml. Pengendapan enzim dengan aseton mempunyai pengaruh efek hidrofobisitas yang kecil. Pengendapan justru terjadi karena adanya interaksi elektrostatik antara muatan yang berlawanan pada permukaan protein. lnteraksi tersebut mengakibatkan protein berada pada kondisi isoelektrik, kemudian beragregasi dan akhirnya mengendap (Scopes 1987). Konsentrasi aseton dari 30-60% belum dapat mengendapkan mananase secara keseluruhan sehingga aktivitasnya masih rendah sedangkan konsentrasi aseton lebih dari 70% memiliki aktivitas yang rendah karena pada konsentrasi aseton yang semakin besar selain dapat mengendapkan enzim mananase juga mendenaturasi enzim sehingga aktivitasnya semakin rendah.

0.0000

0.0500

0.1000

0.1500

0.2000

0.2500

0.3000

Akt

ivita

s M

anan

ase

(U/m

l)

0 30 40 50 60 70 80 90

Konsentrasi Aseton (%)

Gambar 7 Pengendapan mananase ekstrak kasar pada variasi konsentrasi aseton.

10

Kromatogram Filtrasi Gel

Kromatografi merupakan pemisahan diferensial komponen sampel diantara fase gerak dan fase diam. Secara umum fase diam terdiri atas partikel yang dipak di dalam kolom. Campuran protein yang akan dipisahkan pada awalnya dibawa oleh fase gerak kemudian berimigrasi di sepanjang kolom. Protein yang lebih terikat pada fase diam akan bermigrasi lebih lambat dibandingkan dengan protein yang lebih terikat pada fase gerak (Scopes 1987). Kromatografi flitrasi gel dilakukan untuk menghilangkan protein yang tidak diinginkan dan diperlukan untuk persiapan sebelum analisis dengan elektroforesis SDS-PAGE (Sachslehner & Haltrich 1999). Prinsip kromatografi filtrasi gel adalah pemisahan berdasarkan perbedaan bobot molekul. Molekul yang lebih kecil akan menembus ke dalam pori-pori matriks dan tertahan selama aliran ke bawah kolom, tetapi molekul protein besar tidak dapat menembus ke dalam butiran berpori dan akan melewati kolom lebih cepat. Protein berukuran menengah akan mengalir ke bawah pada kecepatan antara, bergantung pada tingkat kemampuan menembus butiran. Untuk molekul dengan bentuk globular, lamanya waktu alir berbanding lurus dengan bobot molekul tersebut.

Matriks yang digunakan pada penelitian ini adalah sephadex G-75 yang dapat memisahkan peptida dan protein dengan kisaran 3000-80000 dalton (Nur 1992). Hasil akhir pemisahan bergantung dari kolom yang dibuat. Kolom yang baik adalah yang bebas dari gelembung udara, bebas dari kotoran, dan mempunyai laju alir kolom yang relatif konstan.

Hasil percobaan (Gambar 8) menunjukkan adanya 2 puncak protein pada pengukuran OD 280. Puncak pertama yaitu dari fraksi no 9-15 dan puncak kedua dari fraksi no 18-39. Puncak pertama walaupun memiliki nilai OD yang besar tetapi aktivitas mananasenya kecil sehingga pada puncak pertama bukan enzim mananase tetapi protein pengotor yang telah terpisahkan. Puncak kedua pada OD 280 memiliki 2 puncak aktivitas mananase yaitu puncak pertama pada fraksi no 22 dan puncak kedua pada fraksi no 26-32. Puncak pertama aktivitas mananase pada fraksi no 22 memiliki aktivitas yang relatif tinggi yaitu 0.0313 U/ml, namun fraksi selanjutnya aktivitas mananase relatif rendah hal ini menunjukkan pada fraksi tersebut masih terdapat protein lain yang memiliki bobot molekul yang relatif sama

dengan enzim mananase. Puncak kedua aktivitas mananase memiliki aktivitas antara 0.0179-0.0708 U/ml dengan aktivitas tertinggi pada fraksi 29 yaitu 0.0708 U/ml. Adanya 2 puncak aktivitas mananase menunjukkan bahwa mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus memiliki dua molekul enzim (isoenzim) yang berperan dalam menghidrolisis manan.

