Laporan Perbanyakan Vegetatif

PERBANYAKAN VEGETATIF TANAMAN DENGAN TEKNIK KULTUR

JARINGAN

Oleh,

Prekdi S. Berutu NIM : 160301034

Mata Kuliah : Perbanyakan Vegetatif

Dosen Pengampu : Yenni Marnita, SP., MP.

PROGRAM STUDY AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SAMUDRA

2018

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa yang atas

rahmat-nya maka penulis dapat menyelesaikan penyusunan laporan tentang

“Perbanyakan Vegetatif Tanaman dengan Teknik Kultur Jaringan ”.

Penulisan laporan adalah salah satu tugas mata kuliah Perbanyakan Vegetatif

di Universitas Samudra. Dalam penulisan laporan ini penulis merasa masih banyak

kekurangan-kekurangan baik pada teknis penulisan maupun materi, mengingat akan

kemampuan yang di miliki penulis. Untuk itu kritik dan saran dari semua pihak sangat

penulis harapkan demi penyempurnaan pembuatan laporan ini.

Dalam penulisan laporan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang

tak terhinga kepada pihak-pihak yang membantu dalam menyelesaikan laporan ini,

khususnya kepada Ibu dosen dan Asisten Praktikum yang telah memberikan materi,

sehingga memberikan modal awal buat penulisan laporan ini.

Semoga materi ini dapat bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi

pihak yang membutuhkan, khususnya bagi penulis sehinga tujuan yang di harapkan

dapat tercapai.

Langsa, 18 Desember 2018

Penulis

ii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR............................................................................................. i

DAFTAR ISI............................................................................................................ ii

BAB I PENDAHULUAN........................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang...................................................................................... 1

1.2 Tujuan Praktikum ................................................................................ 2

BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................. 3

2.1 Laboratorium Kultur Jaringan TUmbuhan ...................................... 3

2.2 Kultur Jaringan Tumbuhan ................................................................ 4

2.3 Prinsip Kultur Jaringan ....................................................................... 5

2.4 Landasan Kultur Jaringan Tumbuhan............................................... 5

2.5 Manfaat dan Syarat Kultur Jaringan Tumbuhan ............................. 6

2.6 Pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan.......................................... 7

2.7 Penggolongan Media Kultur Jaringan................................................ 9

2.8 Metode Sterilisasi .................................................................................. 11

BAB III METODELOGI PRAKTIKUM ............................................................. 14

3.1 Waktu dan Tempat ............................................................................... 14

3.2 Bahan dan Alat...................................................................................... 14

3.3 Prosedur Kerja ...................................................................................... 16

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 25

4.1 Induksi Kalus Wortel............................................................................ 25

4.2 Induksi Embrionik Somatis Kacang Tanah ....................................... 27

BAB V PENUTUP................................................................................................... 29

5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 29

5.2 Saran ...................................................................................................... 29

DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................. 30

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu contohnya

adalah dengan perbanyakan secara vegetatif. Cara perbanyakan vegetatif umumnya

akan menghasilkan tanaman yang lebih cepat tumbuh. Dapat tumbuhnya bagian

terkecil dari tumbuhan menjadi individu baru karena tumbuhan memiliki sifat mampu

untuk tumbuh menjadi tanaman yang sempurna bila disekitar lingkungan tersebut

sesuai. Sifat tumbuhan inilah yang kemudian mencetuskan suatu metode perbanyakan

tumbuhan secara vegetatif, yaitu dengan kultur jaringan tumbuhan.

Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara

vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji anggrek dengan tujuan untuk

mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari anggrek tidak

mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari mengkulturkan

biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus berkembang hingga mampu

mengkulturkan satu sel dari tanaman. Penggunaan kultur jaringan mempunyai

kelebihan, yaitu mampu memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan

dalam waktu yang relatifr singkat.

Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman

seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta

menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat

memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari

kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan.

Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik

seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman

lengkap. Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur

jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh.

Kultur jaringan sering dijadikan salah satu solusi sebagai metode perbanyakan

tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode penyimpanan plasma nutfah

2

yang tidak membutuhkan tempat yang besar. Keberhasilan dari kultur jaringan sangat

bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur.

Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman.

Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan

unsur hara. Sehingga, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting

untuk diketahui sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan.

1.2 Tujuan

Adapun tujuan dalam praktikum ini adalah :

1. Mahasiswa dapat mengetahui fasilitas dan persyaratan yang dibutuhkan untuk

Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman.

