laporan ppb akhir enzim candro.docx

8/18/2019 LAPORAN PPB AKHIR ENZIM CANDRO.docx

1/23

1

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

ELICANDRO AMBARITA (G84130084)KARTIKA ANGGRAENI (G84120033)

ISOLASI, PURIFIKASI, DAN KARAKTERISASI ENZIMINERTASE RAGI Saccharomyces cerevisiae


2/23

PENDAHULUAN

Ragi merupakan sumber penting penyedia enzim. Enzim dihasilkan oleh sel-sel

yang hidup baik hewani maupun nabati. Bila enzim diberikan pada campuran organik tertentu, kegiatan campuran organik tersebut biasanya akan meningkat walaupun tidak

cenderung memisahkan. Enzim hanya aktif dalam larutan, peka terhadap panas, dan

peka terhadap pH. Enzim yang terdapat dalam ragi salah satunya enzim inertase. !ama

lain enzim inertase adalah beta-fruktofuronosidase Enzim ini adalah enzim intraseluler

yang dapat mengubah atau memecah sukrosa men"adi glukosa dan fruktosa #gula

inert$. %ula inert sebagian besar digunakan di industri makanan, minuman, dan

konersi. %ula inert dapat diproduksi dengan proses kimia menggunakan katalisis

asam atau proses biokimia menggunakan katalisis inertase. &ikroorganisme yang

mampu menghasilkan enzim inertase adalah Saccharomices cerevisiae yang terikat

pada dinding selnya #'olaina dan &c(abe )**+$.

nertase atau β -fruktofuranosida fruktohidrolase merupakan enzim yang

mengkatalis ikatan antara molekul α --glukosa dan β --ruktosa dari fruktosa

dengan cara menghidrolisisnya men"adi monosakarida-monosakarida glukosa dan

fruktosa. Enzim ini "uga menhidrolisis β

-fruktan seperti rafinosa men"aedi gula-gula

sederhana. nertase tumbuhan mengkatalis hidrolisis pemecahan ikatan pada sukrosa

yang merupakan bentuk transport utama dari karbohidrat pada tumbuhan tingkat tinggi.

/ukrosa ditranspor dari "aringan sumber #daun dewasa$ melalui floem ke "aringan sink

yang lain #akar, batang, organ reproduksi, dan organ penyimpanan egetatif$. Enzim ini

erperan dalam metabolisme karbohidrat tumbuhan karena dalam akuola sel tumbuhan

ter"adi reaksi pemecahan sukrosa dalam pembentukan fruktan. /ukrosa merupakan

produksi akhir asimilasi karbon #($ pada proses fotosintesis yang ter"adi di daun dan

bentuk karbohidrat yang mudah ditransportasikan ke "aringan simpan atau sink tissues

0rgan penting seperti buah atau umbi akan memiliki aktiitas inertase yang tinggi. Hal

ini ditun"ukkan pada buah anggur yang akan meningkat aktiitas inertasenya ketika

mendekati maturasi buah #Heldt dan Heldt )**$.

Enzim inertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir

Saccharomyces ceriviseae. nertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat

tinggi, dan beberapa sel hewan #2ee Huang et al. )***$. 'emanfaatan enzim secara

komersial terus dipela"ari dan diterapkan yaitu pemanfaatan enzim untuk proses

enzimatik pada industri makanan, minuman, farmasi, dan biokimia. /alah satu contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan buah-buahan hi"au yang dipanen, pelayuan

daging, pengawetan ke"u, pencegahan kekeruhan bir, dan pembentukan tekstur gula.

/edangkan pemanfaatan enzim inertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan

minuman khususnya pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi

asam laktat dari fermentasi sirup tebu #3costa et al. )***$. 4u"uan dari praktikum ini

adalah mengisolasi dan melakukan purifikasi inertase dari ragi, menentukan aktiitas

dan kuantitas protein inertase, serta melakukan karakterisasi inertase berdasarkan

bobot molekulnya.


