1

LAPORAN AKHIR PENELITIAN DASAR

EKSPLORASI FUNGI DEUTEROMYCETES (Aspergillus sp. DAN Penicillium sp. ) PENGHASIL

SENYAWA ANTI KOLESTEROL LOVASTATIN

OLEH I NYOMAN P. ARYANTHA,Ph.D

SISKA WIDAYANTI, S.Si YUANITA,S.Si

DIBIAYAI OLEH PROYEK PENELITIAN ILMU PENGETAHUAN DASAR

DIREKTORAT PEMBINAAN PENELITIAN DAN PENGABDIAN

KEPADA MAYARAKAT DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN TINGGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2004

2

3

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN LAPORAN AKHIR HASIL PENELITIAN DASAR

1. JUDUL PENELITIAN

EKSPLORASI FUNGI DEUTEROMYCETES (Aspergillus sp. DAN Penicillium sp. ) PENGHASIL SENYAWA ANTI KOLESTEROL LOVASTATIN

2.KETUA PENELITI a. Nama Lengkap : I Nyoman P. Aryantha, Ph.D b. Jenis Kelamin : L c. Pangkat/Golongan/NIP : 131875316 d. Jabatan Fungsional : Ketua KPP Ilmu Hayati - LPPM ITB e. Fakultas/Jurusan : MIPA f. Universitas : Institut Teknologi Bandung g. Pusat Penelitian : KPP Ilmu Hayati ITB

3. JUMLAH TIM PENELITI : 2 orang

4. LOKASI PENELITIAN : Lab Mikologi KPPIlmu Hayati ITB

5. KERJASAMA DENGAN INSTANSI LAIN

a. Nama instansi : - b. Alamat :-

6. MASA PENELITIAN : 1 Tahun

7. BIAYA YANG DIPERLUKAN : Rp. 15.000.000,-

Mengetahui, Ketua KPP Ilmu hayati - LPPM ITB Ketua Peneliti (I Nyoman P. Aryantha Ph.D) (I Nyoman P. Aryantha Ph.D) NIP. 131875316 NIP.131875316

Menyetujui ,

Ketua LPPM ITB

(Dr. Ir. M. Syahril Badri Kusuma) Nip.131571038

4

RINGKASAN

Jamur dari genus Deuteromycetes (Aspergillus sp. dan Penicillium sp.)

dilaporkan menghasilkan senyawa metabolit sekunder lovastatin yang berkhasiat

sebagai anti hiperkolesterolemia (Chang dan Miles,1973). Dalam penelitian ini

diperlihatkan bahwa diperoleh 5 (lima) isolat dari spesies Aspergillus sp. dan

Penicillium sp. galur lokal positif memproduksi lovasatin. Produksi lovastatin diperoleh

secara optimum oleh Aspergillus terreus dalam komposisi medium kentang dektrosa

dengan sumber karbon [C] tapioka sebesar 15% dan nitrogen (N) kedelai 5%, pada

suhu ruang, pengocokan 125 rpm dan inkubasi selama 10 hari. Dengan kondisi

produksi dihasilkan lovastatin oleh Aspergillus terreus yaitu sebanyak 54,2 mg/L.

5

SUMMARY

Fungi from the Deuteromycetes genus Aspergillus sp. and Penicillium sp. have

been reported to potentially produce lovastatin, a secondary metabolite as an anti-

hypercholesterolemia agent (Chang and Miles,1973). Through this research, 5 isolates

from local strain of Aspergillus sp. and Penicillium sp. were confirmed to produce

statin. Maximum production of lovastatin and biomass growth was achieved by

Aspergillus terreus with a condition as follows : Potato Dextrose Broth supplied with

organic carbon (cassava 15%) and nitrogen (soy bean 5%), incubated at room

temperature and 125 rpm agitation over a period of 10 days. With these fermentation

system a maximum lovasatatin concentration was acheved at 54.2 mg/L by A. terreus.

6

I

PENDAHULUAN

Sejalan dengan adanya perubahan gaya hidup dan kompleksitas kehidupan

dewasa ini, muncul berbagai macam fenomena fisiologis tubuh termasuk yang

menyebabkan gangguan penyakit dan perlu diantisipasi. Salah satunya adalah

hiperkolesterolemia yang disebabkan oleh akumulasi kolesterol dan lipid pada dinding

pembuluh darah. Fenomena ini merupakan faktor primer penyebab penyakit

arterosklerosis, jantung koroner dan serangan jantung.

