praktikum bioteknologi

24
PERCOBAAN EKSTRAKSI PROTEIN INTRASELULAR

Upload: iera-chanz

Post on 14-Feb-2016

267 views

Category:

Documents


18 download

DESCRIPTION

laporan praktikum bioteknologi, ektraksi protein intraseluler, elektroforesis protein

TRANSCRIPT

Page 1: Praktikum Bioteknologi

PERCOBAANEKSTRAKSI PROTEIN INTRASELULAR

Page 2: Praktikum Bioteknologi

TUJUAN PRAKTIKUM

Mahasiswa dapat mengetahui dan mampu melakukan ekstraksi

protein intraselular

Page 3: Praktikum Bioteknologi

ALAT DAN BAHANAlat : • Mikropipet• Tip biru• Eppendorf• Sentrifuge dingin• Inkubator goyang• Ultrasonik • Homogenizer

Bahan :• Bakteri E-coli• PBS steril

Page 4: Praktikum Bioteknologi

PROSEDUR KERJADibiakkan bakteri tunggal E-coli dalam 10 ml media LB dan

inkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang dengan kecepatan 150 rpm (dilakukan sehari sebelumnya)

Dimasukkan biakan bakteri ke dalam tabung eppendorf 1,5 ml dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan

12.000 rpm

Dibuang supernatant dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas

kertas tissue dengan posisi terbalik

Page 5: Praktikum Bioteknologi

Diulangi prosedur diatas hingga biakan bakteri habis untuk mendapatkan pellet sel bakteri

Diresuspensi pellet bakteri dengan larutan PBS pH 7,4 hingga sempurna

Dilisis sel dengan sonikasi menggunakan frekuensi 2,5 – 3 hz selama 30 detik

Dihentikan selama 30 detik selanjutnya di sonikasi lagi selama 30 detik sehingga sel pecah

Page 6: Praktikum Bioteknologi

Dilakukan selama 10 kali dalam suhu dingin

Dipindahkan suspense protein ke dalam tabung eppendorf dan disentrifugase pada 10.000 rpm selama 5 menit pada

suhu 4oC

Dikumpulkan supernatant untuk proses selanjutnya

Page 7: Praktikum Bioteknologi

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan percobaan ekstraksi protein intraseluler. Isolasi protein ini dari bakteri E.coli. Isolasi protein bertujuan untuk memisahkan protein dari makromolekul lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dan protein dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analisa. Mula – mula dilakukan penanaman bakteri yang dilakukan sehari sebelum praktikum selama 18 jam. Penanaman koloni tunggal bakteri E.coli dilakukan dalam 10 mg media LB cair dari media LB padat dan di inkubasi selama 18 jam pada suhu 37oC dengan inkubator goyang pada kecepatan 150 rpm.

Page 8: Praktikum Bioteknologi

Pada saat praktikum, praktikan melakukan pemanenan bakteri dari media LB cair yang telah dilakukan pada hari sebelumnya. Pemanenan dilakukan dengan cara memasukkan biakan ke dalam mikrotube sebanyak tiga mikrotube. Lalu, setelah itu di sentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Setelah itu, supernatant dibuang dan didapatkan pellet sel bakteri. Pelet tersebut dijadikan satu, langkah ini dilakukan sampai semua biakan bakteri dalam media habis.

Page 9: Praktikum Bioteknologi

Setelah dilakukan pemanenan, pellet sel bakteri di resuspensi dengan menggunakan larutan PBS pH 7,4. Larutan yang digunakan sebanyak 1 ml untuk ketiga mikrotube. Diresuspensi hingga sempurna. Lalu, dijadikan satu pada tabung untuk sonikasi atau tabung sentrifuge.

Page 10: Praktikum Bioteknologi

Selanjutnya, bakteri di lisiskan menggunakan metode sonikasi. Terdapat 2 cara untuk memecah atau melisis sel yaitu secara mekanik dengan sonikasi dan secara kimia dengan menambahkan zat kimia tertentu (DTT) ataupun enzim (lisozim).Pada praktikum ini dilakukan dengan metode sonikasi, Sonikasi dilakukan pada frekuensi 2,5 – 3 hz selama 30 detik, kemudian diberi jeda berhenti selama 10 detik, dan dilanjutkan sonikasi kembali selama 30 detik. Langkah tersebut dilakukan secara berulang sebanyak 10 kali pada suhu dingin dan menggunakan alat yaitu sonic raptor.

Page 11: Praktikum Bioteknologi

Setelah itu, suspensi yang mengandung protein setelah disonikasi dipindahkan ke dalam mikrotube dan disentrifuge kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC.Supernatan yang dihasilkan kemudian dipindahkan ke dalam mikrotube baru dan kemudian mikrotube yang berisi protein disimpan dalam suhu -20oC untuk digunakan pada analisis selanjutnya.

