18

BAB 3

PERCOBAAN

3.1 Bahan

Bahan uji : Ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), ekstrak etanol rimpang

kunyit (Curcuma domestica Val.), ekstrak etanol rimpang jahe merah (Zingiber officinale

Rosc. var. sunti Val.), ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L). Bahan-bahan

lain: etanol 95 %, amil alkohol, serbuk magnesium, kloroform, pereaksi Dragendroff,

pereaksi Mayer, besi (III) klorida, natrium hidroksida 1 N, eter, pereaksi Liebermann-

Burchard, amoniak, toluena, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam klorida 2 N,

gelatin, pereaksi Steasny, asam sulfat pekat, isopropanol, asam asetat glasial, etil asetat, n-

heksan, natrium karboksimetilselulosa, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol, basa

tris, kalium klorida, asam klorida 0,1 N, asam 2-tiobarbiturat (TBA), natrium lauril sulfat.

3.2 Alat

Alat penetapan kadar air, alat refluks, lampu Ultraviolet (Desaga Sarstedt-Guppe), pelat

silica gel GF254, alat timbang mencit, jarum oral, alat bedah, tangas air, tabung reaksi, alat

sentrifuga suhu dingin (GS-15R Centrifuge Beckmann), mikropipet, inkubator suhu,

tabung sentrifuga, alat sentrifuga biasa, alat vortex, spektrofotometer UV-Vis (Hewlett-

Packard AP 8452), kuvet.

3.3 Hewan Uji

Mencit betina Swiss Webster usia 6-8 minggu dengan bobot 20-30 g yang diperoleh dari

Laboratorium Hewan Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung.

3.4 Pengumpulan Bahan Uji

Ekstrak air bawang putih diperoleh dari industri obat herbal Finzelberg, sedangkan ekstrak

etanol kunyit diperoleh dari PT. Phytochemindo Reksa. Simplisia rimpang jahe merah

diperoleh dari Kebun Percobaan Manoko, Lembang pada bulan Januari 2007, setelah itu

dikeringkan dalam oven bersuhu 60-70°C kemudian diserbuk.

19

3.5 Pembuatan Ekstrak Uji

Ekstraksi jahe merah dan mengkudu dilakukan di Sekolah Farmasi Institut Teknologi

Bandung menggunakan metode refluks kemudian dipekatkan dengan menggunakan

penguap vakum berputar.

3.6 Karakterisasi Ekstrak

Karakterisasi ekstrak yang dilakukan meliputi penentuan susut pengeringan, penetapan

kadar air, penetapan kadar abu total, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, dan

pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) senyawa identitas. Dilakukan pula penetapan

bobot jenis khusus untuk ekstrak kental.

3.6.1 Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang yang

sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum

ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga

menjadi lapisan dengan tebal lebih kurang 5-10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak

kental, ekstrak diratakan dengan bantuan batang pengaduk. Botol dimasukkan ke dalam

ruang pengering dengan tutup dibuka, lalu dikeringkan pada suhu 105 ºC hingga bobot

tetap. Setiap sebelum pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin

sebelum eksikator dalam suhu kamar.

3.6.2 Penetapan Kadar Air

Sejumlah ekstrak yang diperkirakan mengandung 2-4 ml air ditimbang dan dimasukkan ke

dalam labu kering. Jika ekstrak berupa ekstrak kental, ekstrak ditimbang dalam sehelai

lembaran logam dengan ukuran yang sesuai dengan leher labu.

Tabung penerima pendingin dibersihkan dengan asam, dibilas dengan air, lalu dikeringkan.

Ke dalam labu kering dituangkan 200 ml toluena dan 2 ml air, disuling selama 2 jam,

didinginkan selama 30 menit, kemudian volume dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Hasil

yang diperoleh disebut sebagai volume destilat pertama.

Ekstrak dan batu didih dimasukkan ke dalam labu destilasi kemudian dipanaskan perlahan

hingga mendidih. Kecepatan penyulingan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik, setelah

sebagian besar air tersuling, kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.

20

Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluena. Tabung

penerima dibiarkan mendingin hingga suhu kamar. Lapisan air dan toluena dibiarkan

memisah, kemudian dibaca volume airnya. Volume yang terbaca disebut sebagai volume

destilat kedua. Kadar air dinyatakan dalam persen dengan persamaan :

( )W

nn100(%)airKadar 1 −=

W menyatakan berat ekstrak (g), n1 sebagai volume destilat kedua atau volume total air dan

n sebagai volume destilat pertama atau volume air setelah penyulingan pertama (Ditjen

POM, 1978).