Salah satu alternatif pilihan untuk penanggulangan hiperkolesterolemia adalah

dengan agen inhibitor HMG-KoA (3-hidroksi-3-metilglutaril Koenzim A). Salah satu

agen inhibitor HMG-KoA yaitu lovastatin. Lovastatin merupakan senyawa inhibitor

kompetitif HMG-KoA reduktase yang mampu menurunkan kolesterol plasma dengan

efek samping kecil yaitu tetap menjaga tekanan darah dalam ambang normal (Frick et

al.,1987). Pengembangan produk lovastatin untuk telah mengalami kemajuan pesat

baik secara alami maupun sintetis.

Endo et al. (1976) menemukan bahwa secara alami kapang Monascus

menghasilkan senyawa yang menghambat biosintesis kolesterol dan disebut lovastatin

(mevanolin, monakolin K). Saimee (2003) berhasil melakukan screening terhadap

berbagai fungi dari kelas Basidiomycetes dan Deuteromycetes yang mampu

memproduksi lovastatin seperti Aspergillus, Penicillium, Pleurotus dan Trichoderma.

Lovastatin yang dijual secara komersial di masyarakat umumnya merupakan

lovastatin sintetis. Lovastatin sintetis dapat menyebabkan efek samping bagi kesehatan

manusia seperti sakit kepala, mual, diare, ruam dan yang paling berbahaya adalah gagal

7

hati dan rabdomiolisis (Chang dan Buswell,1996). Disamping itu lovastatin juga

diproduksi melalui metode kultur bawah permukaan berbagai jamur berfilamen.

Namun, produksi lovastatin melalui metode tersebut relatif belum berkembang dengan

baik (Saimee,2003).

Berdasarkan uraian di atas, pada penelitian ini dilakukan isolasi, optimasi

medium dan optimasi fermentasi senyawa lovastatin terhadap berbagai isolat jamur

Aspergillus sp. dan Penicillium sp.. Melalui metode ini diharapkan dapat

meningkatkan perolehan senyawa lovastatin tersebut sekaligus untuk melakukan

diversifikasi produk dari kelas Deuteromycetes.

8

II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kelas Deuteromycetes

Fungi Deuteromycetes adalah fungi imperfect atau tidak sempurna karena

tidak memiliki fase seksual yang jelas. Morfologi khas dari kelas ini adalah struktur

reproduksi berupa konidia (Gambar 1).

Sebagian dari kelompok fungi ini adalah merupakan stadium anamorf dari

kelas Ascomycetes atau Basidiomycetes. Fungi ini banyak terdapat di alam pada

berbagai medium seperti makanan, tumbuhan, minuman, permukaan gelas bahkan juga

logam. Deuteromycetes dapat tumbuh secara optimum pada suhu 29 – 32oC

(Alexopoulos & Mims, 1979). Genera yang banyak dikenal bermanfaat bagi manusia

dari fungi ini adalah Aspergillus sp. (Gambar 1A) dan Penicillium sp (Gambar 1B).

Gambar 1 Morfologi struktur reproduksi berupa konidia pada kelas Deuteromycetes : Aspergillus (kiri) dan Penicillium (kanan)

9

2.2 Lovastatin

Lovastatin atau dikenal juga dengan nama mevinolin, merupakan senyawa

metabolit sekunder yang dihasilkan melalui jalur poliketida dan merupakan derivat dari

asetat (Alberts, 1989). Lovastatin sebagai agen anti hiperkolesterolemia ditemukan

pertama kali oleh Cimerman, et al pada tahun 1973.

Lovastatin telah ditemukan pada Aspergillus terreus dan berbagai cendawan

genus Pleurotus seperti P.sapidus, P.erynggi, P.cornucopial dan P.ostreatus. Lovastatin

diperoleh antara lain melalui fermentasi bawah permukaan berbagai jamur berfilamen

khususnya dari kelas Basidiomycetes atau melalui ekstraksi tubuh buah secara kimiawi

(Saimee,2003).

2.2.1 Karakter Lovastatin

Formula empiris dari lovastatin adalah C24H36O5 dengan berat molekul

404.55 g/mol. Lovastatin hadir dalam bentuk lakton non aktif dan asam hidroksi

terbuka aktif (Gambar 2) , semi polar dan larut baik dalam etanol (Albert,1989).

Bentuk aktif dari lovastatin adalah dalam bentuk asam hidroksi terbuka karena dapat

berperan sebagai inhibitor kompetitif HMG KoA (Saimee,2003).