Hasil pemurnian yang dihasilkan dari tahap ekstrak kasar, pengendapan aseton 70%, dan kromatografi filtrasi gel (Tabel 2) menunjukkan bahwa total aktivitas mengalami kenaikan dari tahap ekstrak kasar ke tahap aseton 70% tetapi mengalami penurunan pada tahap kromatografi filtrasi gel. Total aktivitas merupakan aktivitas keseluruhan enzim di dalam larutan, tetapi total aktivitas bukan menunjukkan aktivitas spesifik dari mananase karena semakin banyak volume di dalam setiap tahap maka total aktivitasnya semakin besar. Protein total dari tahap ekstrak enzim kasar sampai kromatografi filtrasi gel mengalami penurunan dari 1077.47 mg sampai 2.04 mg. Penurunan kadar protein dikarenakan pada setiap tahap pemurnian terjadi pengurangan pengotor yang terdapat pada larutan, pengotor dapat berupa protein lain yang tidak diinginkan atau metabolit lain. Aktivitas spesifik adalah besarnya aktivitas enzim per milligram protein. Aktivitas spesifik dari tiap tahapan pemurnian mengalami kenaikan karena telah berkurangnya pengotor sehingga dari aktivitas spesifik ini menunjukkan bahwa hanya enzim mananase yang bekerja dalam menghidolisis substrat, dari tahapan ekstrak enzim kasar sampai kromatografi filtrasi gel terjadi kenaikan aktivitas spesifik dari 0.07 U/mg menjadi 0.19 U/mg.

0.0000

0.1000

0.2000

0.3000

0.4000

0.5000

0.6000

0.7000

0.8000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Fraksi [volume (ml)]

OD

280

0.0000

0.0100

0.0200

0.0300

0.0400

0.0500

0.0600

0.0700

0.0800

Akt

ivita

s m

anan

ase

(U/m

l)

OD 280 Aktivitas Mananase (U/ml)

Gambar 8 Kromatogram dari kolom filtrasi gel dengan matriks sephadex G-75, elusi menggunakan 20 mM bufer fosfat pH 7, kecepatan alir 4 menit/ml.

11

Tabel 2 Pemurnian enzim mananase (ekstrak enzim kasar, fraksi aseton 70%, dan kromatografi filtrasi gel)

Tahap Total Protein Aktivitas Yield Tingkat

pemurnian Aktivitas Total Spesifik (%) Kemurnian

(Unit) (mg) (U/mg) Ekstrak kasar 72.77 1077.47 0.07 100.00 1.00 Aseton 70% 78.12 802.65 0.10 107.35 1.44 Filtrasi gel 0.39 2.04 0.19 0.53 2.80

Tingkat kemurnian adalah perbandingan aktivitas spesifik tiap proses pemurnian dengan aktivitas spesifik ekstrak enzim kasar sehingga bila aktivitas spesifik dari tiap tahap pemurnian meningkat maka tingkat kemurniannya meningkat. Data menunjukan bahwa tingkat kemurniannya meningkat dari 1 menjadi 2.80. Perolehan (yield) mengalami kenaikan dari tahap ekstrak enzim kasar ke pengendapan aseton 70% dan mengalami penurunan yang drastis pada tahap kromatografi filtrasi gel, hal ini dikarenakan setelah pengendapan aseton 70% diperlukan tahap pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion. Kromatografi penukar ion lebih spesifik dalam memisahkan mananase dengan protein pengotor yaitu berdasarkan interaksi antara mananase dengan gugus penukar ion pada matriks sehingga pada saat fraksi yang diambil merupakan enzim mananase. Karena kromatografi penukar ion tidak dilakukan tetapi menggunakan kromatografi filtrasi gel maka enzim mananase yang diinginkan belum seluruhnya keluar dari kolom hal ini dikarenakan eluen yang digunakan adalah bufer fosfat pH 7 sehingga mananase masih berinteraksi dengan matrik. Untuk melepaskan interaksi antara mananase dengan matriks diperluakn perngubahan pH dengan gradien pH, karena bufer yang digunakan hanya pH 7 maka mananase belum seluruhnya terlepas dari matriks sehingga yield menjadi rendah yaitu 0.53%.