3/23

5

METODE

!"#$% &"' T*"$

'raktikum ini dilakukan di 2aboratorium Biokimia epartemen Biokimia

akultas &atematika dan lmu 'engetahuan 3lam nstitut 'ertanian Bogor. 6aktu

pelaksanaannya yaitu setiap hari 7amis, mulai 18 ebruari s9d )) &aret )*18 pukul

1*.** 6B - selesai.

B"+"'

Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini antara lain ragi komersial dengan

merk dagang ermipan, pasir kuarsa, toluen, akuades, batu es, asam asetat 1 !,

amonium sulfat, ekstrak kasar, fraksi amonium sulfat *-)* :, )*-;* :, ;*-8* : dan

8*- running bufer pH


4/23

P''%+"' &'"' A.'% S%5"$

F-"#/'"/ E#/$-"# I'-$"/ R" %aram amonium sulfat digerus dengan

mortar. /ebanyak *.+5 g garam amonium sulfat ditambahkan kedalam m2 ekstrak

fraksi untuk ke"enuhan *-)*:. 7emudian didiamkan selama1* menit dan disentrifuse

pada kecepatan 1)** rpm selama 1 menit kemudian ditambahkan *.* & 4ris-H(l pH+. dan pelet hasil sentrifugasi dipisahkan. 'elet di"adikan sebagai fraksi a sedangkan

supernatannya di ditambahkan garam amonium sulfat sebagai fraksi b sesuai dengan

tabel tingkat ke"enuhan. 'embuatan fraksi dilakukan sampai tingkat ke"enuhan 8*-


5/23

*.1*, dan *.*C reagen ( ditambahkan ke dalam setiap tabung sebanyak m2. /etiap

tabung dihomogenkan dengan orte> lalu diinkubasi selama menit pada suhu ruang.

'enambahan reagen harus diatur dengan baik. 'ada lima menit terakhir ditambahkan *.

m2 reagen ke tabung 1 dan dan ke tabung selan"utnya dengan selang waktu 5* detik

untuk tiap tabung. /etiap tabung dihomogenkan kembali dengan orte> lalu diinkubasiselama 5* menit pada suhu ruang. 3bsorbansi setiap standar diukur pada D+** nm.

P'%#%-"' #"&"- *-.$' '9 '-$"/ raksi 1, ), dan 5 hasil

pengenceran disiapkan. Enzim inertase * kali. /ebanyak *.1* m2 fraksi ditambahkan

dengan ;.* m2 akuades lalu diorte>. /ebanyak 1 m2 larutan untuk setiap fraksi

digunakan dalam pengukuran kadar protein. 7emudian sebanyak tu"uh buah tabung

reaksi bersih dan kering disiapkan untuk pembuatan blanko dan penger"aan duplo dari

ketiga fraksi. Blanko disiapkan dari *.* m2 akuades. /ebanyak *.* m2 dari fraksi 1,

), dan 5 dimasukkan ke dalam tabung masing-masing kemudian ditambahkan *.; m2

akuades ke dalamnya. /elan"utnya setiap larutan dihomogenkan dengan orte>.

/ebanyak m2 reagen ( ditambahkan ke dalam setiap tabung. 4abung diinkubasi pada

suhu ruang selama menit. /elan"utnya *.* m2 reagen ditambahkan ke dalam setiaptabung lalu tabung dihomogenkan dengan orte> kembali. 4abung kembali diinkubasi

pada suhu ruang selama menit. 3bsorbansi setiap larutan diukur pada D+** nm.

K'$#" E'9 I'-$"/

P%"$"' B"'#. S*#$-.5.$.$- K'$#" I'-$"/ R" /ebanyak 1

m2 akuades diinkubasi selama 1* menit pada suhu ruang, kemudian ditambahkan

kupritartrat 1 m2. (ampuran ini dihomogenkan menggunakan vortex dan dididihkan

selama < menit. /etelah diangkat dari penangas air, ke dalamnya ditambahkan

fosfomolibdat 1 m2. 2alu, dihomogenkan kembali dan ditambahkan akuades sebanyak

+ m2. 2arutan dihomogenkan kembali kemudian didinginkan dan diukur absorbansinya

pada pan"ang gelombang 88* nm.

