laporan praktikum bioteknologi ligasi, digesti.docx

8/18/2019 Laporan Praktikum Bioteknologi Ligasi, Digesti.docx

1/23

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

MINGGU - 2

ISOLASI PLASMID, PURIFIKASI HASIL PCR, LIGASI, DIGESTI DAN ISOLASI

FRAGMEN DNA

Kelompok 8

BIOTEKNOLOGI KELAS A1

Agnes Rebecca Novalia 1306480862

Chavella Avatara 1306402545

Gerardo Laudus 130641134

!ilda Nur A"i"a 13063620Lid#a $arti%a 13063601

&etah 'utri &utia 13063646

&err# (lora 13063)631Rah*a +uci 13063))120

UNIERSITAS INDONESIA

FAKULTAS FARMASI

DEPOK

2!1"

ISOLASI PLASMID

I# PENDAHULUAN


2/23

+etia, organis*e *e*ili%i -NA #ang terleta% dala* inti sel atau nucleus #ang

disebut sebagai -NA %ro*oso*al. begitu ,ula ba%teri/ +elain dna %ro*oso*al ba%teri

uga *e*ili%i -NA e%stra%ro*oso*al/ 'las*id *eru,a%an -NA e%stra%ro*oso*al

#ang berbeda %ara%tern#a dengan -NA %ro*oso*al/ entu% ,las*id beru,a *ole%ul

-NA utas ganda sir%uler #ang beru%uran %ecil dan berat se%itar 1300 %b +nustad dan

+i**ons 2003. terda,at didala* sito,las*a dan da,at *elalu%an re,li%asi secara

autono* %arena adan#a suatu urutan -NA sebagai asal re,li%asi dan ,las*id uga

*eru,a%an salah satu vector dala* ,roses ,eng%lonan gen/

-ala* bidang biote%nologi. te%ni% %loning *i%roba *eru,a%an salah satu te%ni%

#ang u*u* dila%u%an untu% *enghasil%an ,rodu% hasil *ere%a#asa geneti%a/ 'ada

te%ni% ini. se%uens -NA #ang diingin%an disisi,%an %e dala* ve%tor sebelu* nantin#a

di,er%enal%an %e,ada sel/ e%tor #ang biasa diguna%an adalah ,las*id ba%teri/

'las*id ba%teri #ang biasan#a diguna%an dala* te%nologi -NA re%o*binan

*engguna%an E. coli sebagai host . sehingga dala* re%a#asa geneti%a ,las*id sering

diguna%an sebagai ve%tor untu% *e*baa *ole%ul -NA #ang diingin%an %e dala*

suatu sel inang/ 'enggunaan ,las*id dala* -NA re%o*binan dila%u%an %arena ,las*id

*e*ili%i tiga region #ang ber,eran ,enting untu% -NA %loning. #aitu. re,lication origin.

*ar%er #ang *e*ung%in%an adan#a sele%si biasan#a gen resisten antibioti% dan

region #ang *a*,u disisi,i oleh 7rag*en -NA dari luar/ +alah satu %ara%teristi%

,las*id. #aitu *e*ili%i R9 Origin of replication/ 9nti dari isolasi ,las*id ba%teri

adalah *enghancur%an *e*bran sel sehingga se*ua organel sel da,at %eluar :usu7

2001/

9solasi ,las*id adalah a%tivitas #ang *ela%u%an ,eng%lonan gen/ salah satu *etode

#ang ban#a% diguna%an dala* isolasi ,las*id saat ini adalah *etode alkaline lysis/

&etode ini ,erta*a %ali di,ubli%asi%an oleh irnboi* dan -oll# tahun 1) Nucleic

Acids Res/ ). 15131523/ &etode al%aline l#sis secara garis besar terbagi %e dala*

ena* taha,. #a%ni taha, k$l%&'()& *(k%e+& ( pem(e( )el, %(.(p +e)$)pe)& )el.

%(.(p l&)&) )el ( e(%$+()& DNA. %(.(p e%+(l&)()&, %(.(p p$+&/&k()&. dan %(.(p

pemek(%( DNA/ +ecara u*u*. isolasi ,las*id bertuuan *enge%stra% ,las*id dan

*e*isah%ann#a dari berbagai %o*,onen selular ba%teri lainn#a. se,erti ,rotein. le*a%.

http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/7/6/1513http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/7/6/1513http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/7/6/1513http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/7/6/1513


3/23

RNA. dan -NA %ro*oso*al/ $eberhasilan taha, isolasi bergantung ,ada su*ber bahan.