2. Mahaiswa dapat membuat media tanam untuk kultur jaringan tanaman.

3. Mahasiswa mampu melakukan teknik aseptik dan induksi kalus dari eksplan

tanaman.

4. Mahasiswa dapat mengetahui tentang kultur embriosomatik dalam kultur

jaringan.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan

Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari ruangan-ruangan yang

dipisahkan berdasarkan fungsinya, yaitu ruang persiapan (preparation area), ruang

penanaman (transfer area), ruang pertumbuhan (growing area). Seberapapun luasnya

laboratorium, ketiga ruang tersebut harus ada. Ketiga ruang di atas juga harus terpisah

dari kebun bibit dan green house untuk menghindari masuknya kontaminasi ke dalam

ruang kultur. Kebersihan lantai, meja dan kursi harus terus dijaga secara intensif

(Hartman dkk, 1997).

1. Ruang Persiapan (preparation area)

Ruang persiapan merupakan ruangan yang mempunyai 3 fungsi dasar

yaitu untuk membersihkan alat-alat (alat-alat gelas seperti petri, botol, dll),

persiapan dan sterilisasi media, dan penyimpanan alat-alat gelas. Sebuah bak

untuk mencuci yang dilengkapi dengan kran untuk aliran air mengalir juga

diperlukan untuk membersihkan alat-alat berbahan gelas. Selain itu diperlukan

meja yang permukaanya dilapisi dengan bahan yang mudah dibersihkan.

Peralatan selanjutnya yang digunakan dalam ruang preparasi adalah

lemari es untuk menyimpan larutan stok dan beberapa media, timbangan

analitik, autoclave, pH meter, magnetic stirrer, destilator (Hartmann dkk.,

1997). Selain alat di atas, ruangan ini juga dengan alat-alat seperti Hot plate

dengan magnetic stirer,Oven, pH meter , kompor gas, labu takar, gelas piala,

erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scalpel

2. Ruangi Penanaman (Transfer area)

Ruang penanaman merupakan ruang yang digunakan untuk isolasi,

inokulasi dan subkultur (penjarangan) pada kondisi steril yang di dalamnya

terdapat lemari kaca atau kabinet yang disebut Laminar Airflow (LAF).

Laminar Airflow ini digunakan untuk pemotongan eksplan, melakukan

penanaman dan subkultur. Akan tetapi jika tidak ada LAF yang memadai, tahap

4

isolasi (pemotongan eksplan) dapat dilakukan di antara kertas saring steril.

Sangat dianjurkan untuk menggunakan jas laboratorium yang bersih selama

tahap persiapan dan mensterilkan tangan dengan alkohol 96% (Pierik, 1987).

Alat-alat seperti scalpel, gunting dan alat-alat inokulasi lainnya harus

disterilkan dengan alkohol 96% dan dilanjutkan dengan pemanasan di atas api

bunsen. Lampu ultraviolet (UV) juga digunakan untuk mensterilkan ruang,

sebelum LAF digunakan.

Pemotongan eksplan juga dilakukan di dalam LAF yang kemudian

dilanjutkan dengan beberapa tahapan sterilisasi sebelum ditanam pada media

kultur. Selama inokulasi atau penanaman, botol yang berisi media padat pada

prinsipnya pada kondisi horisontal, hal ini dilakukan untuk mengurangi

kontaminasi, terutama ketika tidak bekerja dalam LAF.

Subkultur atau tahap penjarangan juga dilakukan dalam LAF, dan

merupakan tahapan yang perlu dilakukan pada metode kultur jaringan. Ada

beberapa alasan perlu dilakukannya subkultur, diantaranya yaitu nutrisi media

yang semakin lama semakin berkurang, munculnya browning atau media agar

menjadi kecoklatan karena jaringan tanaman kadang mengeluarkan senyawa

toksik, atau eksplan membutuhkan tahap perkembangan lebih lanjut.

3. Ruang pertumbuhan atau Inkubasi (Growing area)

Growing area merupakan ruang pertumbuhan atau ruang penyimpanan

hasil kultur pada kondisi cahaya dan temperatur yang terkontrol. Ruang

pertumbuhan ini terdiri dari rak-rak yang biasanya terbuat dari kaca dan digunakan

untuk meletakkan botol-botol kultur setelah proses penanamanan pada ruang

isolasi di dalam LAF. Rak-rak yang digunakan untuk inkubasi dilengkapi dengan

lampu neon di atasnya sebagai sumber cahaya. Sedangkan ruang pertumbuhan

dalam kultur jaringan dilengkapi dengan Air conditioner (AC) untuk mengontrol

suhu ruang.