Karakterisasi Mananase

Enzim mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus dikarakterisasi berdasarkan suhu optimumnya dengan menginkubasinya selama 30 menit dalam penangas air dari rentang suhu 30-80 °C, dari rentang suhu tersebut akan diperoleh suhu optimum mananase dalam menghidrolisis substrat. Mananase hasil pemurnian memiliki aktivitas optimum pada suhu 50 °C dengan aktivitas sebesar 0.0228 U/ml setelah melewati suhu 50 °C, aktivitas mananase mengalami penurunan tetapi aktivitasnya tidak hilang hal ini menunjukkan bahwa mananase ini termasuk enzim

termostabil (Gambar 9). Kestabilan suatu enzim bergantung pada beberapa hal yaitu ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik, interaksi ion, dan jembatan disulfida. Kestabilan enzim terhadap panas dapat terjadi karena pelipatan asam amino penyusun protein membentuk konformasi tertentu yang tahan terhadap efek denaturasi karena pada umumnya protein akan terdenturasi pada suhu yang tinggi.

Bertambahnya suhu sampai dengan suhu optimum akan menaikkan kecepatan reaksi enzim karena bertambahnya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrational, translational, dan rotational enzim serta substrat sehingga memperbesar peluang keduanya untuk bertumbukan dan bereaksi. Suhu yang lebih besar dari suhu optimum menyebabkan protein enzim mengalami perubahan konformasi yang menyebabkan aktivitasnya berkurang. Selain itu penurunan aktivitas enzim dikarenakan terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetik dari molekul enzim melebihi energi untuk mempertahankan ikatan sekunder. Ikatan sekunder yang terputus mengakibatkan hilangnya struktur sekunder dan tersier enzim disertai berkurangnya atau hilangnya aktivitas enzim. Substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi sehingga sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim pada suhu tinggi (Suhartono 1988). Enzim digolongkan menjadi enzim asam, netral, dan basa berdasarkan pH optimumnya. Aktivitas enzim bergantung pada tingkat ionisasi rantai samping asam amino tertentu dan aktivitas pH dari suatu enzim menggambarkan pH pada saat gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan (Lehninger 1982).

Hasil percobaan menunjukkan bahwa dari rentang pH 4-8 mananase Streptacidiphilus luteoalbus yang diinkubasi pada suhu 50 °C memiliki pH optimum pada pH 6.5 dengan aktivitas mananase sebesar 0.0232 U/ml (Gambar 10). pH optimum pada pH 6.5 menunjukkan bahwa enzim ini termasuk enzim asam. Aktivitas mananase relatif stabil pada

12

0.0000

0.0040

0.0080

0.0120

0.0160

0.0200

0.0240

0.0280

20 30 40 50 60 70 80

Suhu (°C)

Akt

ivita

s M

anan

ase

(U/m

l)

Gambar 9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus.

pH 4-8. Artinya pada kisaran pH tersebut, ion-ion hidrogen tidak banyak mempengaruhi gugus fungsional enzim sehingga konformasi enzim tetap terjaga. Namun pada pH di bawah 4 terdapat banyak ion hidrogen di sekeliling enzim. Pada kondisi tersebut terjadi reaksi antara ion tersebut dan gugus fungsional enzim mengakibatkan rusaknya konformasi

-mananase. Untuk pH di atas 8 terdapat sedikit ion di sekeliling enzim dan akibatnya hampir sama seperti kelebihan hidrogen (Sumardi 2004).

Mananase yang dihasilkan dari Streptacidiphilus luteoalbus memiliki suhu optimum pada 50 °C dan pH 6.5 memiliki karakteristik yang berbeda dibanding dengan berbagai mikroorganisme diantaranya dari Bacillus licheniformis memiliki suhu dan pH optimum pada 60 °C dan pH 7 (Zhang et al. 2000), Bacillus subtilis WY34 pada 65 °C dan pH 6 (Jiang et al. 2006), Trichoderma reesei C-30 pada 75 °C dan pH 5 (Atac et al. 1992), dan Vibrio sp. Strain MA-138 pada 40 °C dan pH 6.5 (Tamaru et al. 1995).

Elektroforegram Mananase

Elektroforesis adalah suatu cara pemisahan beberapa fraksi dari suatu zat berdasarkan atas pergerakan partikel yang bemuatan di bawah pengaruh medan listrik. Mananase dari setiap tahap pemurnian dianalisis jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan SDS-PAGE (Sodium dedocyl sulphates-polyacrylamide gel electrophoresis) dan zimogram. Untuk analisis SDS-PAGE dan zimogram ada 2 macam gel, yaitu gel penahan (stacking gel) dan gel pemisah (resolving gel). Gel tersebut mengandung akrilamida, SDS, APS dan TEMED. Gel akrilamida merupakan proses polimerisasi akrilamida dengan

0.0000

0.0040

0.0080

0.0120

0.0160

0.0200

0.0240

0.0280

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8

pH

Akt

ivita

s M

anan

ase

(U/m

l)

Gambar 10 Pengaruh pH terhadap aktivitas mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus pada suhu 50 °C.

metilenbisakrilamida dan amonium persulfat sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan amonium persulfat dalam air akan bereaksi dengan akrilamida membentuk akrilamida aktif yang dapat bereaksi satu dengan yang lain membentuk polimer (Janson & Ryden 1998).

