GLP-1 dan Exendin-4 Meningkatkan reseptor GABAA yang diperantarai aliran Synaptic dan Tonic pada CA3 Neuron Piramid Hippocampal tikus AbstrakGLP-1 (GLP-1) adalah hormon yang merangsang sekresi insulin. Reseptor untuk GLP-1 juga ditemukan di otak, termasuk hippocampus, pusat memori dan pembelajaran. Diabetes merupakan faktor risiko penurunan fungsi memori. Kami mempelajari efek dari GLP-1 dan exendin-4, agonis reseptor GLP-1, pada sinyal -aminobutyric acid (GABA) pada CA3 neuron piramidal hippocampal. GABA adalah neurotransmitter inhibisi utama dan berkurang saraf rangsangan. GLP-1 (0,01-1 nmol / L) transiently ditingkatkan sinaptik dan arus tonik, dan efek diblokir oleh exendin (9-39). Sepuluh pmol / L GLP-1 meningkat baik secara spontan saat postsynaptic penghambatan (sIPSC) amplitudo dan frekuensi dengan faktor 1,8. Dalam 0,1, 1 nmol / L GLP-1 atau 10, 50, atau 100 nmol / L exendin-4, hanya frekuensi sIPSC meningkat. Tonik saat ditingkatkan dengan 0,01-1 nmol / L GLP-1 dan dengan 0,5-100 nmol / L exendin-4. Ketika potensial aksi yang dihambat oleh tetrodotoxin (TTX), arus postsynaptic penghambatan menurun dan arus tidak lagi potensial oleh GLP-1 atau exendin-4. Sebaliknya, meskipun saat tonik menurun pada TTX, itu masih diperkuat oleh GLP-1 atau exendin-4. Hasil menunjukkan GLP-1 regulasi reseptor fungsi hippocampus dan konsisten dengan agonis GLP-1 reseptor GABA meningkatkan sinyal dengan mekanisme pra-dan postsynaptic. PengantarDalam beberapa tahun terakhir, bukti kuat telah muncul yang menunjukkan bahwa diabetes mellitus meningkatkan risiko untuk gangguan kognitif pada orang tua (1-8).Bagaimana hal ini terjadi tidak diselesaikan, tapi menarik, otak mengandung reseptor untuk banyak hormon metabolisme, di antara mereka reseptor insulin dan incretins.Untuk saat ini, dengan pengecualian dari hipotalamus, kita tahu relatif sedikit tentang bagaimana hormon metabolisme mempengaruhi aktivitas neuron dan dengan demikian fungsi otak.Hippocampus adalah pusat untuk fungsi kognitif dan merupakan pusat untuk memori dan belajar (9,10).Ini memiliki ekspresi yang menonjol untuk reseptor diaktifkan oleh hormon metabolik (10).Selanjutnya, melalui neuron di septum, hippocampus mengatur aktivitas dari sejumlah inti hipotalamus (11,12).GLP-1 (GLP-1) adalah hormon usus yang disekresikan oleh sel-sel usus L dalam menanggapi asupan makanan, dan GLP-1 reseptor diekspresikan dalam hippocampus (10,13).GLP-1 melintasi penghalang darah-otak, tetapi juga merupakan neurotransmitter yang dihasilkan oleh neuron dengan badan sel di batang otak (12-15).Efek yang paling dikenal dari GLP-1 yang merangsang insulin dan menghambat sekresi glukagon dengan cara yang tergantung glukosa di pulau pankreas untuk mengatur homeostasis glukosa setelah makan (13).Meskipun GLP-1 reseptor diekspresikan dalam hippocampus (10,16,17) dan GLP-1 dan mimetics nya, misalnya, exendin-4, liraglutide, berpotensi dapat digunakan untuk mengobati penurunan kognitif yang berkaitan dengan