2.2 Kultur Jaringan Tumbuhan

Kultur jaringan atau budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi

bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan atau organ yang serba steril,

5

ditumbuhkan pada media buatan yang steril, dalam botol kultur yang steril dan dalam

kondisi yang aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbayak diri dan

beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap. Dasar teori yang digunakan adalah teori

totipotensi yang ditulis oleh Schleiden dan Schwann, yang menyatakan bahwa teori

totipotensi adalah bagian tanaman yang hidup mempunyai totipotensi, kalau

dibudidayakan di dalam media yang sesuai, akan dapat tumbuh dan berkembang

menjadi tanaman yang sempurna, artinya dapat bereproduksi, berkembang biak secara

normal melalui biji atau spora (Yuniastuti, 2008).

2.3 Prinsip Kultur Jaringan

Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara

vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik

kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium

dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro.

Dikatakan in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan

tersebut dibiakkan di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Teori

dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap

bagian tanaman dapat berkembang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas

jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil

ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya (Gunawan, 1987).

2.4 Landasan Kultur Jaringan Tumbuhan

Landasan kultur jaringan didasarkan atas tiga kemampuan dasar dari tanaman,

yaitu:

1. Totipotensi adalah potensi atau kemampuan dari sebuah sel untuk tumbuh dan

berkembang menjadi tanaman secara utuh jika distimulasi dengar benar dan

sesuai. Implikasi dari totipotensi adalah bahwa semua informasi tentang

pertumbuhan dan perkembangan suatu organisme terdapat di dalam sel.

Walaupun secara teoritis seluruh sel bersifat totipotensi, tetapi yang

mengekspresikan keberhasilan terbaik adalah sel yang meristematik.

6

2. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke

kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru

yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi

organ baru.

3. Kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk

tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu. Cantohnya embrioagenikali

kompeten cel adalah kemampuan untuk berkembang menjadi embrio funsional

penuh. Sebaliknya adalah non-kompeten atau morfogenetikali tidak

mempunyai kemampuan.

2.5 Manfaat dan Syarat Kultur Jaringan Tumbuhan

Keuntungan kultur jaringan adalah:

1. Perbanyakan massal

2. Tidak tergantung musim

3. Mendapatkan tanaman yang unggul

4. Mudah ditransportasi

5. Dapat menyimpan plasma nutfah

6. Mendapatkan bahan sekunder pada waktu yang relatif cepat

Tumbuhan yang memerlukan kultur jaringan adalah:

1. Tumbuhan yang perkecambahannya rendah

2. Tumbuhan hibrida

3. Tumbuhan tidak berbiji

4. Tumbuhan yang sulit berbiji

Kegunaan kultur jaringan adalah:

1. Perbanyakan klon yang mempunyai sifat unggul

2. Menghemat waktu yang relatif singkat

3. Perbaikan mutu dengan mengubah sifat genetisnya

4. Mendapatkan tanaman yang toleran.

5. Mendapatkan tanaman yang bebas virus.

7

2.6 Pelaksanaan Kultur Jaringan Tumbuhan

Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan

pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan

tersendiri. Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu

istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang

umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang

artinya sebenarnya adalah kultur di dalam gelas.

Pekerjaan kultur jaringan meliputi:

1. Persiapan media,

2. Isolasi bahan tanam (eksplan),

3. Sterilisasi eksplan,

4. Inokulasi eksplan,

5. Aklimatisasi, dan

6. Usaha pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang.

Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni:

1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya menggunakan biji atau

seedling.

2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya

menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian

daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.

3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang menggunakan jaringan

(sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai bahan

eksplannya.

4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang menggunakan

media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker dan

menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan

yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.

5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas

bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada

media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding selnya

8

kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi. somatik atau

fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman,

yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur mikrospora), tepungsari/ pollen

(kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga dapat dihasilkan tanaman haploid

(Santoso, 2001).

Pelaksanaan kultur jaringan memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung

kehidupan jaringan yang dibiakkan. Pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan

membutuhkan nutrisi. Nutrisi ini harus tersedia dalam jumlah cukup dan seimbang,

antara satu dengan yang lain. Nutrisi diambil tumbuhan dari dalam tanah dan udara.

Unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tumbuhan dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat-

zat organic (C, H, O, dan N) dan garam anorganik (Fe2+. Ca2+, dan lain-lain).