Lovastatin tidak larut dalam air, larut sebagian dalam etanol, metanol,

asetonitril, etil asetat dan larut sempurna dalam kloroform. Lovastatin mempunyai titik

leleh 174,5 oC, rotasi optik pada konsentrasi 0,5 gram dalam 100 ml asetonitril sebesar

325o. Lovastatin mempunyai serapan maksimum sinar ukltraviolet pada λ 235,238, dan

247 nm.

10

Gambar 2 Lovastatin (a) bentuk lakton non aktif (b) asam hidroksi terbuka

2.2.2 Peran Lovastatin

Lovasatin digolongkan ke dalam kelompok obat statin (Albert,1989).

Lovastatin sebagai agen hiperkolesterolemia mampu menurunkan kadar serum

kolesterol, LDL, trigliserol dan VLDL dalam darah (Albert, 1989). Selain sebagai agen

hiperkolesterolemia, lovastatin berpotensi sebagai inhibitor MAP kinase dan pengaktif

p21 ras.

2.2.3 Mekanisme kerja lovastatin sebagai agen hipokolesterolemia

Prinsip kerja lovastatin terhadap HMG KoA reduktase sama dengan prinsip

kerja inhibitor kompetitif enzim (Gambar 3). HMG KoA reduktase dilambangkan

sebagai enzim utama (E), Lovastatin sebagai inhibitor kompetitif (I) dan HMG KoA

sebagai substrat (S). HMG KoA reduktase adalah enzim utama yang mendukung

sintesis kolesterol di organ hati dengan cara berikatan dengan mengubah HMG KoA

menjadi mevalonat. Ketika lovastatin hadir dalam bentuk asam hidroksi terbuka dengan

konsentrasi lebih dari konsentrasi substrat (HMG KoA) maka HMG KoA reduktase

akan lebih cenderung berikatan dengan lovasatin sehingga jumlah dan frekuensi sintesis

kolesterol tereduksi (Omura,1992).

11

Gambar 3. Prinsip kerja lovastatin sebagai enzim inhibitor kompetitif HMG KoA reduktase

2.3. Kolesterol

Kolesterol adalah molekul biologis yang berperan sangat penting dalam

sintesis membran sel, prekusor sintesis hormon steroid, hormon korteks adrenal dan

sintesis asam- asam empedu dan vitamin D.

2.3.1 Struktur kolesterol

Kolesterol terdiri atas high density cholesterol (HDL), low density cholesterol

(LDL) dan trigliserida. HDL bertugas untuk membawa kolesterol dari aliran darah ke

hati. LDL bertugas membawa kolesterol kembali ke aliran darah. Kolesterol dapat

berasal dari dua sumber yaitu eksogen (makanan) atau endogen (disintesis dalam

tubuh). Hiperkolesterolemia disebabkan kadar kolesterol melebihi 239 mg/mL dalam

darah.

12

2.3.2 Biosintesis Kolesterol

Biosintesis kolesterol terjadi pada sel-sel eukaryota. Sintesis kolesterol di

mulai dari perpindahan asetil-KoA dari mitokondria ke sitosol, khususnya di

peroksisom. Biosintesis kolesterol terjadi di 25 % di organ hati dan 10% di usus (Endo

et.al.,1976).

Terdapat lima tahapan utama dalam biosintesis kolesterol yaitu (1) konversi

asetil-KoA menjadi 3-hidroksi-3-metilglutaril-KoA (HMG KoA), (2) konversi HMG

KoA menjadi mevalonat, (3) konversi mevalonat menjadi suatu molekul isopren yaitu

isopentil pirofosfat (IPP) bersamaan dengan hilangnya CO2, (4) konversi IPP menjadi

squalene dan (5) konversi squalene menjadi kolesterol.

Dalam biosintesis kolesterol dilibatkan sebanyak sepuluh macam enzim yaitu

asetoasetil-KoA thiolase, HMG KoA sintase, HMG KoA reduktase, mevalonat kinase,

fosfomevalonat kinase, fosfomevalonat dekarboksilase, isopentenil-pirofosfat

isomerase (IPP isomerase), farnesil-pirofosfat transferase (FPP transferase), squalene

sintase dan squalene epoksidase.

Mekanisme penghambatan pembentukan kolesterol oleh lovastatin melalui

salah satu komponen dari struktur lovastatin yang mempunyai analog dengan HMG-

KoA dan akan diubah menjadi asam mevalonat dengan bantuan enzim HMG-KoA

reduktase. Akibatnya, lovastatin mampu berkompetisi dengan HMG-KoA untuk

berikatan dengan enzim HMG-KoA reduktase. Jika jumlah lovastatin cukup besar

untuk berikatan dengan HMG-KoA reduktase maka asam mevalonat yang merupakan

senyawa antara biosintesis kolesterol tidak akan terbentuk sehingga pembentukan

kolesterol menjadi terhambat.

