8-kuliah hplc2rev-2013
Post on 21-Oct-2015
157 Views
Preview:
TRANSCRIPT
HPLC High Performance Liquid ChromatographyHigh Pressure Liquid ChromatographyKromatografi Cair Kinerja TinggiAtau dapat disingkat LC
Chromatography teknik pemisahan
Liquid Fase gerak berupa cairan
High Pressure digunakan tekanan tinggi untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom
HPLCHPLC
• Dikembangkan pada awal 1970-an• Dewasa ini merupakan teknik paling banyak
digunakan untuk pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan.
• Merupakan “method of choice for the analysis of a wide variety compounds”
Keunggulan dan Kelemahan HPLC Keunggulan dan Kelemahan HPLC
Keunggulan• Dilakukan pada suhu
kamar• Analisis kuantitatif yang
cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi
• Dapat dioperasikan secara otomatis
• Sensitivitas detektor yang tinggi
• Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas
Kelemahan• Sulit ditemukan
detektor yang universal
• Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC
• Lebih rumit dalam pelaksanaannya
• Lebih mahal
Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme
Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme
• Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)
• Kromatografi Partisi (partition chromatography) • Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange
Chromatography)• Size exclusion chromatography (SEC)
– Kromatografi Permeasi Gel– Kromatografi Filtrasi Gel
Fase normal dan Fase terbalikFase normal dan Fase terbalik
Normal Phase (Fase normal) Fase diam polar dan fase gerak non polar Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana
dll.
• Reversed Phase (Fase terbalik) • Fase diam non polar dan fase gerak polar • Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril
dll.
Kromatografi Fase NormalKromatografi Fase Normal
• Disebut juga kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)
• Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina)
• Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.
Kromatografi Fase terbalikKromatografi Fase terbalik
• Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak
• Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir
• Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar.
• Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).
Ion Exchange ChromatographyIon Exchange Chromatography
• Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit dengan ion dari gugus fungsi bahan pendukung padat fase diam
• Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar kation); ammonium kuarterner (penukar anion)
• Fase gerak: dapar• Aplikasi: analisis ion, asam-
asam amino, protein/peptida, polinukleotida
Size Exclusion ChromatographySize Exclusion Chromatography
• Untuk pemisahan makromolekul (BM > 10000).
• Disebut GFC jika digunakan untuk pemisahan molekul biologis yang larut air
• Disebut GPC jika digunakan untuk penentuan Bobot molekul suatu polimer organik. Fase gerak umumnya toluen dan tetrahidrofuran.
Modus Pemisahan LainnyaModus Pemisahan Lainnya
• Kromatografi afinitas (Affinity chromatography) pemisahan berdasarkan interaksi reseptor/ligand dengan komponen analit. Ligand dalam bentuk enzim, antigen atau hormon yang diikatkan pada bahan pendukung padat.
• Chiral chromatography untuk senyawa chiral• Hydrophillic interaction chromatography (HILIC) mirip
NP-HPLC yang menggunakan fase diam polar tetapi dielusi dengan fase gerak polar.
Pump
70 mbar
Eluent
Degasser
Gradient mixer
A
A
B
C
B
C
A
B
C
A B C
A B C
Detector
Column
Instrumentation
HPLC Mobile PhaseHPLC Mobile Phase
• High solubility for the sample components• Non corrosive to HPLC system components• High purity, low cost, UV transparency• Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability
Reversed-phase mobile phasesReversed-phase mobile phases
• Water• Methanol• Acetonitrile• THF• Additives, salts, acids, bases• Ion pairing
Kemurnian Fase gerakKemurnian Fase gerak
• Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi
• Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis.
• Gunakan HPLC grade• Air sebagai fase gerak:
digunakan water for injection
Solvent UV Cutoff (nm)
Acetonitrile 190Water 190Cyclohexane 195
Hexane 200Methanol 210Ethanol 210Diethyl Ether 220
Dichloromethane 220
Chloroform 240Carbon Tetrachloride 265
Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285
Isocratic elution: Constant mobile phase composition during run
Isocratic and Gradient Elution
Gradient elution: Programme a changing (stepwise or continuous) mobile phase composition during the run For more complex mixtures
Gradient AnalysisGradient Analysis
Advantages:• Better suited for complex samples• Better resolution of early and late eluting peaks• Better sensitivity of late eluting peaks• Higher peak capacity (fit more peaks in the
chromatogram)
Disadvantages• More complex HPLC instrument• Method development, implementation and transfer are
more difficult• Typically longer analysis times since column must be
calibrated with initial mobile phase
DegasserDegasser
• Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut.
• Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector)
• Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.
Pompa HPLCPompa HPLC
• Pompa Pencampur untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir
• Pompa Analisis mengalirkan fase gerak ke dalam kolom
• Sistem Pompa:• Tekanan Tinggi• Tekanan rendah
Pada : HPLCMengapa perlu tekanan tinggi?
Pada : HPLCMengapa perlu tekanan tinggi?
• Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.
• Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan dp2
• Ukuran partikel makin kecil luas permukaan makin besar transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.
• Penggunaan ukuran partikel kecil diperlukan tekanan tinggi
• Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 – 6000 psi)
Pompa AnalisisPompa Analisis
• Tekanan: 6000-9000 psi (lbs.m2)• Kecepatan alir: 0.1 – 10 ml/menit• Terbuat dari baja atau teflon • Dapat memberikan aliran isokratik dan gradien
04/17/23 kuliah ka ii-a 33
DIAGRAM SISTEM POMPA KCKTTEKANAN RENDAH
( Low Pressure System Pump )
DIAGRAM SISTEM POMPA KCKTTEKANAN RENDAH
( Low Pressure System Pump )
HPLC Column CategoriesHPLC Column Categories
• Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, PEEK, titanium
• Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC)
• Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano
• Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid
HPLC Column: SpecificationHPLC Column: Specification
CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ
Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail
Herstellername des Kieselgels
Porengröße (Angström)
Modifizierung des Kieselgels
Korngröße in µm
Säulendimension (Länge x ID)
Flussrichtung
Column packing characteristicsColumn packing characteristics
• Critical to the column performance• Support type: silica, polymer, hybrid• Bonded Groups: C18, C8, C4, C3, CN• Particle size (dp): 2, 3, 5 μm• Pore size (dpore): 100-500 m2/g• Ligand (Bonded phase) density: 2-4 μmole/m2
Polymer support materialsPolymer support materials
• Wide pH range: 1-14• Absence of active silanol groups• cross-linked polystirene-divinylbenzene,
polyether, polymetracrylates for bioseparation
04/17/23 kuliah ka ii-a 43
TESTING KINERJA KOLOMKCKT
TESTING KINERJA KOLOMKCKT
1. JUMLAH PELAT TEORI ( N )
Number of Theoretical Plates
Idealnya harga N = 10 000 ,informasi disebutkan
- panjang dan diameter internal kolom
- macam komponen yang dianalisis dan harga k’
- fasa mobil dan fasa diam kolom
- ukuran sampel
- temperatur
04/17/23 44kuliah ka ii-a
2. FAKTOR SIMETRI Tailing Factor ( TF ) Symmetry Factor
2. FAKTOR SIMETRI Tailing Factor ( TF ) Symmetry Factor
Foley and Dorsey
TF = b 0.1
a 0.1
harus kurang
dari 2.5 kalau lebih dari 3.0 tidak bisa dilakukan analisis kuantitatif
3. RESOLUSI Harga R = 1 – 1,5
04/17/23 kuliah ka ii-a 45
REGENERASI KOLOM REGENERASI KOLOM 1. KOLOM SILICA GEL ( Normal Phase )
Dilakukan pengaliran solvent berikut dengan
kecepatan alir 1 – 3 ml / menit :
-75 ml tetrahydrofuran
-75 ml metanol
-75 ml asam asetat 1 – 5 % dalam aquadest
-75 ml pyridin 1 – 5 % dalam aquadest
-75 ml tetrahydrofuran
-75 ml dichlorometan
-75 ml n hexan
04/17/23 kuliah ka ii-a 46
REGENERASI KOLOMREGENERASI KOLOM2. KOLOM FASA SUNGSANG
( Reversed Phase Column )
Dilakukan pengliran solvent berikut dengan
kecepatan alir 0,5 – 2 ml / menit :
-75 ml aquadest + 4 x Injeksi 100 ul DMS
-75 ml metanol
-75 ml chloroform
-75 ml metanol
- Aquadest 0,1M H2SO4 Aquadest
04/17/23 kuliah ka ii-a 47
RANGKAIAN KOLOM KCKTRANGKAIAN KOLOM KCKT
Kolom KCKT panjangnya maksimal
25 cm, efisiensinya kurang terutama untuk analisis multi komponen dengan matrik sampel yang rumit.