Tumbuhan memerlukan makronutrien dan mikronutrien dalam tumbuh dan

berkembangnya. Makronutrien adalah nutrien berupa nutrisi mineral yang diperlukan

tumbuhan dalam konsentrasi yang relatif banyak (sebagai unsur hara utama), yaitu C,

H, O, P, K, N, S, Ca, Fe, Mg.

Adapun mikronutrien adalah nutrien berupa nutrisi mineral yang diperlukan

tumbuhan dalam konsentrasi yang relatif sedikit (unsur hara pelengkap), yaitu Mn, Mo,

Zn, Cu, B, Cl. Makronutrien dan mikronutrien ini merupakan unsur essensial, karena

kehadirannya tidak dapat digantikan oleh unsur lain. Yang paling esensial adalah

wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh

dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh

menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan

memperbanyak dirinya. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan

kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman

yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral,

vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula,

dan lain-lain.

9

2.7 Penggolongan Media Kultur Jaringan Tumbuhan

Ada tiga penggolongan media tumbuh, yaitu media padat, media setengah

padat, dan media cair.

1. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar, gelatine, agarosa,

dan gelrite. Alasan digunakannya media padat adalah eksplan tidak tahan

terhadap air yang berlebih, eksplan kecil, mudah terlihat, dan bila kesplan

berupa kalus, tidak mudah pecah. Jumlah padatan yang diperlukan antara 7-11

gr per liter atau konsentrasi antara 0,6-10%. Jenis-jenis pemadat agar adalah

agar (bakto agar atau agar bahan kue), gelrite, silika gel, dan gelatin. Bahan

pemadat agar terbuat dari ganggang merah, mengandung polisakarida dan

umum digunakan untuk pemadat media, mudah didapat serta murah.

Kekurangan dari media padat adalah adanya kemungkinan pemadat

mengandung zat penghambat pertumbuhan, nutrisi terpolarisasi di permukaan

bawah yang tersentuh media, sehinggga terjadi polarisasi nutrisi, mudah

teroksidasi senyawa fenolik dari eksudat sehingga menyebabkaneksplan

berwarna coklat (browning).

2. Media setengah padat atau semi padat dilakukan pada hampir semua kultur

dengan menggunakan agar atau gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisikuntuk

eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik

yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak

keruh (dari ekstrak rumput laut). Gel ini membuat pengamatan kontaminan atau

perkembangan akar lebih mudah. Gel in juga memiliki kondisi fisik dan kimia

yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan

media.

3. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang

atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Media ini seringkali

digunakan untuk kultur kalus atau sel, dimana jaringan harus dibenamkan pada

media untuk menghindari kekeringan. Penggoyangan pada media perlu

dilakukan untuk mendapatkam aerasi dan distribusi larutan hara yang merata.

Macam-macam cara dalam menggunakan media cair adalah (1) melalui

10

stationer (metode dari Heller), yaitu penyimpanan eksplan pada kertas yang

meresap yang dicelupkan pada media cair. Dapat digunakan untukmengkultur

jaringan yang tidak banyak menggunakan air, antara lain eksplan apeks atau

meristem. (2) melalui cara yang diputar, antara lain rotasi, putaran peridok, dan

shacking. Keuntungan memakai media cair adalah dapat memperluas hubungan

eksplan dengan media, terhindar dari polaritas nutrisi, meningkatkan respirasi,

melarutkan senyawa racun.

Bahan-bahan yang diperlukan dan biasa digunakan dalam metode kultur

jaringan adalah media MS (Murashige and Skoog), yang terdiri dari makronutrien,

mikronutrien, vitamin, iron, zat pengatur tumbuh (ZPT), myoinositol, sukrosa dan agar.

Bahan-bahan seperti makronutrien, mikronutrien, vitamin, zpt, dan iron biasanya

dibuat dalam bentuk larutan stok (media yang lebih pekat), sehingga pada saat akan

membuat media, cukup mengambil larutan stok yang sudah dibuat. Pembuatan stok

bertujuan untuk mempermudah dibandingkan setiap kali membuat media harus

menimbang (Edhi Sandra, 2013). Pada pembuatan stok media, pemberian label pada

botol larutan stok juga jangan sampai lupa dan harus benar agar mempermudah pada

saat akan membuat media kultur. Selain media kultur jaringan, ada beberapa bahan

yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, diantaranya adalah detergen, alkohol, clorox,

aquadest steril, dan spiritus yang dapat digunakan untuk sterilisasi permukaan LAF

atau untuk cairan dalam bunsen.