Larutan SDS ditambahkan pada saat membuat gel agar bagian hidrofobik dari molekul protein terikat dengan SDS sehingga molekul terurai dari lipatannya dan muatan protein tersebut sama. Dengan demikian proses pemisahan protein hanya berdasarkan pada perbedaan bobot molekul. Bufer sampel mengandung agen pereduksi yaitu ß-merkaptoetanol sehingga ikatan disulfida dalam protein terputus. Dengan demikian subunit dalam polipeptida akan terpisah secara baik. Selama elektroforesis digunakan arus sebesar 10 mA selama kurang lebih 4 jam. Selama proses berlangsung molekul protein yang berukuran lebih kecil akan bergerak lebih cepat melintasi gel sedangkan yang berukuran besar akan lebih lambat. Pada akhirnya molekul berberat molekul rendah akan mempunyai Rf (jarak tempuh) yang lebih jauh dibandingkan dengan yang berukuran lebih besar. Penentuan bobot molekul dilakukan pada hasil pemurnian dengan filtrasi gel. Penelitian ini digunakan penanda dengan bobot molekul yang berbeda, yaitu meliputi rantai miosin 273 kD, ß-galaktosidase 114 kD, bovine serum albumin 84 kD, glutamat dehidrogenase 61 kD, ovalbumin 47.3 kD, gliseraldehida 3 fosfat dehidrogenase 38.9 kD, prestained carbonic anhidrase II 31.3 kD, tripsin inhibitor A 25.7 kD, lisozim 17.4 kD, dan aprotinin 8.6 kD.

Gel yang telah dikeluarkan lalu diwarnai dengan larutan coomassie briliant blue. Coomassie brilliant blue memiliki batas deteksi untuk protein dari 100 ng sampai 1 µg

13

(Manz et al. 2004). Pewarna ini relatif kurang sensitif di banding pewarna perak tetapi sangat baik untuk digunakan (Wenk & Fernandis 2007). Gambar 11 menunjukkan bahwa sampel yang di elektroforesis dengan SDS-PAGE tidak menunjukkan pita-pita protein yang terwanai oleh coomassie briliant blue dengan jelas karena jumlah proteinnya sangat sedikit walaupun dari setiap tahap telah dipekatkan dengan aseton. Untuk memastikan bahwa pita-pita protein tersebut merupakan enzim yang kita inginkan, maka dilakukan teknik zimogram. Zimogram merupakan metode untuk mendeteksi enzim spesifik di antara pita yang dipisahkan dengan elektroforesis (Dennison 2002). Untuk zimogram pada gel pemisah disisipi substrat manan (locust bean gum) yang akan dihidrolisis oleh ß-mananase selama inkubasi (Sumardi 2004).

Hasil percobaan memperlihatkan bahwa pada pengendapan aseton terdapat beberapa pita sedangkan hasil filtrasi gel menghasilkan 2 pita. Adanya beberapa pita hasil pengendapan aseton menunjukkan bahwa selain enzim ß-mananase masih terdapat enzim lain seperti ß-manosidase atau -galaktosidase. Hasil kolom filtrasi gel terdapat 2 pita mananase namun bukan terdiri atas dua polipeptida akan tetapi dua molekul enzim mirip (isoenzim) yang berperan dalam pemecahan manan. Semakin tebal pita hasil elektroforesis menunjukkan konsentrasi protein semakin tinggi. Hasil penentuan BM berdasarkan standar marker elektroforesis diperoleh pita pertama sebesar 120.06 kD dan pita kedua sebesar 81.24 kD.