13

2.4. Faktor – Faktor yang Mempengaruhi Produksi Lovastatin

Faktor utama yang mempengaruhi sintesis lovastatin adalah jenis (strain) fungi yang

dipakai, metode fermentasi yang digunakan (fermentasi padat atau fermentasi cair),

komposisi media (terutama pada fermentasi cair), suhu, kelembaban (terutama pada

fermentasi padat), dan pH.

Setiap strain fungi mempunyai struktur gen yang berbeda sehingga memiliki

kemampuan dalam produksi lovastatin yang berbeda pula. Metoda fermentasi

mempengaruhi kuantitas sekresi lovastatin oleh fungi. Pada fermentasi padat lovastatin

lebih stabil dan lebih mudah disekresi ke medium daripada dalam fermentasi cair.

Lovastatin terakumulasi di dalam miselium pada fermentasi cair. Komposisi media

mempengaruhi metabolisme jamur. Sebagai contoh, saat jamur ditumbuhkan pada

medium yang mengandung sumber nitrogen garam amonium akan menyebabkan jamur

menghasilkan metabolit yang bersifat asam. Pada medium amonium nitrat, biasanya ion

amonium digunakan terlebih dahulu sebagai sumber nitogen sehingga kondisi medium

menjadi asam. Tetapi, saat amonia di dalam medium telah habis, jamur akan

menggunakan asam nitrat sebagai sumber nitrogen dan akibatnya keasaman medium

berkurang. Pada produksi lovastatin diperlukan sumber nitrogen yang dapat dipenuhi

dari berbagai sumber seperti pasta tomat, kasein, jagung, ekstrak daging, asparagin,

amonium sulfat, dan lain-lain. Pada proses ini sumber nitrogen yang dibutuhkan 0,2-6%

dari berat medium.

Suhu kultivasi merupakan salah satu faktor fisik yang mempengaruhi

pertumbuhan, sintesis dan sekresi lovastatin. Suhu mempengaruhi laju pertumbuhan

dan jumlah total pertumbuhan organisme. Semua proses pertumbuhan tergantung reaksi

kimiawi dan suhu mempengaruhi laju reaksi-reaksi kimia. Enzim akan mengalami

denaturasi pada suhu yang terlalu tinggi atau menjadi tidak aktif pada suhu terlalu

14

rendah. Hal ini akan menyebabkan perubahan laju reaksi kimia. Misalnya, pada kondisi

tersebut terjadi peningkatan pengikatan represor atau inhibitor dari suatu reaksi kimia

yang bisa menyebabkan menurunnya laju reaksi kimia tersebut dibandingkan dengan

kondisi normal.

Produksi lovastatin membutuhkan pH optimum dengan kisaran 5,5-6,0. Bila

pergeseran pH terlalu besar akan menghambat pertumbuhan. Tetapi, pH awal dan pH

akhir biasanya sama dengan kisaran 7-8.

15

III

TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1 Tujuan Penelitian

• Memperoleh sumber isolat unggul berasal dari fungi genus Aspergillus sp.dan

Penicillium sp. galur lokal penghasil senyawa metabolit sekunder anti-

hiperkolesterolemia berupa lovastatin.

• Meningkatkan produksi statin pada kultur isolat terpilih melalui optimasi

komposisi medium sumber C dan N dalam medium pertumbuhan serta optimasi

metode fermentasi.

3.2 Manfaat Penelitian

Diharapkan luaran penelitian ini menghasilkan perolehan isolat unggulan baru

berasal dari genus Aspergillus sp. dan Penicillium sp. galur lokal yang berpotensi

sebagai penghasil lovastain. Selain itu, diharapkan hasil yang diperoleh dalam optimasi

komposisi medium serta metode fermentasi mampu memberikan data akurat bagi

peningkatan produksi lovastatin agar pada akhirnya dapat diproduksi obat anti-

hiperkolesterolemia yang aman, efektif dan ekonomis.

16

IV

BAHAN DAN METODA

Penelitian ini terbagi menjadi 4 (empat) tahapan, yaitu (1) isolasi dan seleksi

isolat-isolat fungi genus Aspergillus sp. dan Penicillium sp. galur lokal, (2) Optimasi

komposisi medium sumber C dan N dalam medium pertumbuhan, (3) Optimasi metode

fermentasi, dan (4) produksi statin skala laboratorium. penelitian ini dilakukan di

Laboratorium Mikologi KPP Ilmu Hayati ITB.