%onsentrasi bahan. stabilitas dan %adar %e*urnian ,rodu% a%hir/

II# PRINSIP

'rinsi, dala* *ela%u%an isolasi ,las*id adalah ,enghancuran dinding sel. lisis sel.

,e*bersihan debris sel. dan ,resi,itasi -NA/ 'rinsi,,rinsi, tersebut a%an dibahas lebih

lanut dala* bagian ,e*bahasan

III# TU0UAN

9solasi;e%stra%si -NA ,las*id bertuuan untu% *e*,eroleh -NA ,las*id dengan

%ualitas %e*urnian #ang bai% *engguna%an *etode *odi7i%asi Al%alin Lisis atau

*engguna%an %olo*%it

I# ALAT DAN BAHAN

1# Al(%

• +entri7uge *i%ro

•


4/23

P+o%okol Me%oe Alk(l& L&)&)

1/ +el >/coli -!5? ,DC1 ditu*buh%an dala* *ediu* LBA*, 100 =g;*l ,ada

3)EC secara aerobi% sela*a se*ala*/

2/ +eban#a% 8 tabung *i%ro dia*bil dan diberi label ,DC1 ,ada 4 buah tabung/

&asu%%an 1.5 *l %ultur ba%teri %e dala* tabung *i%ro/

3/ +el ba%teri di%u*,ul%an *elalui sentri7usi ,ada sentri7uge *i%ro ,ada 10000r,*

sela*a 2 *enit/ +u,ernatan dibuang sa*,ai tinggal ,eletn#a saa/

4/ 'ellet diresus,ensi%an dala* 110 =L larutan A dan dia*%an ,ada suhu ruang sela*a

510 *enit/5/ Larutan #ang telah disia,%an terdiri dari ca*,uran 4.25 *l d!2 sterilF 0.5 *l 10

+-+ F 0.25 *l 4N Na!

6/ +eban#a% 200 =L larutan dita*bah%an ,ada *asing*asing tabung *i%ro.

%e*udian tabung dibola%bali%%an dan secara ,erlahan terca*,ur%an sa*,ai teradilisis larutan *enadi bening dan %ental

)/ $e*udian diin%ubasi ,ada 0EC diatas ,ecahan es sela*a 510 *enit/


5/23

$ultur disia,%an dengan *engino%ulasi%an ba%teri %e *edia L/ Lalu. diin%ubasi

sela*a 24 a* sa*bil disha%ing/ $ultur ba%teri di*asu%%an %e tabung *i%ro dan

disentri7ugasi%an sela*a 30 deti% dengan %ece,atan 11/000 r,*/ +u,ernatan dibuang dan

,ellet diresus,ensi%an dengan bu77er A1/ Ca*,uran divorte/ u77er A2 dita*bah%an %e

dala* sus,ensi dan di%oco% ,erlahan tida% *engguna%an vorte/ $e*udian. bu77er A3

dita*bah%an dan di%oco% ,erlahan sa*,ai sus,ensi berarna %e,utihan/ Ca*,uran

disentri7ugasi sela*a 5 H 10 *enit dengan %ece,atan 11/000 r,*/ Lisat *urni

di*asu%%an %e minispin column-centrifuge/ Lalu. lisat dicuci dengan bu77er A4 atau

wash bu77er/ $e*udian ca*,uran disentri7ugasi/ Ca*,uran %e*udian di%ering%an dan

disentri7ugasi %e*bali/ u77er elusi dita*bah%an dan diin%ubasi sela*a 1 *enit/

Ca*,uran disentri7ugasi

I# ALUR KER0A

/coli -!5? ,DC1 di dala*

*ediu* LBA*, ,ada suhu 3)0c sela*a se*ala*

TAHAP

PEMANENAN

SEL

A*bil 8 tabung *i%ro dan diberi label 'uc1.