3.6.3 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 gram ekstrak ditimbang dan dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah

dipijarkan dan ditara, lalu diratakan. Krus yang telah berisi ekstrak dipijarkan perlahan-

lahan hingga arang habis, lalu didinginkan. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah

dikeringkan di udara (Ditjen POM, 1978).

3.6.4 Penetapan Kadar Sari Larut Air

Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml air kloroform (larutan 2,5 ml kloroform P

dengan air hingga 100 ml) selama 24 jam menggunakan labu bersumbat sambil berkali-

kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi

disaring lalu 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang

telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105 °C hingga bobot tetap.

Kadar sari larut air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen POM,

1978).

3.6.5 Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Sebanyak 5 g ekstrak dimaserasi dengan 100 ml etanol 95 % selama 24 jam menggunakan

labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan

selama 18 jam. Hasil maserasi disaring cepat dan dihindarkan dari penguapan etanol.

Filtrat sebanyak 20 ml diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang

telah ditara. Kemudian cawan tersebut dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot tetap.

Kadar sari larut etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Ditjen

POM, 1978).

21

3.6.6 Pengujian Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Identitas

Pola kromatogram dibuat dengan cara kromatografi lapis tipis (KLT) pada lempeng silika

gel GF254 dengan berbagai fase gerak sesuai dengan golongan kandungan kimia sebagai

sasaran analisis. Senyawa pembanding pola kromatogram menggunakan senyawa identitas

alliin untuk ekstrak air umbi bawang putih (Allium sativum L.), kurkuminoid untuk ekstrak

etanol rimpang kunyit (Curcuma domestica Val.), dan skopoletin untuk ekstrak etanol buah

mengkudu (Morinda citrifolia L.). Sistem KLT menggunakan pelat silica gel GF254 dengan

pengembang butanol-asam asetat glasial-air (4:3:3) dan penampak bercak asam sulfat 10 %

dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm untuk ekstrak bawang putih.

Untuk ekstrak kunyit digunakan pengembang kloroform-etanol 95 %-asam asetat glasial

(95:5:1) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam metanol, dipantau di bawah sinar

UV 254 dan 366 nm (Rustyawati, 1991). Untuk ekstrak jahe merah digunakan

pengembang toluena-etil asetat (93:7) dan penampak bercak asam sulfat 10 % dalam

metanol, dipantau di bawah sinar UV 254 dan 366 nm. Untuk ekstrak mengkudu

digunakan pengembang n-heksan-etil asetat (6:4) dan penampak bercak asam sulfat 10 %

dalam metanol, dipantau di bawah sinar UV 366 nm.

3.7 Pemeriksaan Kandungan Kimia Ekstrak

Pemeriksaan kandungan kimia ekstrak meliputi pemeriksaan terhadap golongan senyawa

alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dan steroid/triterpenoid.

3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid

Sebanyak 2 g ekstrak dilembabkan dengan 5 ml amonia 25 %, digerus dalam mortir,

kemudian ditambahkan 20 ml kloroform dan digerus kuat-kuat. Campuran disaring lalu

filtrat diteteskan pada kertas saring kemudian ditetesi pereaksi Dragendorff. Reaksi positif

jika terbentuk warna merah/jingga. Filtrat yang sama diekstraksi dua kali dengan larutan

asam klorida 10 %, dimasukkan ke dalam dua tabung masing-masing 5 ml dan diuji

dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff.

3.7.2 PemeriksaanFlavonoid

Sebanyak 5 ml filtrat air dalam tabung reaksi ditambahkan serbuk magnesium, 2 ml

campuran etanol-asam klorida pekat (1:1) dan 3 ml amil alkohol. Tabung dikocok kuat dan

22

dibiarkan memisah. Jika terbentuk warna merah, jingga, atau kuning pada lapisan amil

alkohol, berarti filtrat mengandung senyawa flavonoid.

3.7.3 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 10 ml filtrat air dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dikocok vertikal selama

10 detik. Jika busa yang terbentuk di tabung stabil selama tidak kurang dari 10 menit

dengan tinggi 1-10 cm dan busa tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N

pengujian menunjukkan adanya saponin.

3.7.4 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 10 g ekstrak dicampur dengan 100 ml air panas, kemudian dididihkan selama 15

menit. Campuran tersebut setelah dingin kemudian disaring dan filtrat air dibagi menjadi

tiga bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %.

Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya golongan senyawa

tanin. Ke dalam filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin 1 %. Terbentuk endapan

menunjukkan adanya senyawa tanin. Ke dalam filtrat ketiga ditambahkan 15 ml pereaksi

Steasny dan dipanaskan dalam penangas air suhu 90 °C. Terbentuknya endapan warna

merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan dipisahkan dan filtrat

dijenuhkan dengan natrium asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan besi (III)

klorida 1 %. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.