4.1. Pembuatan Medium AKD dan KKD

Medium Agar Kentang Dekstrosa (AKD) sebanyak 1L dibuat dari rebusan

potongan kentang (1 x 1 cm) sebanyak 200g dalam 1L akuades selama 1 jam.

Selagi dipanaskan, kaldu rebusan kentang ditambahkan akuades hingga volume 1L

lalu ditambahkan 20g dekstrosa, dan 20g agar, diaduk hingga larut dan homogen.

Diusahakan selama pemanasan, voume media tetap 1L. Medium disterilkan pada

suhu 121oC, tekanan 15 lbs selama 20 menit. Medium steril kemudian dituang ke

dalam cawan petri (20 mL/petri) di laminar UV dan didiamkan hingga padat.

Pembuatan media Kaldu Kentang Dekstrosa (KKD) serupa dengan medium AKD

tetapi bedanya tidak ditambahkan dengan agar.

4.2. Analisis senyawa lovastatin dengan KLT

Identifikasi senyawa lovastatin dalam sampel ekstrak miselium dilakukan

analisis kualitatif dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan pelat

alumunium pralapis Silica Gel E.Merck 60 F254 berukuran 20 x 20 cm2 dengan

ketebalan 0.2 mm.

17

Pelat terlebih dahulu dikeringkan pada suhu 30oC selama 10 menit untuk

mengaktifkan silika gel. Masing-masing sampel dilarutkan dalam 1 mL asetonitril.

Setelah pelat KLT diaktifkan, sampel dan standar ditotolkan sebanyak 5µL dan

dikembangkan dalam suatu bejana yang telah dijenuhkan berisikan larutan

pengembang campuran diklorometan dan etil asetat dengan perbandingan 7 : 3

(Saimee, 2003). Penotolan dilakukan pada jarak 1.5 cm dari bawah, pinggir kiri

dan pinggir kanan dengan jarak antar totolan 1.5 cm. Setelah larutan pengembang

berhenti bergerak, diangkat dari bejana lalu dikeringkan di udara terbuka selama

15 menit.

Hasil KLT siap dilihat di bawah sinar ultra violet dengan panjang

gelombang 254 nm. Harga Rf dari noda-noda yang muncul pada kromatogram

ditentukan dengan cara menghitung perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh

suatu noda dengan yang ditempuh oleh larutan pengembang, diukur dari titik

penotolan (Gritter dan Bobbit,1985). Untuk penentuan kadar secara kuantitatif,

plat KLT dibaca dengan alat TLC-scanner yang dapat mengukur kekuatan

pendaran noda berdsarkan nilai absorbansinya yang berbanding lurus dengan

kadarnya. Untuk menghitung kadar lovastatin, sebelumnya dibuat kurva standar

hubungan antara kadar lovastatin dengan nilai absorbansi.

4.3. Analisis Lovastatin dengan metode KCKT

Keberadaan lovastatin dalam penelitian ini juga dikonfirmasi dengan metode

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). Pelarut yang digunakan untuk mengekstrak

lovastatin adalah asetonitril. Sampel sebanyak 1 g ditambah 2 mL asetonitril dan 0,1

mL asam fosfat 0,1 %, kemudian diinkubasi selama 30 menit. Lalu larutan disentrifuga

dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan disuntikkan ke

18

dalam kolom KCKT sebanyak 1 µg/ml. Kondisi KCKT yang digunakan ialah

menggunakan kolom C-18 (250 cm x 46 cm), pelarut asetonitril dan asam fosfat (60:40,

v/v), kecepatan alir sebesar 1,5 mL/menit, menggunakan detektor ultraviolet (UV) pada

panjang gelombang 235 nm, suhu kolom 30 oC (Saimee, 2003).

4.6 Isolasi dan seleksi fungi Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil lovastatin

Kultur Tabung

• Aktivasi selama 24 jam

• Inokulasi ke medium AKD

• Inkubasi selama 4 hari, 30oC

Kultur Petri

Pemotongan [2 x 0.5 cm] Inokulasi 10% ke 250 Medium KKD Inkubasi pada suhu ruang, 125 rpm, 4 hari

Kultur Cair Filtrasi dengan kertas saring

Miselium Filtrat

Pengukuran Lovastatin Pengaturan pH 3 Ekstraksi dengan EtOAc [1/3 vol filtrat] Sentrifugasi 1000rpm,10 menit

Sampel Uji KLT

Negatif Positif

(Nilai Rf tidak sama / Tak ada noda) (Nilai Rf sama / Ada noda)

19

Hasil tahap ini berupa galur lokal yang positif menghasilkan

metabolit sekunder berupa lovastatin digunakan dalam tahap berikut yaitu

optimasi komposisi medium.