Untuk itu diatasi dengan perangkaian kolom KCKT secara seri dengan berpedoman pada rumus :
4)6,0
25,1()( 22
exp
R
RR
Panjangkan kolom 4 kali seri !
Particle size (dp)Particle size (dp)
• Particle size and size distribution key factor for efficiency and back pressure of column
• C term of van Deemter eq. proportional to dp2.• Decreasing particle size (the L constant)
increase column efficiency and peak resolution
Surface area and Pore size Surface area and Pore size
• Chromatographic supports are porous to provide more surface area; to maximize interaction of solutes with bonded stationary phase
• Packing for small molecules separations have pore size from 60 to 200 A and surface area 100-500 m2/g.
Chromatography Stationary PhasesChromatography Stationary Phases
relatively polar surface
O O O | | | O Si O Si O Si O H
| | | O O O | | | O Si O Si O Si O H
| | | O O O
bulk (SiO2)x surface
relatively nonpolar surface
Silica Gel
O O O | | | O Si O Si O Si O R
| | | O O O | | | O Si O Si O Si O R
| | | O O O
bulk (SiO2)x surface
Derivatized Silica Gel
Where R = C18H37
hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv.
silica or “C18”)
“normal phase” “reversed phase”
Bonded PhasesBonded Phases
• C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN
• C-18C-18 Octadecyl SilylOctadecyl Silyl -Si-(CH -Si-(CH22))1717--
CHCH33
•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3
P P
C18 Phase designed to retain very polar compounds
C18 Phase designed to retain very polar compounds
Si-O-Si-(CH2)17-CH3
CH3
CH3
HPLC Detectors
• To detect the separated analytes
An ideal Detector:• UNIVERSAL (i.e. detects everything)• SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes)• LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between
intensity of response and amount of analyte).• give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the
analyte is, even if you didn’t know beforehand).
04/17/23 kuliah ka ii-a 59
DETEKTORDETEKTORPada umumnya detektor KCKT bersifat
“ Blind and Differential “ kecuali FT-IR dan MS yang berfungsi sebagai pengana-
lisis yang spesifik, sedangkan KCKT bersifat pemisah selektif pada instrumen terpadu “hyphenated instrument” :
LC-MS atau LC / FT-IR
04/17/23 61kuliah ka ii-a
PERSYARATAN DETEKTOR KCKTPERSYARATAN DETEKTOR KCKT• Sensifitas yang tinggi sampai ng, pg atau fg.• Memberikan tanggap kulitatif secara universal
atau spesifik terhadap analit yang ditentukan.• Memberikan tanggap kuantitatif.• Volume mati ( “ Death Volume “ ) yang kecil.• Tidak bersifat destruktif ( kecuali pada LC-MS ).• Tidak peka terhadap perubahan temperatur kecuali
detektor Fluorescence dan Refractive Index .• Mudah didapat, kecuali detektor Radio aktif.