diabetes (6,7) , sampai saat ini tidak banyak yang diketahui tentang efek dari GLP-1 pada sinyal saraf dan, karenanya, bagaimana GLP-1 mempengaruhi kognisi dan regulasi hippocampal homeostasis metabolik.The GLP-1 adalah asam panjang peptida 30-amino dan berasal dari pengolahan posttranslational gen preproglucagon (18).Awalnya, peptida GLP-1 (1-37) diidentifikasi dari pengolahan ini, tetapi kemudian hal itu menunjukkan bahwa ada dua peptida yang lebih pendek, GLP-1 (7-37) dan GLP-1 (7-36) amida, yang adalah spesies aktif in vivo.Waktu paruh dari peptida dalam plasma sangat singkat, hanya sekitar 1-2 menit (13,19), karena degradasi oleh enzim peptidase dipeptidyl-4 (13).Di pulau pankreas, yang GLP-1 reseptor diinternalisasi setelah aktivasi GLP-1-induced (20-23) dan melewati endosomes daur ulang sebelum muncul di membran plasma lagi (23).The GLP-1 reseptor tersebar luas di otak (10,16,24), termasuk dalam neuron hippocampus CA3 piramidal (16,25), dan GLP-1 dan agonis lainnya di reseptor GLP-1 telah dilaporkan untuk mengatur asupan makanan (26), menjadi saraf (27), anti-inflamasi (28), dan memodulasi plastisitas sinaptik dan pembentukan memori (28-32).asam -Aminobutyric (GABA), neurotransmitter inhibisi utama dalam sistem saraf pusat, mengaktifkan sinaps dan extrasynaptic GABAAreseptor yang menengahi sinaptik dan tonik arus, masing-masing, mengatur aktivitas neuron dan sirkuit saraf (33).Hormon metabolisme muncul sebagai modulator GABA sinyal dalam neuron hipokampus.Sudah pada tahun 1984, Palovcik et al.(34) menunjukkan bahwa insulin menghambat neuron piramidal di iris hippocampal.Kemudian, insulin ditunjukkan untuk meningkatkan miniatur arus penghambatan postsynaptic (mIPSCs) di neuron hippocampus berbudaya (35), dan baru-baru kami menunjukkan bahwa insulin menyala tinggi-afinitas GABAAreseptor yang menghasilkan arus tonik di hippocampal neuron CA1 piramidal di iris otak tikus (36).Dalam studi saat ini, kami meneliti efek dari GLP-1 dan exendin-4 pada GABAAsinyal di hippocampal neuron piramidal CA3 di iris otak tikus.Kami menemukan bahwa fisiologis GLP-1 konsentrasi rendah (pico- ke nanomoles per liter) dan konsentrasi exendin-4 klinis relevan transiently mempotensiasi sinaptik dan arus GABA-diaktifkan tonik.Bagian SebelumnyaBagian BerikutnyaPenelitian Desain dan MetodeHippocampal slice PersiapanIrisan otak yang dibedah untuk rekaman elektrofisiologi dari tikus Wistar 16- 22-hari-tua.Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan pedoman etika lokal dan protokol perawatan hewan disetujui oleh Uppsala djurfrsksetiska nmnd, Uppsala, Swedia (Uppsala Hewan Dewan Etika).Irisan hippocampal disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (37).Secara singkat, hewan dipenggal dan otak cepat dihapus dan tenggelam ke dalam buatan cairan serebrospinal dingin (ACSF) mengandung (dalam milimol per liter): 124 NaCl, KCl 3, 2,5CaCl2,1.3MgSO4,26NaHCO3,2,5 Na2HPO4,dan 10 glukosa dengan pH 7,3-7,4 ketika menggelegak dengan 95% O2dan 