4.5. Optimasi Komposisi Medium

Isolat penghasil lovastatin Inokulasi ke medium AKD Inkubasi selama 4 hari, 30oC

Kultur Petri Pemotongan [2 x 0.5 cm] Inokulasi 10% ke 250 ml medium KKD dengan rasio CN berbeda

a. Medium KKD + C b. Medium KKD (kontrol) c. Medium KKD + N

Inkubasi pada suhu ruang, 125 rpm, 10 hari

Pelet miselium

Pengeringan Pengukuran biomassa kering

Berat kering miselium

Hasil tahap ini berupa komposisi medium yang paling menunjang pertumbuhan

biomassa misleium fungi serta galur dengan pertumbuhan paling baik akan digunakan

dalam optimasi metode fermentasi.

20

4.6 Optimasi Waktu Fermentasi

Kultur Tabung Isolat terpilih Inokulasikan ke medium AKD Inkubasi selama 4 hari; 30oC

Kultur Petri Pemotongan [2 x 0.5 cm] Inokulasi 10% ke 250 ml medium KKD + C tapioka 15%

dan N kedelai 5% Inkubasi [suhu ruang, 125 rpm dengan variasi waktu

pengocokan [2,4,6,8,10 dan 12 hari]

Pelet miselium Produk Fermentasi

Pengukuran kadar lovastatin pada tiap perlakuan Konfirmasi uji KCKT

Kadar Lovastatin

21

V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Penumbuhan isolat hasil isolasi

Pertumbuhan isolat-isolat galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. di dalam

medium Agar Kentang Dekstrosa (AKD) memperlihatkan pertumbuhan yang baik

(Gambar 4). Medium AKD mengandung karbohidrat kompleks yang kaya akan

sumber karbon dan nitrogen yang dibutuhkan oleh fungi untuk melangsungkan

metabolisme primer dan sekunder. Selain itu medium ini mengandung berbagai

senyawa anorganik, vitamin dan faktor pertumbuhan (Ingold,1975).

Gambar 4. Beberapa koloni fungi kelompok Aspergillus (1, 2, 4) dan Penicillium (3, 5,

6) yang tumbuh dengan baik dalam medium PDA

5.2. Kultivasi bawah permukaan Aspergillus sp. dan Penicillium sp.

Pembentukkan pelet dari miselium didukung oleh perlakuan agitasi pada

kecepatan 180 rpm. Pada hari ke-2 agitasi miselium, warna pada medium KKD

mulai berubah dari warna coklat transparan menjadi coklat keruh. Menurut Griffin

(1994), agitasi pelet miselium pada kecepatan 125 rpm dalam waktu cukup lama

2 3

4 5 6

1

22

dapat menyebabkan dinding sel jamur lisis sehingga organel dan metabolit

sekunder tereksitasi dari sel.

5.3. Seleksi galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil lovastatin

Pada tahap isolasi fungi Deuteromycetes berhasil dikumpulkan sebanyak 15 jenis

galur lokal dari dua marga yaitu Aspergillus sp. dan Penicillium sp. Pada tabel 1, dapat

dilihat jenisnya. Isolat tersebut diisolasi dari berbagai jenis makanan olahan

kadaluwarsa, buah-buahan, sayur-sayuran dan tanah di Laboratorium Mikologi - KPP

Ilmu Hayati ITB.

Tabel 1. Galur Aspergillus sp. dan Penicillium sp. penghasil Lovastatin

No Galur Kode Hasil Jenis Statin

1 Aspergilllus niger A -

2 Aspergillus terreus B + Lovastain

3 Aspergillus flavus C + Lovastain

4 Aspergillus sp.1 D -

5 Aspergillus sp.2 E -

6 Aspergillus sp 3 F -

7 Aspergillus sp. 4 G + Lovastain

8 Aspergillus sp.5 H -

9 Penicillium requefortii I + Pravastain

10 Penicillium sp.1 J -

11 Penicillium sp.2 K -

12 Penicillium sp.3 L -

13 Penicillium sp.4 M -

14 Penicillium citrinum N + Pravastatin

15 Penicillium sp.5 O -

23

5.4. Optimasi komposisi medium

Produksi lovastatin pada genus Aspergillus sp dan Penicillium sp. dipengaruhi

oleh rasio C dan N pada komposisi medium. Dalam penelitian ini, tambahan sumber C

dan N adalah senyawa organik. Sumber C tambahan berupa sukrosa (10% w/v) dan

tepung tapioka (15-20%,w/v). Sumber N tambahan berupa NPK (2-3%,w/v) dan

tepung kedelai (5-10%,w/v).