ta*bah%an 1.5 *l %ultur ba%teri %e dala* 4

buah tabun *i%ro

$u*,ul%an a%teri *elalui sentri7usi ,ada sentri7uge

*i%ro ,ada 10000r,* sela*a 2 *enit/ +u,ernatan dibuang

sa* ai tin al eletn a sa a/

TAHAP

RESUSPENSI

'ellet diresus,ensi%an dala* 110 =L larutan A

dan dia*%an ,ada suhu ruang sela*a 510

*enit/


6/23

II# Pem*(.()(

in%ubasi%an ,ada 0EC diatas ,ecahan es sela*a

510 *enit/


7/23

'las*id dari ba%teri E. coli -!5? #ang a%an di,eroleh sebagai hasil isolasi

adalah ,DC1/ Dntu% *enda,at%an ,las*id tersebut *a%a sel ba%teri harus dihancur%an

terlebih dahulu %e*udian dila%u%an ,uri7i%asi untu% *e*bersih%an ,las*id dari

%o*,onen sel lainn#a/ Dntu% *ela%u%an isolasi ini *a%a *etode #ang a%an diguna%an

adalah al%alin lisis/

-


8/23

E.coli.,e*anenan >/coli. dan ,e*urnian dari %onta*inan lain *elalui *etode lisis al%ali/

'las*id dari ba%teri E. coli -!5? #ang a%an di,eroleh sebagai hasil isolasi adalah

,DC1/

I3# DAFTAR PUSTAKA

$ar,. Gerald/ 2010/ Cell and Molecular Biology/ -enver. A+ @ :ohns Iile# J +ons Co/

&ali%. A/ 2016/ 'enuntun $era @ 9solasi 'las*id dan $loning -NA/ -e,o% @ (a%ultas

(ar*asi Dniversitas 9ndonesia

ron 77ect o7 !eat +hoc%


9/23

PURIFIKASI HASIL PCR

I# PENDAHULUAN

'uri7i%asi hasil 'CR *eru,a%an *etoda untu% *enga*,li7i%asi 7rag*en -NA

s,esi7i% dala* u*lah besar secara in vitro dari seu*lah %ecil te*,late aal/ 'erta*a

%ali dite*u%an oleh $ar# &ullis ,ada tahun 183/ 'ercobaan ini *engguna%an 'CR

%arena 'CR *e*ili%i %euta*aan sebagai beri%ut @

-a,at *enga*,li7i%asi 7rag*en -NA dala* a%turelati7 sing%at 2 a* -NA te*,late tida% ,erlu dala* %eadaan *urni

'rodu% 'CR da,at di digesti dengan en"i* restri%si.se%uen atau di %lon

&a*,u *enga*,li7i%asi single -NA *ole%ul e/g/single s,er*

'uri7i%asi hasil 'CR dila%u%an dengan *engguna%an Gel;'CR -NA

(rag*ents >%straction $it dari Geneaid 2008/ 'rosesn#a adalah ,enguraian

gel. ,engi%atan -NA. ,encucian -NA. dan elusi -NA/


10/23

III# TU0UAN

• 'uri7i%asi hasil 'CR adalah te%ni% #ang bertuuan untu% *e*,eroleh -NA hasil 'CR

-NA a*,li%on #ang *urni/

• &e*aha*i 'uri7i%asi !asil 'CR

I# ALAT DAN BAHAN

I#1# Al(%

+entri7us *i%ro


11/23

*engguna%an ,isau silet atau cutter #ang baru dan steril/ 9risan gel di,indah%an %e dala*

tabung *i%ro 1/5 *L baru dan steril/ 300 L da,ar -( dita*bah%an lalu di,uri7i%asi

dengan vorte dan diinbu%asi ,ada 55600C sela*a 1015 *enit hingga irisan gel terlarut

se*,urna/ +ela*a in%ubasi tabung *i%ro dibola%bali% setia, 23 *enit/ $e*udian

ca*,uran tersebut didia*%an dingin ,ada suhu %a*ar/ Ca*,uran tersebut di,i,et dan

di*asu%%an %e dala* %olo* -( #ang ter,asang ,ada tabung ,ena*,ang/ 'ada %ece,atan

*a%si*u* 13/000 r,* disentri7usi%an sela*a 30 deti%/ Cairan #ang terta*,ung

dibuang dan %olo* -( dite*,at%an %e*bali ,ada tabung ,ena*,ung/ 600 L da,ar

,encuci ash 'uffer #ang telah dita*bah etanol dita*bah%an dan disentri7usi %e*bali