HPLC DetectorsHPLC Detectors
• UV-Vis Detector• Photodiode array Detector (PDA = DAD)• Refractive Index Detector (RID)• Fluorescence Detector (FLD)• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)• Electrochemical Detector (ECD)• Conductivity Detector• Radiometric Detector
Hyphenated Systems• LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR
HPLC DetectorsHPLC Detectors• UV-Vis
– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)– Can be used with gradient elution– Requires chromophore
• Refractive Index– Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)– Isocratic only– Nearly universal detection
• Evaporative Light Scattering– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105); – Non-linear calibration required– Can be used with gradient elution– Nearly universal detection
UV-Vis DetectorUV-Vis Detector• Paling banyak digunakan• Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow
cell• Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat
bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit)
• 190 – 600nm• Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan
sensitivitas pada daerah visibel.• Macam UV-Vis:
– Fixed wave length– Variable wave length– Multiple variable wave length– Photo diode-array
04/17/23 65kuliah ka ii-a
DETEKTOR UV - VISDETEKTOR UV - VIS
1.FIXED WAVELENGTH ( FW )
= 254 nm dan = 280 nm
2.VARIABLE WAVELENGTH ( VW )
= analytical
3. MULTIPLE WAVELENGTH ( MW )
= analytical, confirmation,reference
4. PHOTO DIODE ARRAY ( PDA )
= 190 nm – 650 nm ( full scale )
UV-Vis DetectorUV-Vis Detector
Lamp
Grating
Flow cell
Reference diode
Sample diode
Cut-off filter
Holmium oxide filter
Slit
Mirror 2
Mirror 1
PDAPDA
• Disebut juga diode array detector• Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang terelusi• Mampu melakukan identifikasi peak• Sensitivitas detektor lebih rendah pada model
terdahulu tetapi pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi
• PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with 512-1,024 diode (or pixels) mampu resolusi spektro 1 nm.
PDAPDA
• Dengan software pengevaluasi spektra dapat menampilkan kromatogram dan spektra sampel
• Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity)
• Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.
Peak Purity test: HPLCPeak Purity test: HPLC
• Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic reference material) dengan diode array detector overlay
Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS)
• Pengukuran spektra pada “upslope,
apex dan down slope”• Peak harus “pure”
Match FactorMatch Factor
• MF = 1000 r = 1 100% pure peak• MF > 990 pure• MF < 900 not pure• 900 < MF < 950 contaminated
Pure and Impure HPLC peaks
• Peak purity tests can also be evaluated with
– The 3D-spectra of Photodiode array detectors
– Mass spectrometry
Comparison by 3 Point SpectrumComparison by 3 Point Spectrum
Acetyl Salicylic Acid
down slope
up slope, peak top
Refractive indexRefractive index
• Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel yang mengandung analit yang terelusi dengan sel pembanding.
• Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug) • Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan
umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll.
• Detektor standar untuk GPC• Tidak dapat digunakan untuk gradien
Mass Spectrometer (MS)Mass Spectrometer (MS)
• MS works by ionizing molecules then sorting and identifying the ions according to their mass-to-charge (m/z) ratios.
• Two key components in this process: 1. ion source generates the ions, 2. mass analyser sorts the ions.
• ESI: Electrospray ionization• MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ionization• APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization
LC-MS LC-MS
HPLC• Providing best separation,• But unable to identify the
components unequivocally
MS• Providing Mass spectra of
compounds specific for identification
• Identification much more difficult (or impossible) for a component of mixture
LC-MS/MSLC-tandem MS = MSn
LC-MS/MSLC-tandem MS = MSn
Mass Spectrometer Mass Spectrometer
MALDIElectrospray ionization (ESI)
Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)
FABEI
Single quadrapole (SSQ)Triple quadrapole (TSQ)Quadrapole ion trapTime-of-flight (TOF)Fourier Transform (FTMS)Magnetic sector
HPLC Ionization Source
Mass Analyzer
Detector
Ionization sourceIonization source
• Coverts analytes of interest to gas phase ions• ESI: Electrospray ionization• MALDI: Matrix-assisted laser
desorption/ionization• APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization
ESI
Common Types of AnalysersCommon Types of Analysers
• Quadropole• Ion trap• Triple quadrupole• Time of Flight• Fourier transform MS (FTMS)
Your HPLC success depends onYour HPLC success depends on
• The suitability of the equipment you buy• Your ability to keep it up and running (or find
someone else who will service it)• The support you receive, starting out in new
directions or in solving problems that come up
Systematic TroubleshootingSystematic Troubleshooting
• All of the components of HPLC or LC-MS/MS can have problems require troubleshooting
• “An ounce of prevention is worth a pound of cure”
• The best troubleshooting strategy is to prevent problems from occurring by exercising best practices in daily HPLC operation.