3.7.5 Pemeriksaan Kuinon

Sebanyak 5 ml filtrat air ditambahkan dengan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1

N. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya golongan senyawa kuinon.

3.7.6 Pemeriksaan Steroid/Triterpenoid

Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam. Hasil maserasi disaring

dan diambil filtratnya. Sebanyak 5 ml filtrat diuapkan dalam cawan penguap hingga

diperoleh residu. Residu tersebut ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes

asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah-ungu menunjukkan adanya golongan

senyawa triterpenoid dan warna biru-hijau menunjukkan adanya golongan senyawa steroid.

23

3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan

Pengujian aktivitas antioksidan yang dilakukan meliputi uji peredaman radikal bebas

DPPH, uji peredaman peroksidasi lipid secara in vitro, dan uji peredaman peroksidasi lipid

secara ex vivo.

3.8.1 Uji Peredaman radikal bebas DPPH

Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam air suling atau metanol sehingga diperoleh

konsentrasi 2, 25, 50, 100, 200 dan 500 μg/ml untuk melihat kisaran konsentrasi yang

diperlukan agar serapan DPPH dapat terukur dengan baik. Konsentrasi ekstrak dipersempit

sedemikian rupa agar diperoleh serapan untuk mendapat nilai EC50 yang lebih akurat.

Larutan pereaksi DPPH dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol yang telah

didestilasi dengan konsentrasi 40 μg/ml, dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta

terlindung dari cahaya. Sebanyak 1,5 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan

3,0 ml larutan DPPH dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit, kemudian diukur

serapannya pada λmax 516 nm. Sebagai kontrol digunakan 1,5 ml metanol yang direaksikan

dengan 3,0 ml larutan pereaksi DPPH. Persen peredaman radikal bebas dihitung dengan

rumus:

(Akontrol - Auji)

% peredaman =Akontrol

x 100 %

3.8.2 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara in vitro

Ekstrak atau pembanding dilarutkan dalam suspensi natrium karboksimetilselulosa 0,5%

sehingga diperoleh konsentrasi 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 μg/ml. Sebanyak 1 g hati

mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mM:50 mM pH 7,2

yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada

suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu

37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat

10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut

ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks

selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian

didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10

menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λmax 532 nm. Semakin banyak TBARS

(Thiobarbituric Acid Reactive Substance), yaitu hasil reaksi malondialdehid dengan asam

24

2-tiobarbiturat yang terbentuk maka serapan akan semakin besar dan ekstrak yang

memiliki efek antioksidan paling tinggi akan memberikan serapan yang paling rendah.

Persen peredaman peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian

peredaman DPPH. Dari hasil percobaan ditentukan EC50, yaitu konsentrasi efektif larutan

uji yang mampu meredam 50 % radikal bebas peroksidasi lipid. (Yang, 1991; Navarro,

1993).

3.8.3 Uji Peredaman Peroksidasi Lipid secara ex vivo

Mencit dikelompokkan menjadi tiga kelompok yaitu kelompok uji, kelompok kontrol dan

kelompok pembanding. Ekstrak uji dan pembanding diberikan secara oral satu kali sehari

selama 7 hari berturut-turut. Pada hari ke-8 mencit dikorbankan untuk diambil hatinya.

Prosedur selanjutnya sama seperti pada uji peroksidasi lipid in vitro. Sebanyak 1 g hati

mencit betina dihomogenasi dalam 10 ml dapar tris-kalium klorida 150 mM:50 mM pH 7,2

yang dijaga pada suhu dingin kemudian disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm pada

suhu 4 ºC selama 10 menit. Sebanyak 0,2 ml supernatan homogenat diinkubasi pada suhu

37 ºC selama 1 jam, lalu ditambahkan 2 ml asam klorida 0,1 N, 0,1 ml natrium lauril sulfat

10 % b/v dan diaduk dengan vortex selama 2 menit. Ke dalam campuran tersebut

ditambahkan 2 ml asam 2-tiobarbiturat 0,5 % b/v dan setelah diaduk dengan vorteks

selama 30 detik, dipanaskan selama 1 jam dalam penangas air suhu 95 ºC, kemudian

didinginkan dengan air es. Sampel disentrifuga dengan kecepatan 3000 rpm selama 10

menit, kemudian serapan supernatan diukur pada λmax 532 nm. Persen peredaman

peroksidasi lipid dihitung dengan rumus seperti pada pengujian peredaman DPPH. Data

kelompok uji dibandingkan menggunakan uji statistik ANOVA.