Gambar 11 Elektroforegam dan zimogram hasil pemurnian mananase. Penanda ukuran molekul protein (M), ekstrak enzim kasar (EK) pengendapan aseton 70% (A), dan kolom filtrasi gel (FG).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Streptacidiphilus luteoalbus memproduksi enzim mananase dengan indeks manolitik 4 serta aktivitas tertinggi pada jam ke-69 dengan aktivitas 0.2168 U/ml. Pengendapan dengan aseton 70% merupakan konsentrasi terbaik untuk memekatkan mananase dari Steptadiciphilus luteoalbus dengan aktivitas spesifik sebesar 0.10 U/mg, dan pemurnian dengan sephadex-G75 memiliki aktivitas spesifik sebesar 0.19 U/mg. Kemurnian mananase hasil kolom filtrasi gel meningkat 2.80 kali. Mananase hasil pemurnian memiliki aktivitas optimum pada suhu 50 °C dan pH 6.5. Elektroforegram menunjukkan adanya 2 pita protein dengan berat molekul sebesar 120.06 kD dan 81.24 kD.

Saran

Pemurnian lebih lanjut perlu dilakukan sampai diperoleh mananase murni sehingga perlu dilakukan pemurnian dengan kromatografi penukar ion sebelum kromatografi filtrasi gel atau menggunakan gradien pH untuk kromatografi filtrasi gel. Selain itu agar pita elektroforegram terlihat dengan jelas maka enzim dari setiap tahap pemurnian perlu dipekatkan dengan liofiliasi.

DAFTAR PUSTAKA

Ambarawati D. 2005. Karakterisasi mananase Streptomyces sp. galur 451-3 [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Atac IA, Hodist R, Kristufek D, Kubicek CP. 1993. Purification and characterization of a

-Mannanase of Trichorderma reesei C-30. Appl Microbiol Biotechnol 39:58-62.

Aurora DD. 2003. Isolasi dan karakterisasi enzim mananase Bacillus pumilus DYP 2 [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss.

Dekker RFH, Richards GN. 1979. Hemicellulase; their occurrence,

14

purification, properties, and mode of action. Adv Carbohydr Chem Biochem 32:277-352.

Dennison C. 2002. A Guide to Protein Isolation. New York: Kluwer.

Duffaud GD et al. 1997. Purification and characterication of extremely thermostable

-mannanase, -mannosidase, and a-galactosidase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga neapolitana 5068. Applied and Environ Microbiol 63:169-177.

Downie B, Hilhorst HWM, Bewley JD. 1994. A new assay for quantifiying endo-ß-D-mannanase activiying using congo red dye. Phytochemistry 36:829-835.

Fahrurrozi. 2007. Pemurnian dan karakterisasi xilanase ekstraseluler dari Streptomyces sp. 234P-16 asal Padang [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Gherardini FC, Salyers AA. 1987. Purification and characterization of a cell-associated, soluble mannanase from Bacteroides ovartus. J Bacteriol 169:2038-2043.

Hilge M et al. 1998. High-resolution native and complex structures of thermostable -mannanase from Thermomonaspora fusca substrate specificity in glycosyl hydrolase family 5. Structure 6:1433-1444.

Janson JC, Ryden L. 1998. Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications. Ed ke-2. New York: John Wiley & Sons.

Jiang Z et al. 2006. High-level production, purification, and characterization of a thermostable -mannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34. Carbohydrate Polymers 30:1-9.

Kurakake M, Komaki T. 2001. Production of ß-mannanase and ß-mannosidase from Aspergillus awamori K4 and their properties. Current Microbiology 42:377-380.

Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid ke-1. Thenawijaya M, penerjemah.

Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principle of Biochemistry.

Manz A et al. 2004. Bioanaltytical Chemistry. London: Imperial College.

Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal chem 31:426-428.

Moreira LRS, Filho EXF. 2008. An overview of mannan structure and mannan-degrading enzyme systems. Appl Microbiol Biotechnol 70:165-178.

Nur MA, Adijuana H, Kosasih. 1992. Teknik Laboratorium. Bogor: Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor.

Ooi T, Kikuchi D. 1995. Purification and some properties of ß-mannanase from Bacillus sp. Word J Microbiol Biotechnol 11:310-314.

Pelczar MJ, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.

Petkowicz CLO et al. 2001. Linear mannan in the endosperm of Schizolobium amazonicum. Carbohydr Polym 44:107-112.

Puchart V et al. 2004. Purification and characterication of two form of endo-ß-1,4-mannanase from a thermotolerant fungus, Aspergillus fumigatus IMI 385708 (formerly Thermomyces lanuginosus IMI 158749). Biochemica et Biophysica Acta 1674:239-250.