Common HPLC ProblemsCommon HPLC Problems
• Problems are caused by component malfunction (Pump, degasser, injector, data system, column)
• Faulty preparation of mobile phase or sample preparation
• Problems can be categorized into several areas: Pressure problemsBaseline problemsPeak problemsData performance problems
Kasus Kebocoran
a. Kondisi normal
b. Flow rate menurun peak melebar, tinggi peak naik
c. Efek = B, tinggi peak turun
d. Peak I lebih ramping dan pendek
Points to be considered for maintenance
• Pump– check a leak of plunger seal– wash a behind plunger seal for buffer
• Injector– wash an injection port after every injection– select a suitable washing solvent
• Column– do not keep a buffer solution
• Detector– check a life time of lamp or electrode
Module Performance attributes General Expectation Frequency
Pump Flowrate accuracyGradient accuracyPressure test
±2%±1%No leak
6 months6 months6 months
Injector PrecisionLinearityCarry over
1% RSDr > 0.999< 1%
6 months12 months6 months
Detector Wavelength accuracyLinearity of responseNoise and drift
±2nmr > 0.999Noise: 10-5 AUDrift: 10-4 AU/h
6 months12 months12 months
Column compartment
Temperature accuracy ±2% 6 months
Performance verification of HPLC
Pemeliharaan kolomPemeliharaan kolom
• Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel
• Simpan kolom RP dalam pelarut CAN atau metanol atau campuran air dan pelarut organik
• Tutup ujung kolom bila tida dipakai• Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan• Gunakan guard column (jika bekerja dengan sampel-
sampel kotor)• Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang
diperbolehkan (pH 2.5 – 8). Kolom modern (pH 1.5-10)• Jangan bekerja pada temperatur tinggi
Regenarasi kolomRegenarasi kolom
• Urutan flushing untuk kolom RP HPLC:– Water– Methanol– CH2Cl2– Methanol
SYSTEM SUITABILITY TESTS
• System suitability is an integral part of many analytical procedures.
• The tests are based on the concept, that the equipment, electronics, analytical operations and samples to be analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such.
[ System Suitability Parameters ]– Capacity Factor ( k' )– Precision/Injection Repeatability ( RSD )– Relative Retention (α)– Resolution ( Rs )– Tailing Factor ( T )– Theoretical Plate Number ( N )
SYSTEM SUITABILITY SYSTEM SUITABILITY PARAMETERSPARAMETERS
[[ Determination and Standards of ParametersDetermination and Standards of Parameters ]] Capacity Factors ( k' )
k' = ( tR-t0 ) / t0 k' >2
Precision/Injection Repeatability ( RSD ) ≧n 5 RSD≦1%
Relative Retention (α ) α = k'1 / k'2
• There is not an essential parameter as long as the resolution( Rs ) is stated.
Resolution ( Rs ) Rs = ( tR 2 -tR 1) / (1/ 2 )( tW 1 +tW 2) Rs≧2
Tailing Factor ( T ) T = W x / 2f T≦2
Theoretical Plate Number ( N ) N =16 (tR /tW )2 = L /H N >2000
Solventpeak
SolventtailA
ir p
eak
Inje
ctio
n
tW1 tW2tR1
t0
tR2
Wxf
h
0.05h
SST results are not OKSST results are not OK
• Check the Mobile Phase (pH, Composition)• Flow Rate• Change the Column or regenerate it• Optimization of the mobile phase
Analisis KualitatifAnalisis Kualitatif
• Berdasarkan waktu retensi– tR A = tR B zat A mungkin sama dengan B– tR A tidak sama dengan tR B zat A tidak sama
dengan zat B
• Untuk sampel kompleks tR dipengaruhi banyak faktor gunakan waktu retensi relatif (RRT):– tR analit dibandingkan tR komponen pembanding
dalam sampel
• Penambahan zat standar ke dalam sampel • Data spektra dari PDA (match factor) atau MS
04/17/23 104kuliah ka ii-a
QUALITATIVE ANALYSIS
• Compare Retention Times• Spike Sample with Standard• Collect and analyze• Use “Hyphenated” Technique : LC – MS• Use a Diode Array Detector• Use Peak Ratios at Different Wavelengths
Quantitative AnalysisQuantitative Analysis
• Normalization method• External standard method• Internal standard method• Standard addition method
04/17/23 106kuliah ka ii-a
ANALISIS KUANTITATIF MULTI KOMPONEN PADA KCKT
1. NORMALISASI AREA2. NORMALISASI AREA DENGAN
FAKTOR RESPON (TANGGAP) DETEKTOR.