,ada %ece,atan *a%si*u* sela*a 30 deti%/ Cairan #ang ter%u*,ul dibuang %e*bali dan

%olo* -( dite*,at%an %e*bali %e dala* tabung ,ena*,ung. ,ada %ece,atan *a%si*u*

sela*a 3 *enit disentri7us sa*,ai *e*bran %olo* *engering/ $olo* -( #ang telah

%ering di,indah%an %e dala* tabung *i%ro 1/5 *L #ang baru dan steril/ $e*udian 25 L

a%uabides steril dita*bah%an %e dala* bagian tengah dari *e*bran %olo* -( agar

,engenda,an ,ada dinding %olo* da,at dihindari/ iar%an a%uabides tersera,sela*a 2

*enit %e*udian ,ada %ece,atan *a%si*u* disentri7us sela*a 1 *enit untu%

*enda,at%an -NA *urni/ -NA disi*,an ,ada suhu 20oC/ -NA hasil ,uri7i%asi dia*ati

secara visual. lalu -NA dianalisa %e*bali dengan ele%tro7oresis agaros gel *ini/ :i%a

in7or*asi se%uens -NA a*,li%on di,erlu%an. *a%a da,at dila%u%an se%uensing -NA/

I# ALUR KER0A


12/23

Hasil PCR +loading buferdielektroforesiskan di gel

agarosa

Pita angdiinginkandi!otong"

di!inda#kanke ta$%ng

&ikro

Da!ar D'dita&$a#kan lal%

di!%ri(kasi)orte*"

ke&%diandiink%$asi

Didinginkan"di!i!et" di&as%kkan

ke kolo& D'

Sentrif%gasidi

kee!atan&aksi&%&

,-./000r!&1 " .0

detik

Cairanterta&!%ng

di$%ang"ta&$a#kan

da!ar !en%idan etanol"

sentrif%sike&$ali

Cairan terk%&!%ldi$%ang" te&!atkan

di ta$%ng!ena&!%ng"

sentrif%gasi sa&!ai&e&$ran&engering

Kolo& D' di!inda#kan"ta&$a#kan ak%a$idessteril ke $agian tenga#

&e&$ran kolo&" $iarkan 2&enit" sentrif%gasi

kee!atan &aksi&%&

Dida!atkanDNA" disi&!andi s%#% 20oC"

dia&ati"dianalisisdengan

elektroforesisagaros gel &ini

*&oee+#4om, 2!1"

II# PEMBAHASAN


13/23

ila hasil ,uri7i%asi *enunu%an ,ita tunggal #ang u%urann#a sesuai #aitu tida%

teradi ,erubahan u%uran setelah dila%u%an ,uri7i%asi *enunu%an baha ,uri7i%asi

berhasil dila%u%an %arena sa*,el tida% *engala*i degradasi/ 'ita hasil ,uri7i%asi terlihat

lebih tebal dan lebih terang #ang *engindi%asi%an baha ,engotor telah berhasil

dibersih%an atau dihilang%an/

T(*el 2# M()(l(. 5(6 )e+&6 %e+7(& ( pe5ele)(&(5(

&asalah 'en#elesaian

!asil rendah +el tida% lisis secara se*,urna. terlalu ban#a% sel ba%teri

#ang diguna%an

'roses ,uri7i%asi -NA tida%

beralan dengan bai%

1/ Adan#a %onta*inasi RNA sebelu* *engguna%an

bu7er '&1. ,eri%sa %e*bali RNase A #ang

dita*bah%an a,a%ah *asih la#a% atau sudah

%edaluarsa. dan uga terlalu ban#a% sel ba%teri #ang

dguna%an

2/ Adan#a %onta*inasi -NA geno* angan

*engguna%an sa*,el %ultur #ang sebelu*n#a sudah

ditu*buhi ba%teri

$olo* tersu*bat


14/23

10440305. htt,@;;d/doi/org;10/1016;+104403050000122)/

htt,@;;/sciencedirect/co*;science;article;,ii;+104403050000122)