P%"$"' B"'#. A#$$"/ K'$#" I'-$"/ R" /ebanyak + buah tabung

reaksi disiapkan untuk blanko ini. 7emudian, substrat berupa sukrosa *. &

ditambahkan ke dalam masing-masing tabung dengan konsentrasi sebagai berikutF

tabung 1 sebanyak )* G2, tabung ) sebanyak ;* G2, tabung 5 sebanyak 8* G2, tabung ;

sebanyak


6/23

ditambahkan ke dalam ketu"uh tabung reaksi sebanyak 1** G2. (ampuran ini

dihomogenkan menggunakan vortex dan dididihkan selama < menit. /etelah diangkat

dari penangas air, ke dalamnya ditambahkan fosfomolibdat 1 m2. 2alu, dihomogenkan

kembali dan ditambahkan akuades sebanyak + m2 dan diukur absorbansinya pada 88*

nm.

P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/

P%"$"' G. Running gel dibuat dari beberapa bahan yaitu 3krilamida 1):

sebanyak running buffer +8* =l, 1* : // )** =l,

dd H)0 5.) =l. (ampuran dari running gel tersebut diaduk kemudian diberikan

3mmonium 'errosulfat 1** =l dan 4E&E 8 =l untuk mencegah pembentukan

gelembung udara. /tacking gel dibuat dari bahan yaitu %el sebanyak ;.55 ml #untuk

ketebalan gel sebesar *.+ mm$, larutan monomer *. ml , ;> running buffer 1.5* ml, 1*

: // 8** =l, dd H)0 ).1 =l, 3mmonium 'errosulfat 5* =l dan 4E&E 5 =l.

(ampuran dari running gel dituang kedalam plat kaca dengan pipet kaca hingga

mencapai "arak ; cm dari atas kaca. 7emudian diberikan penambahan n-butanol hingga permukaan atas gel yang belum membeku tertutup lalu dibiarkan membeku dalam

waktu 1. "am. 7etika running gel membeku, n-butanol dibuang, dibilas dengan

menggunakan running gel oerlay dan ditambahkan sebanyak 1 m2 running gel oerlay

dan dibiarkan hingga stacking gel siap digunakan. 7emudian dua buah sumur gel

disiapkan dan setiap sumurnnya diisi dengan standar B& protein campuran dan yang

kedua dengan B& protein inertase.

E#$-.5.-// SDS:PAGE (ampuran sampel protein #)*-1**Gg atau *-1**Gg$

dengan ) kali treatment buffer didalam tabung eppendorf, dididihkan didalam be"ana air

selama * detik. /ampel disimpan pada *( hingga siap digunakan. /ampel protein dan

standar dipipet sekitar G2 dan diletakkan ke dalam sumur gel secara hati-hati. /etelah

sampel seluruhnya diletakkan kedalam sumur gel, sistem elektroforesis dirakit dan

dihubungkan dengan power supply #*-1** olt$

P7"-'""' /$"'&"- 'enyimpanan gel dilakukan di dalam larutan fiksasi

pewarnaan cepat. %el *.+ A 1.* mm digoyang perlahan selama 1*-1 menit atau 5*-8*

min untuk gel 1. mm. 2arutan fiksasi diganti dengan larutan pewarnaan coomassie

blue. 'enggoyangan dilakukan ) "am hingga ); "am sampai pita protein terlihat. 2arutan

pewarnaan diganti dengan larutan destaining #F;F1, methanolFH)0Fasam asetat$

hingga background gel "ernih. 2arutan tersebut disimpan selama ); "am dalam asam

asetat +: atau ddH)0 kemudian dilakukan pengamatan dan penentuan B& berdasarkan

Rm dari B& 'rotein standar terhadap Rm inertase ragi.