5% CO2.Irisan hippocampal sagital atau coronal 400 m tebal disiapkan dengan vibratome (Leica VT1200S) di ACSF dingin digas dengan 95% O2dan 5% CO2.Irisan diinkubasi di ACSF yang sama pada 37 C selama 1 jam dan disimpan pada suhu kamar (20-22 C) selama percobaan.Elektrofisiologi Rekaman dan AnalisisSemua rekaman patch-clamp dilakukan pada suhu kamar (20-22 C).Obat yang umumnya dibeli dari Sigma-Aldrich (Jerman) atau Anaspec [GLP-1, exendin-4, dan exendin (9-39)].Methiodide Bicuculline dari Santa Cruz Bioteknologi (Heidelberg, Jerman) atau Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Jerman) digunakan.Solusi pipet yang terkandung (dalam milimol per liter): 140 CsCl, 1CaCl2,3 EGTA, 0,5 KCl, 1MgCl2,2 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, 5 QX-314 bromida, dan 10 TES, pH 7,25 dengan CsOH.Dalam beberapa percobaan, penghambat reseptor GABAB,CGP52432 (5 umol / L), digunakan, tapi itu tidak mengubah hasil.Para pipet rekaman dibuat dari kapiler kaca borosilikat (Harvard Aparatur Inggris) dengan DMZ-Universal Penarik (Zeitz Instrumen; Martinsried, Jerman) dan memiliki ketahanan 2-4 MQ ketika diisi dengan solusi pipet.Induk potensial (Vh)ditetapkan untuk -60 mV dan digunakan dalam semua percobaan.ACSF, mengandung asam kynurenic (3 mmol / L) dan obat lain, terus-menerus perfusi (3 mL / menit) melalui ruang rekaman selama percobaan.Rekaman patch-clamp dilakukan menggunakan amplifier Axopatch 200B (Perangkat Molekuler), disaring pada 2 kHz, sampel di 10 kHz dengan analog-to-digital converter Digidata 1322A (Molecular Devices), dan disimpan di komputer.Rekaman dianalisis dengan MiniAnalysis 6 (Synaptosoft, Inc.) software pClamp 10 (Perangkat Molekuler) dan.Amplitudo arus tonik didefinisikan sebagai perbedaan antara level saat awal sebelum dan setelah penerapan obat (38) dan frekuensi IPSCs spontan (sIPSCs) segera sebelum aplikasi obat pertama didefinisikan sebagai kontrol.Efek obat maksimal pada frekuensi sIPSC dihitung dan dinormalisasi dengan nilai kontrol dalam sel yang sama.Nilai rata-rata arus dasar selama perubahan sementara dalam nilai saat ini selama GLP-1 aplikasi dilengkapi dengan fungsi eksponensial ganda:y = y0+ A1 exp(kenaikant /)- Sebuah2 exp (t / pembusukan),di manay0danAadalah konstanta1,2sewenang-wenang dankenaikan/ pembusukanadalah konstanta waktu untuk naik dan fase pembusukan arus transien, masing-masing.Jumlah Isolasi RNA dan RT-PCRTotal RNA diisolasi dari irisan tikus hippocampal dengan menggunakan kit GenElute mamalia Jumlah RNA Miniprep (Sigma-Aldrich) dan dihitung dengan Nanodrop (Nanodrop Technologies).Tikus hippocampal RNA total (100 ng) itu terbalik ditranskripsi menjadi cDNA dalam campuran reaksi 20-uL menggunakan reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen).Kontrol negatif dilakukan dengan menghilangkan reverse transcriptase dalam reaksi untuk mengkonfirmasi tidak ada kontaminasi DNA genomik dalam RNA terisolasi.Manusia cDNA hippocampal dibeli dari USBiological.PCR dilakukan dalam