Media MS merupakan media kultur jaringan yang banyak digunakan untuk

mengkulturkan berbagai jenis tanaman, karena media ini mengandung unsur hara

makro dan mikro yang lebih lengkap dibandingkan penemu-penemu sebelumnya.

Setelah penemuan media MS, banyak berkembang modifikasi-modifikasi media untuk

tujuan tertentu, contoh media Nitsch & Nitsch (1969) untuk kultur anther dan media

SH (Schenk & Hidebrant) untuk kultur kalus monokotil dan dikotil (Edhi Sandra,

2013). Media VW (Vacin & Went) dan media organik yang digunakan untuk

perbanyakan anggrek, serta media WPM (Woody Plant Media) untuk tanaman

berkayu, atau tanaman perdu atau pohon berkayu.

Berikut disajikan tabel larutan stok dalam pembuatan media :

11

Tabel 1. Formulasi media MS (Murashige dan Skoog) dan pengelompokan senyawa

kimia dalam pembuatan larutan stok.

Nama Stok Senyawa dalamlarutan stok

Konsentrasidalam media MS(mg/l)

Konsentrasidalam larutanstok (mg/l)

Volume larutanyang dibutuhkan perliter media (ml)

Stok A NH4NO3 1.650 165.000 10Stok B KNO3 1.900 190.000 10Stok C KH2PO4

H3BO3

KlNa2NOO4.2H2OCoCl2.2H2O

1706,20,830,25O,025

17.0006.200

8325

2,5

10

Stok D CaCl2.2H2O 440 44.000 10Stok E MgSO4.&H2O

MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O

37016,19

8,60,025

37.0001.690

8602,5

10

Stok F FeSO4.7H2ONa3EDTA.2H2O

27,837,3

2.7803.730

10

Mio-Inositol 100 10.000 10Vitamin Thiamin

NiacinPyridoxinGlycin

0,10,50,52

100500500

2000

10

Sukrosa 30.000 Tidak dibuatlarutan stok

ZPT BANAAIAA2,4-DPicloram

SesuaiKebutuhan

100100100100100

Sesuai Kebutuhan

Agar 7.000-8.000 Tidak dibuatlarutan stok

2.8 Metode Sterilisasi

Sterilisasi merupakan tehnik membersihkan dan membebaskan suatu benda

dari segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi

adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan. Sterilisasi ini meliputi

sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi

eksplan.

12

1. Sterilisasi Ruang

Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang

digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini biasanya tidak terlalu

besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan

dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang

dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang

ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi

ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta

dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).

2. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)

Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan

laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol

70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan

selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal

serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar

harus tetap dijaga kebersihannya.

3. Sterilisasi Alat dan Media

Alat-alat logam dan gelas yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat

disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave

pada temperatur 121oC dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi

bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain

disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen.

Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau

plastik dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30

menit.

4. Sterilisasi Eksplan

Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat

berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan,

misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung

pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya,

13

umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan),

musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi

eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan

eksplannya (Edhi Sandra, 2013).

Pada metode kultur jaringan untuk perbanyakan anggrek, eksplan yang

digunakan adalah biji anggrek yang berasal dari buah anggrek yang sudah tua dan

belum pecah. Kondisi buah yang masih muda atau buah tua yang sudah pecah akan

berbeda tehnik sterilisasinya. Buah anggrek yang sudah tua dan belum pecah,

sterilisasinya dengan cara membakar buah di atas api bunsen, edangkan sterilisasi buah

anggrek yang tua dan sudah pecah dilakukan dengan klorox. Setelah disterilisasi, buah

disayat secara aseptik dan diambil bijinya untuk ditanam di media kultur (Edhi Sandra,

2013).

14

BAB III

METODELOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Perbanyakan Vegetatif dengan Cara kultur jaringan (Invitro)

dilaksanakan pada hari Sabtu tanggal 1 Desember 2018 pukul 09.00 WIB s/d selesai di

Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala, Banda

Aceh.