HASIL

I/."/ &"' P"'"/"' E#/$-"#/ I'-$"/

4abel 1 olume fraksi ekstrak inertase ragi

Volume (mL)Fraksi I 9.9 7.0Fraksi II 7.0 5.0


7/23

+

P''%+"' &'"' A.'% S%5"$

4abel ) ata hasil fraksinasi amonium sulfat

Meja Fraksi Ulangan Volume(mL)Bobot ammonium

sulfat (g) 0!"0 #

5.0 0.575"" 5.0 0.575"

"0!"0 #

5.0 0.5700" 5.0 0.5700

"0!$0 # 5.0 0.%"00" $.5 0.5500

&0!$0 #

5.0 .""00" 5.0 .""00

$0!%0 # 5.5 0.7&00" 5.5 0.7&00

$ 0!%0 #

5.0 .9500

" 5.0 .9500

%0!'0 # 5.0 0.7"00" 5.0 0.7"00

(ontoh perhitungan penentuan bobot ammonium sulfat fraksi * A )*: FBobot amonium sulfat di tabel

Volume standar di tabel× Volume fraksi sebelum sentrifugasi =

114 gram

1000 mL × 5 mL = 0.5752 gram

U A#$$"/ I'-$"/ &'"' M$.& F.' !%

4abel 5 3ktiitas inertasemetode ollin 6u D88* nm

amel*teruk

ur

*terkore

ksi

*terkore

ksiblanko

+glukosa, (mM)

Unitakti-itas(unitmL)

Blanko sektro 0 0 0 0 0

blanko /rue 0."'0 0."'0 0."' 0.0$'0 !

1rue 0.&5 0.&5 0.07 0.0% !0.0""7

1rue " 0.&&" 0.&&" 0.05" 0.00'& !0.0"$'

Blankoemanasan

0.&$ 0.&$ 0.&$ 0.05'% !

Fraksi emanasan

0.&$& 0.&$& 0.00" !0.000$ 0.0&%9

Fraksi emanasan"

0.&'9 0.&'9 0.0$' 0.007% 0.0&9

Blanko 0!"0# 0.0$5 0.0$5 0.0$5 0.007 !

Fraksi 0!"0#. 0."7" 0."7" 0.""7 0.0&'' 0.09'

Fraksi 0!"0#." 0.&& 0.&& 0."%' 0.0$59 0.0"$&


8/23

Blanko fraksi "0!$0#

0.50& 0.50& 0.50& 0.0'%' !

Fraksi "0!$0#. 0.59 0.59 0.0'' 0.0$5 !0.0$5"

Fraksi "0!$0# "." 0.597 0.597 0.09$ 0.05% !0.0$$5

Blanko fraksi $0!%0#

0.009 0.009 0.009 0.000' !

Fraksi $0!%0#. 0.005 0.005 !0.00$ !0.005 !0.00$

Fraksi $0!%0# "." 0.0" 0.0" 0.00& !0.000& !0.0007

Blanko fraksi %0!'0#

0.09 0.09 0.09 0.00"5 !

Fraksi %0!'0#. 0.0"7 0.0"7 0.00' 0.000% 0.00"

Fraksi %0!'0# "." 0.0&9 0.0&9 0.0" 0.00"7 0.000

(oper #raksi *-)*.1$F A blankoterkoreksi= Aterukur− A blanko spektro

A blankoterkoreksi=0.280−0=0.280

F terkoreksi blanko= Aterukur fraksi− Ablankospek − Ablankoterkoreksi

Fraksiterkoreksi blanko=0.351−0−0.280=0.071

y=5.741 x+0.0045 > Iraksi )*-;*:J

0.088=5.741 x+0.0045 y #raksi )*-;*:.1$ *.* *.*1; m&

Knit aktiitasCsampel−Cblankoaktivitas

2 x t (menit ) >Vt

Ve x FP

Knit aktiitas0.0145−0.08!8

2 x 10 menit >1mL

0.8 mL x 10

Knit aktiitas -*.*;) unit9m2

P''$%"' K"&"- P-.$' &'"' M$.& L.7-

4abel ; /ampel enzim inertase metode 2owry pada" =700 nm

/ampel 3 terukur 3 terkoreksi7adar protein

#mg9m2$

Blanko *.*5;

fraksi 1.1 *.1*5 *.*8 *.*


9/23

fraksi ).) *.*++ *.*;5 *.*)*

blanko *-)*: *.*1

*-)*: 1 *.*< *.**+ *.***8

*-)*: ) *.* *.**; -*.**5+

blanko )*-;*: *.***)