campuran reaksi 10-uL mengandung 4 uL cDNA (4 ng), 1 PCR penyangga, 3 mmol / LMgCl2,0,3 mmol / L deoxyribonucleotide trifosfat, 1 karboksi-X-rhodamine referensi pewarna, 0,7 unit JumpStart Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich), 0,5 SYBR Hijau I (Invitrogen), dan 0,4 umol / L masing-masing maju dan mundur primer.Pasangan primer yang disintesis oleh Sigma-Aldrich: tikusGlp1r(maju, GGCATTGTCAAGTATCTCTAC; mundur, GATGAAGACAAGGAAGTTGAC, ukuran amplikon, 123 bp) danGLP1Rmanusia (maju, ACATCAAATGCAGACTTGCC; mundur, TCACAAAGGCAAAGATGACC, ukuran amplikon, 81 bp).Amplifikasi dilakukan di piring optik 384-baik menggunakan ABI PRISM 7900HT Urutan Detection System (Applied Biosystems) dengan denaturasi awal 5 menit pada 95 C, diikuti oleh 45 siklus 95 C selama 15 s, 60 C selama 30 s, dan 72 C selama 30 s.Kurva leleh ditentukan pada akhir bersepeda untuk memastikan amplifikasi produk PCR tunggal.Lima mikroliter setiap individu PCR kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 2% diwarnai dengan SYBR Emas (Invitrogen, Carlsbad, CA).Analisis StatistikAnalisis statistik dilakukan dengan menggunakan SigmaPlot 11 (Systat Software), MiniAnalysis 6 (Synaptosoft), atau GraphPad Prism 6 software.Hasil disajikan sebagai berarti SEM.UjitStudent berpasangan digunakan untuk set data terdistribusi normal.Metode Tukey digunakan untuk mendeteksi outlier.Analisis statistik dilakukan setelah tidak termasuk outlier.Nonparametrik uji Mann-Whitney digunakan untuk set data yang tidak terdistribusi normal.Satu-way ANOVA Bonferroni post hoc test digunakan untuk beberapa perbandingan dengan data terdistribusi normal.HasilGABAA-dimediasi arus seluruh sel dicatat dari tikus hippocampal neuron piramidal CA3 bermandikan ACSF dengan adanya asam kynurenic.Pada akhir setiap percobaan, bicuculline (100 umol / L), sebuah GABAAantagonis reseptor, diterapkan untuk memblokir arus GABA-membangkitkan.The sIPSCs dihapuskan oleh 100 umol / L bicuculline (Gbr. 1) dan memegang saat menurun, mengungkapkan tonik menonjol GABA-diaktifkan saat biasanya hadir dalam neuron piramidal CA3 hipokampus (24,7 1,5 pA,n= 19) (Gambar. 1).Kami kemudian melanjutkan dan meneliti efek dari GLP-1 pada GABA iniAarus reseptor-mediated.

Gambar 1Melekat GABA-diaktifkan sinaptik dan arus tonik di hippocampal CA3 piramida neuron di iris otak tikus. Arus dihambat oleh antagonis reseptor GABA bicuculline (100 umol / L) aplikasi. Bar horisontal di atas rekaman menunjukkan periode aplikasi inhibitor. Kanan: cocok Gaussian ke histogram semua poin dari 30-s segmen diambil di tengah-tengah periode kontrol dan setelah aplikasi bicuculline. Puncak Gaussians ditandai dengan garis garis horisontal: garis putus-putus yang lebih rendah menunjukkan tingkat saat awal dalam kondisi kontrol sebelum aplikasi bicuculline; garis putus-putus atas menunjukkan tingkat saat ini "nol" setelah menambahkan inhibitor. Perbedaan antara ditandai puncak Gaussian mewakili amplitudo dari GABA-diaktifkan tonik saat ini.