3.2 Bahan dan Alat

1. Alat

Alat dalam ruang persiapan yaitu :

1. Hot plate

2. Timbangan analitik

3. pH meter

4. Refrigerator, Freezer

5. Alat penyuling air (Destilator)

6. Tempat mencuci peralatan kultur

7. Tempat penyimpanan glassware, bahan kimia

8. Autoklaf

9. Sumber gas/kompor

10. Meja

Alat dalam ruang transfer :

1. Laminar air flow kabinet

2. Shaker (pennggojok)

3. Lampu spiritus

4. Pinset dan Scalpel

Alat dalam ruang inkubasi

1. Rak yang dilengkapi timer dengan pengontrol waktu dan temperatur

2. Inkubator untuk kultur gelap

3. Orbital Shakers

15

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

1. Air akuades

2. Hara makro (N, P, K, Ca, Mg dan S) dan mikro (Fe, Cu, Mn, B, Mo dan Co)

3. Gula

4. Vitamin, asam amino, dan bahan organik

5. Zat Pengatur Tumbuh

6. Suplemen berupa bahan-bahan alami

7. Agar

Larutan stok yang digunakan sebagai bahan untuk membuat media yaitu :

Nama Stok Senyawa dalamlarutan stok

Konsentrasidalam media MS(mg/l)

Konsentrasidalam larutanstok (mg/l)

Volume larutanyang dibutuhkan perliter media (ml)

Stok A NH4NO3 1.650 165.000 10Stok B KNO3 1.900 190.000 10Stok C KH2PO4

H3BO3

KlNa2NOO4.2H2OCoCl2.2H2O

1706,20,830,25O,025

17.0006.200

8325

2,5

10

Stok D CaCl2.2H2O 440 44.000 10Stok E MgSO4.&H2O

MnSO4.4H2OZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O

37016,19

8,60,025

37.0001.690

8602,5

10

Stok F FeSO4.7H2ONa3EDTA.2H2O

27,837,3

2.7803.730

10

Mio-Inositol 100 10.000 10Vitamin Thiamin

NiacinPyridoxinGlycin

0,10,50,52

100500500

2000

10

Sukrosa 30.000 Tidak dibuatlarutan stok

ZPT BANAAIAA2,4-DPicloram

SesuaiKebutuhan

100100100100100

Sesuai Kebutuhan

16

Agar 7.000-8.000 Tidak dibuatlarutan stok

3.3 Prosedur Kerja

1. Pembuatan media : 1 liter media untuk inisiasi kalus

1) Tuangkan air aquades ke dalam erlenmeyer berukuran 1000 ml, sebanyak 500

ml

2) Masukkan ke dalamnya :

a. Masing-masing stok MS (A, B, C, D, E, F, Vitamin dam mio-inositol) sebanyak

10 ml

b. 30 gr gula, tambahkan aquades sampai volume menjadi 800 ml

17

3) Tambahkan zat pengatur tumbuh sesuai kebutuhan

4) Cukupkan volume larutan masing-masing beaker menjadi 1000 ml (gunakan

gelas ukur)

5) Atur Ph 5,7-5,8 dengan KOH atau HCl

6) Tambahkan 8 gr agar. Masak sambil diaduk, sampai agarnya larut dan berwarna

bening.

18

7) Bagi kedalam botol-botol kultur yang sudah disterilkan

8) Autoklaf pada tekanan 15 psi, temperatur 121 0C selama 15 menit.

19

9) Inkibasikan dalam ruang inkubator, tunggu 2-5 hari sebelum dilakukan

penanaman.

2. Menyiapkan Ekspalan dan Penanaman Wortel

1) Akar wortel yang tidak catat dicuci dalam air mengalir untuk menghilangkan

kotoran pada permukaan akar

2) Potong kedua bagian ujungnya, buat potongan akar menjadi ukuran 6-10 cm

lalu masukkan ke dalam erlenmeyer

20

3) Di dalam laminar air flow, rendam potongan akar tersebut dengan larutan

alkohol 70 % selama 5 menit sambil dikocok.

4) Buang larutan alkohol dan bilas dengan aquades steril. Kemudian masukkan

larutan bayclin 20 %. Rendam selama 15-25 menit sambil dikocok.

5) Buang larutan bayclin, kemudian bilas dengan akuades steril 3-5 kali

6) Dengan menggunakan pinset, angkat potongan akar dan simpan di atas cawat

petri yang diberi alas kertas saring steril

7) Potong melintang akar setebal 3-5 mm, kemudian buat potongan eksplan ± 5 x

5 mm. Pastikan jaringan kambium (bagian dalam akar) menjadi bagian

potongan eksplan.

21

8) Pindahkan/tanam eksplan tersebut pada media induksi kalus yang sudah

disiapkan. Setiap botol kultur berisi 5 potongan eksplan.

9) Tutup botol dengan rapat dan simpan diruang inkubasi dalam keadaan gelap.

10) Letakkan botol-botol kultur yang telah berisi eksplan tersebut dalam ruang

inkubasi dengan intensitas cahaya 0 dan suhu 20-40 0C.