>ng/bioneer/co*/ 2016/ *ccuBead+ ,ilica Coated Magnetic Bead / PonlineQ Available

at@ htt,@;;eng/bioneer/co*;,roducts;'rotein;&agneticeadstechnical/as,

PAccessed A,r/ 2016Q/

&ali%. A*arila/ 2015/ Penuntun era PC/$ Purifikasi PC/$ dan ,0,-P*!E / -e,o%@

Laboratoriu* &i%robiologi dan iote%nologi (a%ultas (ar*asi D9/

iagin. +/ n/d// !enomic 0&* Purification/ 1st ed/ Peboo%Q Available at@

htt,@;;science/*arshall/edu;*urra#e;lin%s207or20students;sa*antha

20Miagin20*ethod/,d7 PAccessed A,r/ 2016Q/

!ida#atulloh. +#ari7/ PC/ and Primer 0esign/

htt,s@;;/acade*ia/edu;))22484;'CRSandS'ri*erS-esign dia%ses ,ada

+abtu. 0 A,ril 2016 ,u%ul 22/01

AM*arina. Arie/. d%%/ loning 1ragmen 0&* Mikrosatelit *2uilaria malaccensis/

htt,s@;;/acade*ia/edu;162085;$loningS(rag*enS-NAS&i%rosatelitSAMuil

ariaS*alaccensis dia%ses ,ada +abtu. 0 A,ril 2016 ,u%ul 22/35

PEMOTONGANDIGESTI DNA PLASMID DENGAN EN9IM

RESTRIKSI

I# PENDAHULUAN

http://dx.doi.org/10.1016/S1044-0305(00)00122-7http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044030500001227https://www.academia.edu/7722484/PCR_and_Primer_Designhttps://www.academia.edu/9162085/Kloning_Fragmen_DNA_Mikrosatelit_Aquilaria_malaccensishttps://www.academia.edu/9162085/Kloning_Fragmen_DNA_Mikrosatelit_Aquilaria_malaccensishttp://dx.doi.org/10.1016/S1044-0305(00)00122-7http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1044030500001227https://www.academia.edu/7722484/PCR_and_Primer_Designhttps://www.academia.edu/9162085/Kloning_Fragmen_DNA_Mikrosatelit_Aquilaria_malaccensishttps://www.academia.edu/9162085/Kloning_Fragmen_DNA_Mikrosatelit_Aquilaria_malaccensis


15/23

-NA hasil isolasi *asih beru,a se%uens #ang ,anang dengan 7rag*en7rag*en

#ang saling beri%atan/ 'e*otongan dengan suatu en"i* ,ada -NA tersebut dila%u%an

untu% *enghasil%an se%uens -NA tertentu #ang s,esi7i%/ >n"i* retri%si da,at *engenali

situs ,engenalan ,ada -NA secara s,esi7i% dan *e*otongn#a secara s,esi7i%/-igesti *eru,a%an ,roses ,e*otongan 7rag*en -NA dengan *engguna%an suatu

en"i* %husus #aitu en"i* restri%si/ >n"i* restri%si #ang diguna%an #aitu en"i* restri%si

endonu%lease #ang a%an *engenali dan *e*otong 7rag*en -NA ,ada se%uens #ang

s,esi7i%/ (rag*en #ang di,otong a%an digabung%an dengan suatu 7rag*en -NA lain

#ang ber,eran sebagai ve%tor/ e%tor *eru,a%an *ole%ul -NA #ang da,at bere,li%asi

secara autono* #ang a%an *e*7asilitasi ,roses *ani,ulasi dan identi7i%asi *ole%ul

-NA re%o*binan #ang terbentu% $lug J Cu**ings. 14/

n"i* restri%si ti,e 9 *engenali suatu -NA ,ada suatu

lo%asi secara aca% ,ada bebera,a ara% dari situs ,engenalann#a/ >n"i* restri%si ti,e 99

*engenali suatu se%uens s,esi7i% dan *e*otong dengan te,at %edua untai di dala*

se%uens/ >n"i* ti,e ini. situs ,engenalann#a beru,a ,alindro*i% #ang *e*baca secara

sa*a arah 5T %e 3T ,ada untai %o*,le*enter/ >n"i* restri%si ti,e 999 *engenali urutan

-NA #ang s,e7isi% dan *e*otong di de%at situs ,engenalann#a. biasan#a se%itar 25 b,/