Sachslehner A, Haltrich D. 1999. Purification and some properties of a thermostable acidic endo-ß-1,4-D-mannanase from Sclerotium (Athelia) rolfsii. FEMS Microbiology Letters 177:47-55.

Said G. 1987. Biondustri: Penerapan Teknologi Fermentasi. Bogor: Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor.

Schopes RK. 1987. Protein Purification Principle and Practice. New York: Springer Velag.

Stryer L, Tymoczko JL, Berg JM. 2002.

15

Biochemistry. Ed ke-5. New York: WH Freeman.

Suhartono MT. 1988. Pengantar Biokimia. Bogor: Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor.

Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor.

Sumardi. 2004. Isolasi, karakterisasi, dan produksi -mananase ekstraseluler dari Geobacillus strearothermophilus l-07 [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Talbot G, Sygusch J. 1990. Purification and characterization of thermostable ß-mannanase and -galactosidase from Bacillus stearothermophilus. Appl Environ Microbiol 56:3505-3510.

Tamaru Y, Araki T, Amagoi H, Mori H, Morishita T. 1995. Purification and characterization of an extracellular -1,4- mannanase from a marine bacterium, Vibrio sp. Strain MA-138. Appl Environ Microbiol 61:4454-4458.

Wenk MR, Fernandis AZ. 2007. A Manual for Biochemistry Protocols. Singapura: World Scientific.

Widhyastuti N. 2007. Purifikasi dan karakterisasi xilanase ekstraseluler Steptomyces sp. SKK1-8 asal Sukabumi [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Wijaya S. 2002. Isolasi kitinase dari Scleroderma columnare dan Trichoderma harzianum. Ilmu Dasar 3:30-35.

Zhang J, He Z, Hu K. 2000. Purification and characterization of ß-mannanase from Bacillus licheniformis for industrial use. Biotechnology Letters 22:1375-1378.

16

LAMPIRAN

17

Lampiran 1 Perhitungan aktivitas mananase

Aktivitas (U/ml) = manosaBMxt

xfpxxXkXs 10002)(

Aktivitas Total (U) = volume enzim (ml) x aktivitas (U/ml)

Total Protein (mg) = volume enzim (ml) x kadar protein (mg/ml)

Aktivitas Spesifik = )/( mgUproteinTotal

aktivitasTotal

Yield (Perolehan) = kasarekstrakaktivitasTotal

pemurnianaktivitasTotal

Tingkat kemurnian = kasarekstrakspesifikAktivitas

pemurnianspesifikAktivitas

Keterangan :

Aktivitas mananase : Jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu µmol manosa permenit (U/ml).

Xs : Kadar manosa sampel Xk : Kadar manosa kontrol t : Waktu inkubasi (30 menit) fp : Faktor pengenceran BM manosa : 180 g/mol

Lampiran 2 Morfologi Streptacidiphilus luteoalbus

Pertumbuhan Streptacidiphilus luteoalbus setelah 7 hari diinkubasi pada media

agar locust bean gum.

18

Lampiran 3 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian

Reagen dinitrosalisilat (DNS) (Miller 1959)

Sebanyak 10 g NaOH padat, 182 g KNa-tartrat, 0.5 g Na2SO3, 2 g fenol, dan 10 g

DNS dilarutkan dalam akuades sampai 1000 ml.

0.02 M bufer asetat pH 4

sebanyak 20.5 ml CH3COOH 0.02 M dan 4.5 ml CH3COONa 0.02 M dicampur

serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 ml. Pengaturan pH dilakukan dengan

1 N NaOH dan 1 N HCl.

0.02 M bufer asetat pH 5

sebanyak 7.4 ml CH3COOH 0.02 M dan 17.6 ml CH3COONa 0.02 M dicampur

serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 ml. Pengaturan pH dilakukan dengan

1 N NaOH dan 1 N HCl.

0.02 M bufer fosfat pH 6.0

sebanyak 21.925 ml Na2HPO4.2H2O 0.02 M dan 3.075 ml NaH2PO4.2H2O 0.02 M

dicampur serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 ml. Pengaturan pH dilakukan

dengan 1 N NaOH dan 1 N HCl.