11) Amati perkembangannya setiap minggu, selama 4-6 minggu. Jika terjadi

kontaminasi keluarkan botol kultur dari ruang inkubasi, buang semua yang

22

terkontaminasi dan bersihkan botol agar bisa digunakan untuk percobaan yang

lain.

3. Menyiapkan Eksplan dan Penanaman Kacang Tanah

1) Pilih benih kacang tanah yang sama ukurannya

2) Siapkan larutan pemutih bayclin 100 %, masukkan ke dalam botol yang telah

disterilkan dan tambahkan 3 tetes tween 20

3) Masukkan semua alat yang diperlukan untuk penanaman dan letakkan dalam

laminar air flow cabinet (bunsen, pinset, pisau, petridish, air steril untuk

mencuci eksplan, media dan larutan pemutih).

4) Rendam kacang tanah dalam larutan pemutih tadi sambil dikocok selama 3-4

menit (pekerjaan ini dilakukan di dalam laminar air flow cabinet entkas)

23

5) Buang larutan pemutih dan cuci bersih dengan air steril sebanyak 3-4 kali.

6) Ambil 1 kacang tanah letakkan dalam petridish steril yang sudah disiapkan.

Belah benih kacang dan pisahkan leaflet dari embrionya (setiap kacang tanah

ada 8 potongan leaflet)

7) Tanam leaflet pada media C dan D

24

8) Letakkan botol-botol kultur yang telah berisi eksplan leaflet tersebut dalam

ruang inkubasi dengan intensitas cahaya 0 dan suhu 20-24 0C

9) Lakukan pengamatan setiap 3 hari, jika terjadi kontaminasi keluarkan botol

kultur dari ruang inkubasi, buang semua yang terkotaminasi dan bersihkan

botol agar bisa digunakan untuk percobaan yang lain.

25

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Induksi Kalus Wortel

Pada pengamatan setelah satu minggu pengkulturan, semua kultur terdapat

kontaminasi, baik itu dari bakteri maupun dari jamur. Hanya 4 kultur yang mengalami

respon berupa pembesaran volume eksplan. Data hasil pengamatan dapat di lihat pada

table hasil pengamatan minggu pertama. Pada minggu kedua setelah pengamatan,

kultur yang mengalami respon berupa pembesaran meningkat total sebanyak 7 kultur.

Namun pada kultur no 14 tidak mengalami respon pertumbuhan lagi. Data pengamatan

minggu kedua dapat dilihat pada table hasil pengamatan minggu kedua.

Tabel hasil pengamatan minggu pertama

26

Tabel hasil pengamatan minggu kedua

Penyebab terjadinya kontaminasi pada eksplan yang ditanam, kemungkinan

besar disebabkan oleh praktikan yang tidak hati-hati, tidak teliti, dan kurang steril pada

saat penanam, sehingga bakteri dan spora jamur yang menempel pada baju, tangan,

udara bahkan lingkungan sekitar sporanya masuk ke dalam media. Bakteri dan spora

jamur dapat tumbuh dengan baik pada media kultur jaringan karena mengandung

nutrisi baik makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan glukosa. Media yang

terkontaminasi jamur ditandai adanya perubahan warna pada media menjadi hitam dan

putih serta muncul serabut-serabut seperti jamur atau kapang (Idrianto, 2002).

Selain disebabkan oleh praktikan, penyebab yang lainnya yaitu bagian dari

tanaman yang digunakan. Pada praktikum kultur kalus wortel, bagian yang digunakan

yaitu bagian umbi. apabila kultur tidak dicuci bersih pada saat pencucian masih

terdapat mikroorganisme tanah yang tertinggal di bagian tersebut.

Proses sterilisasi yang terlalu singkat ataupun terlalu lama. Umbi wortel yang

disterilisasi terlalu singkat kemungkinan terjadi kontaminasi cukup besar, karena

mikroorganisme yang berkembang pada umbi wortel tersebut kemungkinan masih

hidup. Sedangkan proses strerilisasi yang terlalu lama mengakibatkan jaringan

27

tanaman menjadi mati sehingga eksplan tidak dapat tumbuh dan berkembang dengan

baik.

5.2 Induksi Embrionik Somatis Kacang Tanah

Sebelum dilakukan seleksi in vitro, induksi kalus embriogenik dilakukan untuk

mendapatkan populasi kalus embriogenik. Seleksi in vitro dilakukan pada jaringan

mutan yang berasal dari benih kacang tanah. Benih kacang tanah hasil panen dikupas

dari polong dan disterilkan dengan perendaman dalam larutan NaOCl (Clorox) 25%

selama 20 menit. Benih kacang tanah yang telah steril selanjutnya dibilas dengan

aquades steril. Poros embrio diisolasi dari benih kacang tanah steril dan diambil leaflet

sebagai sumber eksplan.