-ari 3 enis. en"i* ti,e 99 #ang sering diguna%an ,ada te%ni% geneti%a/ +atu diantaran#a

en"i* #ang dite*u%an berasal dari >/coli dan telah diberi na*a >coR9 'ierce. 2002/

II# PRINSIP

'e*otongan 7rag*en -NA *engguna%an en"i* restri%si #aitu en"i* restri%si


s,esi7i%/ +itus ,engenalann#a beru,a ,alindro*i% #ang *e*baca secara sa*a arah 5T %e

3T ,ada untai %o*,le*enter dan *enghasil%an ,otongan uung %ohesi7 sticky end dan

uung rata 'lunt end /

III# TU0UAN

'e*otongan -NA 'las*id dengan en"i* restri%si bertuuan untu% *e*,eroleh

7rag*en -NA ,las*id #ang tergolong *enadi linier agar sia, untu% disisi,i dengan


16/23

7rag*en -NA sisi,an/ n"i* endonu%lease restri%si >R@ a*!9. >coR9

c/ u77er *asing*asing >R

d/ d!2 steril atau 1 ,! 8e/ +tandar u%uran *ole%ul -NA

Al(%

a/ 'i,et *i%ro 020 =l b/ 'i,et *i%ro 20200 =l

c/


17/23

A$il DNA !UC-3 2 4l" as%kkan ke ta$%ng ikro

Mas%kkan en5i restriksi

Ta$a#kan 2 4l -0* $%6er

Ta$a#kan dH27 steril 8 4l

Ink%$asikan !ada .9oC: ini% 2 ;a

2/ 9n%ubasi%an ,ada 3)oCF *ini*u* 2 a*/ 9ngat tida% se*ua en"i* restri%si o,ti*u*

,ada suhu 3)oC/ sela*a *enunggu in%ubasi. sia,%an gel/3/


18/23

II# PEMBAHASAN

>n"i* restri%si #ang diguna%an ,ada ,ra%ti%u* ini adalah >coR9 dan a*!9/

>n"i* >coR9 *e*otong -NA ,ada bagian #ang urutan basan#a adalah GAA


19/23

'e*otongan 7rag*en -NA *engguna%an en"i* restri%si #aitu en"i* restri%si


s,esi7i%/ >n"i* >coR9 *e*otong -NA ,ada bagian #ang urutan basan#a adalah

GAA


20/23

dengan uung tu*,ul 'lunt end /


21/23

DNA =ektor

Ta$a#kan DNA Sisi!an

T8 DNA Ligase - 4l

Ta$a#kan 8 4l -0?-


22/23

II# PEMBAHASAN

'ada ,ra%ti%u* ligasi. en"i* #ang diguna%an untu% ligasi adalah n"i* ini *eng%atalisasi ,e*bentu%an

i%atan %ovalen antara gula dengan 7os7at dari nu%leotida #ang berde%atan. sehingga

terbentu% i%atan ,hos,odiester di*ana satu nu%leotida *e*ili%i uung 5T ,hos,hate

bebas dan nu%leotida lain *e*ili%i uung 3T gugus hidro%sil/ Ligasi berhasil bila %eduauung 7rag*en -NA #ang a%an disa*bung%an ber%o*,le*en/

&e%anis*e


23/23

se%itar 8/ :i%a dilarut%an dala* d!2 ada ,eluang untu% berubahn#a ,!/ 9ni da,at teradi

%arena -NA dan RNA *e*ili%i si7at asa* le*ah. #ang dala* a%tu la*a da,at

*en#ebab%an degradasi -NA;RNA/

III# KESIMPULAN

Ligasi *eru,a%an ,en#a*bungan dua uung -NA #ang se*ulan#a ter,otong oleh

en"i* ligase/ >n"i* ligase #ang diguna%an adalah ngleood cli77s/

&ali%. A/ 2016/ Protokol era Bioteknologi/ -e,o%@ Laboratoriu* &i%robiologi dan

iote%nologi (a%ultas (ar*asi Dniversitas 9ndonesia/

'ierce. A/ 2002/ !E&E4"C, * Conceptual *pproach$ 5th Ed / 'a,erbac%/

laporan praktikum bioteknologi ligasi, digesti.docx

Documents