)*-;*: 1 -*.*; -*.*;) -*.*


10/23

Blanko akti-itas'0

0.0"9 ! ! ! ! !

ubstrat '0 0."&" 0."0& 0.0$ "5.00 0.7%' 5.%570Blanko akti-itas

00

0.0"" ! ! ! ! !

ubstrat 00 0."57 0."&5 0.05 "0.00 0."0$% $.''%7Blanko akti-itas"00

0.07 ! ! ! ! !

ubstrat "00 0.'& 0.07% 0.0 0.00 0.0%%" 5.0&Blanko akti-itas$00

0.050 ! ! ! ! !

ubstrat $00 0.'7" 0.'"" 0."0 5.00 0.75' .&97(ontoh perhitunganF

L1 > !1 L) > !) 7onsentrasi /ampel 7onsentrasi Blanko

)* > *.1*** > !) y .+;1> M *.**; y .+;1> M *.**;

I/J !) 1** & *.*8 .+;1> M *.**; *.*11 .+;1> M *.**;

N *.*1* & N *.**11 &

V =Csampel−Cblanko

2 x T +

Ve

Vt + Fp

y ;.

V =0.0105−0.0011

2 x 10 +

0.8 mL

1 mL +10

19 #7m9Lma>$ > #19I/J$ M 19Lma>

L *.*;+* &9menit 19Lma> ;. *.)*;

y ;.

19 #7m9Lma>$ > #19I/J$ M 19Lma>

7m9Lma> *.)*17m *.)*1 > *.)*; *.*;15

%ambar 1 7ura &ichaelis-&enten aktiitas enzim inertase


11/23

11

f(3) 4 &.093 ! &.5

6 4 0.55

%ambar ) 7ura 2ineweaer-Burk aktiitas enzim inertase

P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/

Hasil penelitian /iakumar et al. )*1) menun"ukkan bahwa inertase mutan

memiliki < pita, sedangkan inertase wildtype memiliki pita.

%ambar 5 Hasil // '3%E inertase , &-&arker, 41-sampel 1, 4)-sampel ),

dari data sekunder #/iakumar et al. )*15$

4abel 8 Bobot molekul sampel 41 dengan metode //-'3%E

!omor Rf 41 #cm$ 2og bobot molekul #7a$ Bobot molekul #7a$

1 *.*1< 1.


12/23

R

,arakmigrasi %rotein '-m(

,arakminggrasi total (-m ) 0 .1

5 .7 *.*1< cm

y -*.*;> M 1.**8

2og B& 1.**8 - *.*; #*.*1 M 1.**8

2og B& 1.**8 A *.*; #*.*5$

1.


13/23

15

residu9pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh berupa ekstrak kasar

enzim inertase yang berwarna cokelat pada lapisan toluena. /elan"utnya, pemisahan

enzim dilakukan dengan cara disentrifuge dengan kecepatan 1)*** rpm selama 1

menit. Hal ini berguna untuk memisahankan pecahan dinding dinding sel dari

supernatannya. 'rinsip dari metode sentrifuge ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzimyang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. /ehingga

nantinya berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah

#7oolman )***$.

P''%+"' &'"' A.'% S%5"$

Ekstrak toluena digunakan sebagai pelarut untuk mengekstrak enzim inertase.

raksi yang diperoleh dari ekstraksi toluena merupakan ekstrak kasar enzim.

'emisahan enzim dilakukan dengan cara disentrifus dengan kecepatan 1)***

rpm selama 1 menit #Bintang )*1*$. Hal ini berguna untuk memisahkan pecahan

dinding dinding sel dari supernatanya #7aufman 1


14/23

#Hasanah dan 'utra )*1*$, dan akhirnya diambil 1 m2 dari olume total fraksi untuk

analisis aktiitas dan kadar protein.

