L/O/G/OL/O/G/O

TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER EKSPRESI KLONING DAN

ALEL SPESIFIK OLIGONUKLEOTIDA

Oleh :

KELOMPOK 5

1. Annisa Fajriani

2. Fitria Febrianti

3. Muti Dianda Sari

4. Rike Tri Kumala Dewi

5. Ruqayyah Jamaludin

Pendahuluan

Biologi Molekuler

Interaksi berbagai sistem dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan

sintesis protein

Next…

Mendiagnosis Penyakit

Mendeteksi Patogen

Konseling Genetik

Terapi Gen 4

1

2

3

Perkembangan analisis DNA molekuler dan genetik dalam bidang medis

Next…

Strategi dan Teknik Analisis Molekuler

Kloning Ekspresi

Hibridisasi Asam Nukleat

Amplifikasi DNA dengan PCR

KLONING EKSPRESI

Isolasi DNA target1

Penyisipan DNA targetke dalam vektor rekombinan

Introduksi vektor rekombinan yangmembawa sisipan ke dalam sel inang

2

3

Mempelajari fungsi protein

Tahap Pengklonan

Contoh Studi KasusKloning Ekspresi

Konversi androgen ke esterogen oleh enzim sitokrom P-450 aromatase (P-450arom)

Dalam jurnal

“Cloning and Tissue Spesific Expression of Cytochrome P-450 Aromatase CDNA in

Japanese Eel (Anguilla japonica)”

Metode…

Ovary ikan mature & Bagian otak ikan betina immature

Isolasi fragmen cDNAP-450arom

Ekstraksi, Screening & Purifikasi RNA total

Dilakukan kloning & subkloning, identifikasi

dengan seleksi biru putih

Cek ukuran insert klon, sequencing rekombinan yang

terbentuk

Amplifikasi cDNA dengan PCR

3 primer yang digunakan oligonukleotida :

1. 5’-GG(A/T)AT(C/T)GG(C/G)AC(A/T)GC(C/G)AGTAA-3’2. 5’-CTGTGGATGGGGATCGGC(A/T)-3’3. 5’-TCATCATCACCATGGCGATG-3’

Analisis sekuen dan

RT-PCR

Next…

Hasil penelitian menunjukkan…

Eel P-450arom mRNA dominan berada di jaringan otak dan Pituary. Berdasarkan hasil tersebut dapat dikatakan bahwa ekspresi kloning dapat dilakukan untuk mengidentifikasi apakah fragmen cDNA yang ingin diketahui ekspresinya berada pada jaringan yang sedang diidentifikasi atau tidak.

HIBRIDISASI ASAM NUKLEAT

Tahapan dalam analisis DNA rekombian yang memanfaatkan komplementer interaksi asam nukleat yang sedemikian penting untuk sintetis DNA dan Ra

Pemakaian oligonuleotida spesifik alel

Menggunakan DNA/ RNA “probe” radioaktif

Next…

Oligonukleotida Spesifik Alel (ASO)

Salah satu variasi dalam teknik hibridisasi asam nukleat

Southern Blotting

Southern Blotting

Proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.

Edward M. Southern

Prinsip kapilaritas, dimana bufer yang merupakan fase gerak akan membawa fragmen DNA dari gel ke membran. Karena

muatan DNA negatif sedangkan muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada membran. Membran

yang digunakan membran nitroselulosa.

Contoh Studi Kasus dengan menggunakan Alel Spesifik Oligonukleotida (ASO)

Silsilah disamping merupakan silsilah parental penderita Cystic Fibrosis Allele yang terjadi karena ada delesi pada 3 basa nukleotida (AGA) alel urutan 508.

Next…

Sesuai Hukum Mendel ada segregasi diantara gen-gen tersebut sehingga memunculkan sifat yang bervariasi

Genotipe homozigot dominan

Genotipe homozigot resesif

Genotipe heterozigot

Next…

Dalam kasus Cystic Fibrosis tersebut 1. genotipe homozigot dominan memunculkan

fenotipe normal, 2. genotipe homozigot resesif memunculkan fenotipe

Cystic Fibrosis, 3. genotipe heterozigot memunculkan fenotipe

normal namun membawa gen Cystic Fibrosis (carier)

Next…

Dalam silsilah tersebut, sepasang parental memiliki tiga keturunan, 2 diantaranya normal dan 1 diantaranya mengalami cystic fibrosis. Untuk mengidentifikasi apakah kedua anak tersebut membawa gen cystric fibrosis (carrier), maka dilakukan analisis menggunakan southern blot dengan ASO sebagai probenya.

1. Genom DNA utuh2. Digesti DNA dengan

enzim retriksi enzim endonuklease

3. Elektroforesis dengan Gel Agarose

4. Transfer dari gel ke membran nitroselulase

5. Hibridisasi dengan probe ASO radioaktif autoradiogram membran

Metode Southern Blot menggunakan Membran Nitroselulosa

Hasil analisis…

Didapatkan hasil bahwa kedua parental genotipnya heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik yang normal maupun yang

delesi berpendar. Satu anak mengalami CF, dilihat pada kromosom yang mengalami delesi berpendar.Satu anak normal homozigot, dilihat pada kromosom normal berpendar sedangkan kromosom delesi tidak berpendar.Satu anak normal heterozigot, dilihat pada kedua kromosom baik normal ataupun yang terdelesi berpendar.

Ket : = Menderita Cystic Fibrosis

L/O/G/OL/O/G/O

Thank You!www.themegallery.com