Page 12: Praktikum Bioteknologi

KESIMPULAN• Penanaman dari bakteri E.coli diperoleh

hasil yang baik karena tidak terjadi adanya kontaminan pada bakteri.

• Ekstraksi protein intraseluler dikatakan berhasil apabila setelah di elektroforesis terbentuk pita.

• Diperoleh hasil berupa pelet sel ,yang digunakan untuk analisis selanjutnya dan siap untuk di elektroforesis.

Page 13: Praktikum Bioteknologi

DAFTAR PUSTAKA• Cappette, DR. 2005. Measuring

Rlative Motility of Protein Bonds.• Sudjadi. 2008. Bioteknologi

Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Koniskus.

Page 14: Praktikum Bioteknologi

ELEKTROFORESIS PROTEIN

Page 15: Praktikum Bioteknologi

Alat dan Bahan Alat :1. Alat Elekroforesis Protein 2. Vial3. Mikropipet4. Mikrotube5. Tip

Bahan :• Aquadest• Separating Buffer • Stacking Buffer• SDS 10%• Acrylamid-bisacrylamide 30%• TEMED

•APS 10%•Larutan staining •Larutan destaining•Glisin•Marka protein•Protein hasil isolasi

Page 16: Praktikum Bioteknologi

CARA KERJA• Pembuatan Gel SDS-PAGE

Kaca untuk pencetak gel dipasang pada alat cetakan

Alat cetakan di tes kebocoran dengan memasukkan aquades diantara kedua kaca dan dibiarkan beberapa saat. Apabila tidak

bocor, air dibuang dan dibersihkan dengan menyerapnya menggunakan tissue

Disiapkan separating gel 12% (b/v) dan stacking gel 4 % sebanyak 5 ml dengan komposisi sebagai berikut :

Page 17: Praktikum Bioteknologi

Bahan Separating gel 12%

Stacking Gel 4%

Aquadest 1975 µL 1380 µL

Separating Buffer (1,5 M Tris HCl pH 8,8)

938 µL -

Stacking Buffer (0,5 M TrisHCl pH 6,8)

- 250 µL

10% SDS 50 µL 20 µL

30% Acrylamid-bisacrylamide 2 mL 335 µL

TEMED 50 µL 2,5 µL

10% APS 5 µL 15 µL

Page 18: Praktikum Bioteknologi

Stacking gel dibuat seperti komposisi diatas dan APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir dan dihomogenkan dengan memipet naik-turun

Setelah homogen segera masukkan kedalam cetakan hingga penuh

Separating gel dibuat dengan mencampurkan seluruh bahan diatas dimana APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan memipet naik turun

secara perlahan dan larutan harus segera dituang ke alat cetakan.

Separating gel dimasukkan ke cetakan hingga mencapai garis batas warna hijau (sekitar 0,5 mm dari ujung sisir pencetak sumur gel pada stacking gel)

Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan yang rata

Separating gel didiamkan hinga memadat (sekitar 30 menit), setelah memadat aquadest dibuang

Sisir pencetak sumur kemudian diselipkan pada stacking gel secara hati-hati

Stacking gel didiamkan hingga memadat (±15 menit) dan sisir pencetak sumur diambil

Page 19: Praktikum Bioteknologi

• Pembuatan Dapar Elektroforesis Timbang 3 g tris, 14,4 g glisin dan1 g

SDS

Larutkan dengan aquades hingga 1 liter

Page 20: Praktikum Bioteknologi

• Proses ElektroforesisProtein hasil overproduksi sebanyak 20 µL ditambah dengan 5 µL loading dapar 5x dan

diapanskan pada suhu 90-95oC selama 5-10 menit

Marka protein masukkan ke dalam sumur gel sebanyak 10 µL

Protein-protein tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel sesuai dengan kode yang telah ditentukan

Ambil gel dan pindahkan ke dalam kotak destaining, biarkan selama semalam atau hingga pita protein dapat terlihat dengan jelas

Amati pita protein yang terbentuk, kemudian dibandingkan dengan pita protein marka untuk menentukan berat molekulnya

Running sampai batas atau 1 jam dengan kondisi 60 volt

Keluarkan gel dari alat, rendam dalam larutan staining sampai terlihat pita (30 menit)

Page 21: Praktikum Bioteknologi

HASIL PENGAMATAN • Data hasil elektroforesis protein

Page 22: Praktikum Bioteknologi

Sampel A4

Marka protein

Page 23: Praktikum Bioteknologi

PEMBAHASAN • Pada praktikum kali ini kami melakukan elektroforesis

protein yang merupakan ekstrak protein dari praktikum sebelumnya. Hasil elektroforesis protein didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yangsama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakanmolekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruhmedan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi padazona atau pita yang sama atau berdekatan.

Page 24: Praktikum Bioteknologi

• Marka yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah SeBlue LC5625