sebanyak 4 ml Na2HPO4.2H2O 0.02 M dan 0.02 M NaH2PO4.2H2O 21 ml



0.02 M bufer fosfat pH 8




19

Lampiran 4 Kurva standar protein

Konsentrasi (mg/ml) Absorban Absorban terkoreksi

0.00 0.0004 0 0.05 0.0066 0.0062 0.10 0.1279 0.1275 0.15 0.3601 0.3597 0.20 0.6253 0.6249 0.25 0.9485 0.9481 0.30 1.2518 1.2514 0.35 1.5574 1.5570 0.40 1.7876 1.7872 0.45 2.0600 2.0596 0.50 2.3038 2.3034

y = 5.3863x - 0.3787

R2 = 0.9953

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

1.800

2.000

2.200

2.400

2.600

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500 0.550

Konsentrasi Protein (mg/ml)

OD

280

nm

20

Lampiran 5 Kurva standar manosa

konsentrasi (mg/ml) Absorban

0.00 0.0000 0.05 0.0233 0.10 0.1489 0.15 0.2755 0.20 0.4073 0.25 0.5860 0.30 0.6784 0.35 0.8614

y = 2.7741x - 0.129

R2 = 0.9961

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.900

1.000

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400

Konsentrasi manosa (mg/ml)

OD

540

nm

Lampiran 6 Perubahan pH media, jumlah mikroba, dan aktivitas mananase pada media locust bean gum 0.5 % pada pH 6.0

pH media pH media + Aktivitas Jam ke

(kontrol) Streptacidiphilus luteoalbus OD 660

mananase (U/ml)

0 6.00 6.10 0.1423 0.0079 6 6.00 6.23 0.4156 0.0885

23 6.43 7.22 0.3032 0.0810 29 6.67 7.32 0.4844 0.0200 46 6.77 7.87 0.3363 0.0068 52 6.73 7.85 0.3444 0.0886 69 6.86 8.16 0.9125 0.2168 75 6.90 8.05 1.3430 0.1178 92 6.90 8.05 1.0093 0.0401

21

Lampiran 7 Jumlah aseton yang ditambahkan dalam 10 ml ekstrak mananase kasar

Konsentrasi aseton (%v/v) Jumlah aseton (ml)

10 1.11 20 2.50 30 4.28 40 6.66 50 10.00 60 15.00 70 23.33 80 40.00 90 90.00

Lampiran 8 Hasil pengendapan mananase ekstrak kasar dengan aseton secara bertahap

Konsentrasi aseton (% v/v) Aktivitas mananase (U/ml)

0 0.0082 30 0.0271 40 0.0991 50 0.0375 60 0.0649 70 0.2670 80 0.2457 90 0.0635

Lampiran 9 Pengaruh suhu terhadap aktivitas mananase setelah pemurnian

Suhu ( °C) Aktivitas mananase (U/ml)

30 0.0204 40 0.0202 50 0.0228 60 0.0194 70 0.0185 80 0.0203

22

Lampiran 10 Pengaruh pH terhadap aktivitas mananase pada suhu 50 °C setelah

pemurnian

pH Aktivitas mananase (U/ml)

4.0 0.0173 5.0 0.0201 6.0 0.0189 6.5 0.0232 7.0 0.0197 7.5 0.0180 8.0 0.0194

Lampiran 11 Pereaksi untuk elektroforesis SDS-PAGE

Komposisi pereaksi untuk elektroforesis SDS-PAGE 1 Larutan A (30% b/v akrilamida dan 0.8% b/v bis-akrilamida)

Sebanyak 14.6 g akrilamida dan 0.4 g bis-akrilamida dilarutkan dalam 50 ml, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larut homogen.

2 Larutan B (bufer gel pemisah, TrisCl 2 M, pH 8.8) Sebanyak 75 ml larutan TrisCl pH 8.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)

ditambahkan dengan akuades hingga volume total 100 ml. 3 Larutan C (bufer gel penahan, TrisCl 1 M, pH 6.8) Sebanyak 50 ml larutan TrisCl pH 6.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)

ditambahkan dengan akuades hingga volume total 100 ml. 4 Amonium persulfat 10% (b/v) Sebanyak 0.1 g ammonium persulfat dilarutkan dalam 1 ml akuades. 5 Bufer elektroforesis

Sebanyak 1.803 g Tris base, 8.648 g glisin, dan 0.6 g SDS dilarutkan dalam 600 ml akuades lalu ditera hingga pH 8.3 dengan HCI 1M.