Hasil percobaan berdasarkan data 4abel ) menun"ukkan bahwa semakin besar

presentase pengendapan dari fraksi, maka semakin banyak pula "umlah amonium sulfat

yang harus ditambahkan untuk melarutkan protein yang terkandung dalam tiap fraksi#3costa et al. )***$. 3ktiitas tertinggi interase sebanding dengan banyaknya protein

interase. 3rtinya, aktiitas optimum inertase berada pada tingkat ke"enuhan 8*-M *,**; yang akan digunakan untuk mengukur konsentrasi glukosa. 'ersamaan garis

tersebut selan"utnya digunakan untuk menententukan konsentrasi gula inert yang

terbentuk. !ilai R ) *.8< setara dengan .8


15/23

1

E$ membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya #Bintang )*1*$. Reduksi

kupritartat dan reaksi dengan reagen olin-(iocalteu yang menghasilkan perubahan

warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada pan"ang gelombang +* nm.

/tandar yang digunakan adalah B/3. 'embuatan kura standar pengukuran konsentrasi

protein dilakukan dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumin #B/3$,akuades, dan reagen pada berbagai olume yang berbeda. 7andungan protein yang

diukur dalam praktikum ini adalah protein terlarut dan protein total. 'rotein terlarut

merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem pencernaan. 'rotein total

merupakan pengukuran kandungan nitrogen #!$ dalam sampel. 0leh karena itu, terdapat

senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan terkalkulasi namun dalam kadar yang

relatif kecil dan dapat diabaikan #0lson dan &arckwell )**+$.

Reduksi kupritartat dan reaksi dengan reagen olin-(iocalteu yang

menghasilkan perubahan warna biru dapat diukur dengan nilai absorbansinya pada

pan"ang gelombang +* nm. /tandar yang digunakan adalah B/3. 'embuatan kura

standar pengukuran konsentrasi protein dilakukan dengan menggunakan standar Bovine

Serum Albumin #B/3$, akuades, dan reagen pada berbagai olume yang berbeda.7andungan protein yang diukur dalam praktikum ini adalah protein terlarut dan protein

total. 'rotein terlarut merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem

pencernaan. 'rotein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen #!$ dalam

sampel. 0leh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan

terkalkulasi namun dalam kadar yang relatif kecil dan dapat diabaikan #0lson dan

&arckwell )**+$.

%ambar merupakan kura standar untuk mengukur kadar protein inertase

berdasarkan hasil pengukuran absorbansi standar-standar protein. 7ura standar di atas

menghasilkan persamaan garis sebesar y -*.) M *.11) yang akan digunakan

untuk mengukur kadar protein inertase. 4abel ; merupakan hasil pengukuran kadar

protein inertase menggunakan metode 2owry. Hasil percobaan menun"ukkan bahwa

kadar protein inertase terbesar terdapat pada fraksi *-)*: ulangan 1 dan kadar protein

terkecil terdapat pada fraksi 8*- 1*8 #Bintang

)*1*$.

&enurut 'olaina dan &c(abe #)**+$, aktiitas enzim inertase sebanding dengan

kadar protein inertase oleh sebab itu menurutnya fraksi 5 merupakan fraksi yang

memiliki kadar protein tertinggi karena dalam fraksi ini ditambahkan ammonium sulfat.

ungsi dari ammonium sulfat ini adalah mengendapkan protein lain selain protein


16/23

enzim inertase. Oield enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi

yang dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, sedangkan fold enzim

merupakan perbandingan antara aktiitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan

aktiitas spesifik ekstrak kasar.

!ilai kinetika enzim inertase berupa nilai 7m dan Lmaks diperoleh dari kura plot hubungan konsentrasi dengan unit aktiitas sampel. %ambar ) #7ura &ichealis-

&enten$ dan 5 #7ura 2ineweaer-Burk$ menun"ukan la"u inetrase yang dipengaruhi

oleh konsentrasi substrat dengan persamaan garis y *.)*1> M ;. sehingga

nilai 7m didapatkan sebesar *.*;15 mg9m2. nterpretasi dari nilai tersebut menun"ukan

bahwa untuk mencapai setengah nilai Lmaks maka nilai 7m yang dibutuhkan sebesar

*.*;15 mg9m2. /emakin besar nilai 7m maka la"u atau aktiitas enzim inertase tidak

baik karena semakin banyak substrat yang dibutuhkan untuk bereaksi #Bintang )*1*$.