GLP-1 secara sementara Memodulasi GABA-Activated Synaptic dan Tonic Arus di CA3 Piramid NeuronKami memeriksa apakah GLP-1 konsentrasi mulai dari 10 pmol / L untuk 10 nmol / L mempengaruhi arus GABA-membangkitkan, dan hasil perwakilan ditunjukkan selama tiga sel dalamGambar.2A-C.The GLP-1 mRNA reseptor dinyatakan baik hippocampus manusia dan tikus (Gambar. 2D).GLP-1 dengan cara tergantung konsentrasi transiently meningkatkan sinaptik dan arus GABA-diaktifkan tonik di neuron.10 pmol / L GLP-1 konsentrasi yang paling efektif dan transiently meningkat paling sering sIPSC amplitudo dengan faktor 1,8 (Gambar. 3A), dan rata-rata frekuensi sIPSC itu sama meningkat (Gambar. 3B) dengan faktor 1,8(n= 7) dibandingkan dengan kontrol.Lebih tinggi GLP-1 konsentrasi (100 pmol / L, 1 nmol / L, dan 10 nmol / L) (Gambar. 3A) tidak meningkatkan paling sering sIPSC amplitudo.Namun, dalam 100 pmol / L dan 1 nmol / L GLP-1, rata-rata frekuensi sIPSC masih meningkat dengan faktor 1,6(n= 6) dan 1,8(n= 5), masing-masing, dibandingkan dengan kontrol (Gambar. 3B).Tonik saat ini di neuron piramidal CA3 meningkat ketika terkena 10 pmol / L untuk 1 konsentrasi nmol / L dari GLP-1 tapi mirip dengan mengontrol di 10 nmol / L GLP-1 (Gambar 3C.) sehingga lonceng sebuah berbentuk seperti hubungan konsentrasi-respons.Ketika beberapa konsentrasi GLP-1 yang berurutan diterapkan neuron, maka setiap aplikasi baru menyebabkan peningkatan sementara arus tonik, yang kemudian santai ke tingkat saat awal.Dengan demikian, amplitudo saat tonik berubah secara sementara dalam GLP-1 cara yang tergantung konsentrasi.Hanya menerapkan solusi ekstraseluler tidak menginduksi peningkatan sementara amplitudo saat tonik.Amplitudo tidak terkait dengan apakah respon diperoleh setelah paparan tunggal untuk GLP-1 (Gambar. 3C) atau apakah neuron sebelumnya telah terkena konsentrasi lain dari GLP-1 (Gambar. 3C).

Gambar 2GLP-1 mempotensiasi sIPSCs dan GABA-membangkitkan tonik saat di hippocampal neuron piramidal CA3. GLP-1 meningkat disebabkan frekuensi dan amplitudo dari sIPSCs (A-C) dan ditingkatkan saat tonik diwujudkan oleh pergeseran ke bawah saat awal, tingkat yang ditunjukkan oleh garis putus-putus terendah di A-C. Tingkat saat awal sebelum GLP-1 aplikasi, yaitu, kontrol, ditunjukkan dengan garis putus-putus tengah; garis dasbor di atas mewakili tingkat saat ini "nol" setelah aplikasi bicuculline mana semua reseptor GABA telah terhambat. Perhatikan bahwa mulai GLP-1 konsentrasi A adalah 10 pmol / L dan 0,1 nmol / L di B, dan garis miring A menunjukkan istirahat dalam rekaman. C: Contoh GABAA reseptor-dimediasi saat dihambat dengan menerapkan bicuculline pada saat peningkatan maksimal saat tonik. D: GLP-1 mRNA reseptor dinyatakan dalam hippocampus manusia dan tikus. Horisontal bar atas rekaman saat ini menunjukkan periode aplikasi obat.

Gambar 3GLP-1 memodulasi sinaptik (sIPSCs) dan karakteristik saat GABA-diaktifkan tonik. A: histogram probabilitas kumulatif dari sIPSC amplitudo untuk berbagai GLP-1 konsentrasi meningkat secara signifikan di amplitudo hanya pada 10 pmol / L GLP-1. Garis padat dan dash menunjukkan histogram probabilitas kumulatif sIPSC amplitudo sebelum dan sesudah GLP-1 aplikasi, masing-masing. Paduan uji Student t: * P