Menurut hasil penelitian Lopez (2002), pertumbuhan biomassa miselium seiring

dengan pertambahan konsentrasi lovastatin dalam miselium. Oleh karena itu, pada

tahap penelitian ini, dilakukan pengukuran pertumbuhan miselium melalui berat kering

sel dari pelet miselium yang terbentuk. Dari percobaan terhadap sumber Karbon (C)

dan Nitrogen (N) secara bertahap (Gambar 5-12) diperoleh hasil yang lebih baik untuk

pertumbuhan biomassa adalah sebagai berikut : sumber C adalah tapioka dengan

konsentrasi 15% sementara sumber N kedelai dengan kadar 5% lebih baik

dibandingkan NPK. Atas dasar data ini selanjutnya dilakukan pemilihan isolat terbaik

dalam menghasilkan biomasa tertinggi dengan medium pertumbuhan yang

mengnadung sumber C (tapioka 15%) dan N (kedeleai 5%).

Dari pemilihan sumber karbon (Gambar 5-8), dapat dilihat bahwa setelah inkubasi

selama 10 hari tampak isolat B dan I memberikan pertumbuhan biomasa terbaik sebesar

1219,7 mg/L dan 601,8 mg/L yang masing-masing dicapai pada hari ke-9 dan hari ke-

10 (Gambar 5). Dalam pemilihan sumber N (Gambar 9-12), isolat B masih tetap

memberikan data pertumbuhan tertinggi yang dicapai pada hari ke-8 (615,9 mg/L)

sementara isolat G menempati urutan kedua dengan berat biomasa 562,3 mg/L yang

dicapai pada hari ke-10 (Gambar 9).

Antara penambahan sumber C dan sumber N ternyata penambahan sumber C

(tapioka 15%) memberikan nilai pertumbuhan yang lebih baik secara keseluruhan

24

seperti tampak dalam Gambar 5. Menurut Lopez (2002), sumber C organik sangat

menunjang pertumbuhan miselium karena dapat diurai secara langsung dalam jalur

poliketida oleh beberapa fungi dari kelas Basidiomycetes dan Deuteromycetes. Dari

percobaan pemilihan sumber N ini, meskipun isolat G memberikan data pertumbuhan

lebih baik (562,3 mg/L) dari isolat I (438,6 mg/L), namun dari percobaan penambahan

sumber C isolat I memberikan data pertumbuhan yang lebih tinggi yakni sebesar 601,8

mg/L. Oleh karena itu, pemilihan isolat untuk optimasi selanjutnya didasarkan atas data

penambahan sumber C (tapioka 15%). Atas pertimbangan ini, 2 isolat yang dipilih

untuk uji selanjutnya adalah isolat B (Aspergillus terreus) dan isolat I (Penicillium

requefortii).

Gambar 5. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (tapioka) 15%

0

100

200

300

400

500

600

2 4 6 8 10

B C G I N

25

0

200

400

600

800

1000

1200

2 4 6 8 10

B C G I N

Gambar 6. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (tapioka) 20%

0

100

200

300

400

500

600

2 4 6 8 10

B C G I N

Gambar 7. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (sukrosa)15%

Bera

t ker

ing bi

omas

a (mg

/L)

Be

rat k

ering

biom

asa (

mg/L)

Waktu inkubasi (hari)

26

0102030405060708090

100

2 4 6 8 10

B I N

Keterangan : Data isolat C dan G tidak teramati karena terkontaminasi Gambar 8. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + C (sukrosa)20% Gambar 9. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (kedelai) 5%

0

100

200

300

400

500

600

700

2 4 6 8 10

B C G I N

Bera

t ker

ing bi

omas

a (mg

/L)

Waktu inkubasi (hari)

27

Gambar 10. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (kedelai) 10%

0

20

40

60

80

100

120

140

2 4 6 8 10

B C G I N

Gambar 11. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (NPK) 5%

0

50

100

150

200

250

300

350

2 4 6 8 10

B C G I N

Bera

t ker

ing bi

omas

a (mg

/L)