Media induksi ES terdiri atas media dasar MS (Murashige dan Skoog, 1962),

vitamin B5 (Gamborg et al. 1968), gula sukrosa (30 g/L), agar-agar (8 g/L), dan zat

pengatur tumbuh (auksin 16–20 M). Media diatur dengan pH 5,6 sebelum sterilisasi.

Setelah agaragar larut dalam media dengan pemanasan, media dituangkan dalam botol

kultur dan ditutup dengan plastik. Media yang telah disiapkan disterilkan dengan

pemanasan autoklaf.

Setiap empat minggu sekali, eksplan yang ditanam dipindahkan ke media

regenerasi yang masih segar untuk menjamin tersedianya nutrisi yang diperlukan bagi

perkembangan jaringan eksplan. Sub-kultur eksplan dilakukan terus menerus sampai

terbentuknya ES primer. Kultur yang ditanam diinkubasikan dalam ruang kultur

dengan temperatur yang diatur konstan 24 0C siang dan malam. Ruangan dijaga dalam

kondisi gelap selama 24 jam.

Pembentukan ES sekunder dapat dilakukan dengan menanam ES primer dalam

media regenerasi. Untuk menginduksi pebentukan ES sekunder, eksplan ES primer

yang didapat dari percobaan sebelumnya ditanam lebih lanjut dalam media regenerasi

embrio somatic sekunder. Media induksi regenerasi embrio somatik sekunder

menggunakan media yang sama dengan media induksi ES primer. Eksplan ES primer

ditanam dalam media induksi sebanyak 5 kalus embriogenik per botol. Eksplan embrio

somatik primer disubkultur dalam media yang sama yang masih segar dan sub-kultur

28

dilakukan terus-menerus sampai terbentuk kalus embriogenik. Kalus embriogenik dan

embrio somatik sekunder yang didapat selanjutnya diisolasi dan ditanam kembali

dalam media induksi yang masih segar selama beberapa periode sub-kultur. Kalus

embriogenik disubkultur secara terus menerus untuk membentuk embrio somatik

sekunder dan variasi somaklonal. Induksi variasi somaklonal diantara embrio somatik

sekunder dilakukan selama 3–4 periode sub-kultur dalam media induksi.

29

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Umbi wortel digunakan sebagai media kultur jaringan, karena merupakan

bagian tanaman yang berfungsi untuk melanjutkan kelangsungan hidup

tanaman budidaya secara vegetatif.

2. Biji kacang tanah dipilih dalam praktikum ini sebagai salah satu bahan induksi

embrionik somatis pada kultur jaringan.

3. Faktor lingkungan media pertumbuhan berpengaruh terhadap pertumbuhan

kalus dalam kultur jaringan.

4. Pembuatan media dalam kultur jaringan dibuat lima hari sebelum penanaman

eksplan.

5. Ruangan dalam laboratorium kultur jaringan dimulai dari ruang persiapan,

ruang transfer dan ruang inkubasi.

5.2 Saran

Sterilisasi dilakukan secara profesional sesuai kaidah yang berlaku dalam kegiatan

praktikum yang benar. Tidak hanya peralatan dan bahan tanaman, namun juga keadaan

praktikan. Dalam melakukan kegiatan kultur jaringan, harus berhati-hati dalam

mempersiapkan bahan tanam agar eksplan tidak rusak dan kontam. Hendaknya benar-benar

memilih eksplan yang baik agar penanaman bisa berhasil semua.

30

DAFTAR PUSTAKA

Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPBPress.

Endang G. Lestari. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanamanmelalui Kultur Jaringan. Jurnal Biogen 7 (1):63-68

Gunawan,L.W. 1987. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium KulturJaringan PAU Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. PlantPropagation: Principle And Practices. Sixth Ed.

Indrianto, A. 2002. Bahan Ajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Yogyakarta: FakultasBiologi Universitas Gadjah Mada.

Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers.Dordrecht.The Netherlands.

Santoso, Untung dan F. Nursandi, 2001. Kultur Jaringan Tanaman. Unibraw Press.Malang.

Yuniastuti, Endang. 2008. Buku Petunjuk Praktikum Kultur Jaringan. UNS Press.Surakarta.