P''$%"' B..$ M.#% P-.$' I'$"-/

'ercobaan terakhir adalah karakterisasi enzim inertase dengan elektroforesis

// '3%E. 4eknik ini merupakan teknik analisis protein dengan menggunakan sifat

migrasi protein dengan dialiri medan listrik dan menggunakan gel poliakrilamid.

'enentuan agar ini karena sifatnya yang memungkinkan mempunyai pori yang berbeda

untuk stacking tempat pemisahan protein #konsentrasi tinggi dengan pH


17/23

1+

/tacking gel mempunyai fungsi untuk mengumpulkan sampel yang akan

dipisahkan sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak bersama-sama dan

membentuk suatu pita cuplikan yang pekat. Resoling gel mempunyai fungsi untuk

ter"adinya pemisahan yang lebih baik sehingga memungkinkan ter"adi perbedaan gerak

yang "elas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekulyang lebih kecil. ungsi buffer elektroforesis untuk mempertahankan pH di dalam

reseroir dan gel serta sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. 0leh karena itu

pemilihan buffer harus memenuhi kriteria antara lainF pemilihan buffer didasarkan pada

tidak adanya interkasi yang ter"adi antara buffer dengan makromolekul yang dipisahkan,

pH yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi protein #kisaran yang digunakan

untuk protein biasanya ;.-.*, kekuatan ionik dan konsentrasi buffer harus

diperhitungkan dengan tepat #kekuatan ionik biasanya berkisar *.*-*.1$ #3costa et al.

)***$.

/istem buffer kontinyu adalah gel yang digunakan dalam satu slab terdiri dari dua

gel yaitu stacking gel dan separating gel . Buffer dan konsentrasi akrilamid yang

digunakan pada kedua gel tersebut berbeda. 'ada stacking gel digunakan buffer dengan pH 8.< dan konsentrasi akrilamid rendah. /edangkan pada separating gel digunakan

buffer dengan pH


18/23

penguasaan dan ketelitian dalam metode //-'3%E sehingga tidak ter"adi kesalahan

yang dapat mempengaruhi hasil percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

3costa !, Beldarrain 3, 3lonso O. )***. (haracterization of recombinant inertase

e>pressed in methylotropic yeasts. Biotechnology and Applied Biochemistry 5)F

1+-1


19/23

1

/iakumar 4, Raikumar &, 'rakash &, /hanmugara"u L. )*15. 'roduction of

e>tracellular inertase from Saccharomyces cerevisiae strain isolated from grapes.

%JC(A(. 1#)$F+)-5


20/23

LAMPIRAN

2ampiran 1 3bsorbansi standar glukosa *.*; m& metode ollin 6u D88* nm

Volumelukosa (mL)

+lukosa, (mM)

*terukur

*terkoreksi

Blanko 0 0 00.0 0.00$ 0.0&& 0.0&&0.5 0.00% 0.0&$ 0.0&$

0."0 0.00' 0.057 0.0570."5 0.00 0.0%' 0.0%'0.&0 0.0" 0.0%5 0.0%50.&5 0.0$ 0.0'5 0.0'50.$0 0.0% 0.09% 0.09%

(ontoh perhitunganF#terkoreksi= #terukur$# blanko

#terkoreksi= 0.033$0=0.033

IglukosaJawalF *.*; &m

Lolume totalF 1 m2


21/23

)1

V1 × 1= V2 × 2

0.1 × 0.04 = 1 × 2

&) *.**; m&

%ambar ; kura standar IglukosaJ *.*; m& metode ollin 6u D88* nm

2ampiran ) 3bsorbansi standar B/3 metode 2owry #D+**nm$

IB/3J 3 teukur 3 tekoreksi

Blanko *,*;*

;* *,*8< *,*)<


22/23

%ambar 7ura standar pengukuran kadar protein inertase

2ampiran 5 Bobot molekul marker dengan metode //-'3%E

!omor Bobot molekul

#7a$

2og Bobot molekul

#7a$R marker #cm$

1 118.* ).*8;; *.*5

) +.; 1.R *.+


23/23

)5

%ambar + Hasil // '3%E inertase 2ab. 1

laporan ppb akhir enzim candro.docx

Documents