3. DENGAN STANDAR EKTERNAL4. PENAMBAHAN STANDAR
INTERNAL.
04/17/23 107kuliah ka ii-a
QUANTITATIVE ANALYSISPeak Height or Area Chromatogram
Peak height unaffected by flow variations.Peak area should be used for badly tailing peaks.Both are imprecise with irreproducible injection volume
Quantitation by Normalization MethodQuantitation by Normalization Method
All the analytes present in the sample must elutes from the column, with enough resolution and, furthermore
have to be detected by the available detector.
The peak area is proportional to the weight of the analytes having passed through detector cell
The analytical signals lies within the linearity ranges
Thus,
Percentage in weight of each analyte mi = KiAi
so % i = Ai / Ai X 100
Quantitation by External StandardQuantitation by External Standard
This method is the most general method for determining the concentration of an analyte in samples
It involves the construction of a calibration plot (Area or height vs. Analyte concentrations) by using some concentrations (minimum 3-4 concentrations) of external standard; the concentration of the analyte can be determined by “interpolation”. It is not recommended to do “extrapolation”.
Do not forget to test whether the HPLC system is still “OK” by using “system suitable test”
External Standard CalibrationCalculation of Results
Y = aX + ba : SLOPb : Y intercept
2500
[Peak Area]
[Con
cen
trat
ion
]
125 ppm
2500
04/17/23 111kuliah ka ii-a
2. STANDAR EKSTERNAL
3. STANDAR INTERNAL
Prinsip : Semua konsentrasi standar dan sample ditambah standar internal sejumlah yang sama.
Perhitungan dengan cara kurva baku
IS
a
A
A
Cppm
Prinsip : Memakai standar yang sama dengan analit
04/17/23 112kuliah ka ii-a
ANALISIS KUANTITATIF SINGLE KOMPONEN DENGAN KCKT
1. STANDAR ADISI Tidak memungkinkan untuk pemakaian standar internal Hasil analisis dipengaruhi matrik sampel Kadar analit dalam sampel < LOQ (Limit of Quantitation). Prinsip : Sejumlah analit dengan kadar yang diketahui dan
bervariasi meningkat ditambahkan pada sampel (volume sampel sama)
stdstd
sampsamp xC
A
AC .
Kelemahan :Volume terinjeksi harus tepatPengenceran dan penimbangan harus saksama
Disadvantage of external standard calibration method
• Injection error will directly influence the quantitative result.
10 uL injection 11 uL injection
100 ppm100 ppm 110 ppm110 ppm
Advantage of internal standard calibration method
• Injection error can be eliminated.
2000 / 1000 = 22000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 22200 / 1100 = 2
10 uL injection 11 uL injection
11001100 22002200
IS10001000 20002000
IS TT
Disadvantage of internal standard calibration method
• Separation is slightly difficult.
ISISTT
TTISIS TTISIS
Disadvantage of internal standard calibration method
• It is difficult to find the IS compound.– The chemical structure of IS compound is
similar with one of target compound.– IS sample is not existent in the actual sample.
Calibration Method
• External standard calibration– Separation is not difficult– Injection error will directly influence the quantitative
result• Internal standard calibration
– Injection error can be eliminated– Recovery in the pretreatment procedure can be
estimated– Separation is slightly difficult– Difficult to look for the IS compound
Cara Berlaboratorium yang BaikCara Berlaboratorium yang Baik
• Good Laboratory Practices• ISO 17025 diadopsi di Indonesia menjadi SNI
19-17025• Laboratorium harus memiliki sistem mutu, yakni:
– Kebijakan mutu– Panduan mutu (SOP = standard operating procedure)– Instruksi Kerja– Form
top related