6 Bufer sampel Untuk SDS PAGE: 0.3 ml TrisCl 1 mM pH 6.8, 2.5 ml gliserol 50% (v/v), 1.0 ml

SDS 10% (b/v), 0.25 ml 2-merkaptoetanol, 0.5 ml biru bromofenol 1% (b/v), dan 0.45 ml akuades. 7 Larutan staining

Sebanyak 0.5 g coomasie briliant blue R-250 dilarutkan dalam campuran 150 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial, dan 300 ml akuades dengan volume total 500 ml.

8 Larutan destaining Komposisi larutan destaining terdiri atas 150 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial, dan 300 ml akuades dengan volume total 500 ml.

.

23

Lanjutan lampiran 11

Komposisi gel penahan dan pemisah SDS- PAGE

Komposisi Gel pemisah (10%) Gel penahan (4%) Larutan A Larutan B Larutan C Akuades Amonium persulfat 10 % TEMED

3.333 ml 2.500 ml

- 4.057 ml 0.100 ml 0.010 ml

0.67 ml -

1.25 ml 3.00 ml 50.0 µl

5.00 µl

Lampiran 12 Pereaksi untuk elektroforesis zimogram.

Komposisi pereaksi untuk elektroforesis zimogram. 1 Larutan A (30% b/v akrilamida dan 0.8% b/v bis-akrilamida) Sebanyak 14.6 g akrilamida dan 0.4 g bis-akrilamida dilarutkan dalam 50 ml,

kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larut homogen. 2 Larutan B (bufer gel pemisah, TrisCl 2 M, pH 8.8) Sebanyak 75 ml larutan TrisCl pH 8.8 dan 4 ml larutan SDS 10% (b/v)

ditambahkan dengan akuades hingga volume total 100 ml. 3 Larutan C (bufer gel penahan, TrisCl 1 M, pH 6.8) Sebanyak 50 ml larutan TrisCl pH 6.8 ditambahkan dengan akuades hingga

volume total 100 ml. 4 Amonium persulfat 10% (b/v) Sebanyak 0.1 g ammonium persulfat dilarutkan dalam 1 ml akuades. 5 Bufer elektroforesis

Sebanyak 1.803 g Tris base, 8.648 g glisin dilarutkan dalam 600 ml akuades lalu ditera hingga pH 8.3 dengan HCI 1M.

6 Bufer sampel Sebanyak 0.3 ml TrisCl 1 mM pH 6.8, 2.5 ml gliserol 50% (v/v), 0.25 ml 2-merkaptoetanol, 0.5 ml biru bromofenol 1% (b/v), dan 0.45 ml akuades.

7 Congo red 0.2% Sebanyak 0.5 g congo red dilarutkan dengan akuades hingga volumenya 250 ml. 8 NaCl 2% Sebanyak 10 g NaCl dilarutkan dengan akuades hingga volumenya 500 ml.

Komposisi gel penahan dan pemisah zimogram nondenaturan

Komposisi Gel pemisah (10%) Gel penahan (4%) Larutan A Larutan B Larutan C Substrat manan 0.3% Akuades Amonium persulfat 10 % TEMED

3.333 ml 2.500 ml

- 1.800 ml 4.057 ml 0.100 ml 0.010 ml

0.67 ml -

1.25 ml -

3.00 ml 50.0 µl

5.00 µl

24

Lampiran 13 Kurva standar marker elektroforesis dan perhitungan berat molekul sampel

Protein BM (kD) Log BM Rf rantai miosin 273.00 2.4362

0.1525

ß-galaktosidase 114.00 2.0569

0.2373

bovine serum albumin 84.00 1.9243

0.2712

glutamat dehidrogenase 61.00 1.7850

0.3390

Ovalbumin 47.30 1.6749

0.3898

gliseraldehida 3 fosfat dehidrogenase 38.90 1.5899

0.4746

prestained carbonic anhidrase II 31.30 1.4955

0.5932

tripsin inhibitor A 25.70 1.4099

0.6949

lisozim 17.40 1.2405

0.7966

Aprotinin 8.60 0.9345

0.9661

Sampel filtrasi gel 1 120.06 2.0794

0.2181

Sampel filtrasi gel 2 81.24 1.9098

0.3273

y = -1.5531x + 2.4181

R2 = 0.9282

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 1.000 1.100

Rf

Log

BM

Contoh perhitungan (sampel filtrasi gel 1) Persamaan kurva standar marker elektroforesis 4181.25531.1 xy

log BM Rf

log BM 4181.25531.1 x 4181.2)2181.0(5531.1

= 2.0794 BM = 120.06 kD

pemurnian dan karakterisasi mananase dari

Documents