Waktu inkubasi (hari)

Bera

t ker

ing bi

omas

a (mg

/L)

Waktu inkubasi (hari)

28

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2 4 6 8 10

B C G I N

Gambar 12. Pertumbuhan biomasa dalam medium KD + N (NPK) 10%

Pada tahap penentuan komposisi medium, dapat disimpulkan bahwa medium

yang menunjang pertumbuhan adalah medium KD + C (tapioka 15%) dan medium KD

+ N (kedelai 5%). Juga dari tahap ini diperoleh isolat dengan pertumbuhan biomassa

yang paling baik yaitu Aspergillus terreus (isolat B) dan Penicillium requerfortii (isolat

I) . Oleh karena itu, kedua isolat ini digunakan dalam optiumasi waktu fermentasi.

5.5. Optimasi waktu fermentasi

Pada tahap optimasi waktu fermentasi ini dilakukan pada suhu ruang dengan

variasi rentang waktu 12 hari dan agitasi (pengocokan) 125 rpm. Sementara komposisi

medium yang digunakan adalah medium KD dengan kombinasi penambahan tapioka

15% dan kedelai 5%. Dapat dilihat pada Tabel 4 bahwa perolehan kadar lovasatatin

tertinggi terdapat pada galur Aspergillus terreus.

Bera

t ker

ing bi

omas

a (mg

/L)

Waktu inkubasi (hari)

29

Tabel 2 Produksi lovastatin dalam medium KD + C (tapioka 15%) dan N (kedelai 5%)

Hari Lovastatin

(mg/L) Lovastatin

(mg/L) 2 8.7 2.7

4 20.2 8.4

6 35.4 19.3

8 40.3 27.5

10 54.2 28.2

12 51.3 27.7

Dapat dilihat diantara hari ke-8 sampai hari ke-10 walau terdapat

penurunan biomassa miselium Aspergillus terreus, terjadi peningkatan kadar lovastatin

yang cukup signifikan. Sedangkan pada Penicillium requefortii baik pertumbuhan

biomassa dan produksi lovastatiun masih beriringan namun tidak mengalami

peningkatan yang signifikan.

Menurut Lopez (2002), produksi lovastatin terjadi secara optimum pada kondisi

medium dengan C berlebih dan sumber N yang berkurang dan menjadi faktor

penghambat pertumbuhan miselium. Pada kondisi seperti ini, fungi akan cenderung

memanfaatkan sumber C sampingan ke dalam metabolisme sekunder dan menghasilkan

lovastatin yang mengandung unsur C, H dan O. Hal ini dapat dilihat pada fenomena

hari ke-10 dimana walau biomassa A.terreus mengalami penurunan, produksi lovastatin

tetap mengalami peningkatan yang signifikan yaitu sebesar 54.2 mg/L.

Senyawa lovastatin pertama kali ditemukan dalam Monascus rubber (Endo, et

al, 1976). Lovastatin juga ditemukan dalam filtrat fermentasi miselium Aspergillus

terreus oleh Lopez (2002). Saimee (2003) menunjukkan bahwa terdapat lovastatin

30

dalam filtrat fermentasi miselium A. terreus, A. parasiticus, A. fischery, A. flavus, A.

umbrosus , P. funiculosum, P. citrinum dan Trichoderma viridae. Lovastatin juga

terdapat pada beberapa jenis jamur dari kelas Basidiomycetes seperti Pleurotus

ostreatus (Widayanti, 2003).

31

VI

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Diperoleh 15 isolat lokal yang terdiri atas 8 isolat dari genus Aspergillus dan 7

isolat dari genus Penicillium.

2. Dari 15 isolat tersebut, 5 (lima) isolat terbukti positif menghasilkan statin yaitu

A. terreus, A. flavus, Aspergillus sp., P.requefortii dan P.citrinum.

3. Komposisi medium yang paling optimum dalam menunjang pertumbuhan

biomassa adalah komposisi medium KD+C (tapioka 15%). Pertumbuhan

biomassa miselium tertinggi selama 10 hari dalam medium KD+C (tapioka

15%) dicapai oleh A. terreus (isolat B) sebesar 1219,7 mg/L dan P. requefortii

(isolat I) sebesar 601,8 mg/L.

4. Produksi lovastatin tertinggi dicapai isolat B (A. terreus) dengan kadar 54,2

mg/L dalam waktu 10 hari pada medium KD+C (tapioka 15%) dan N (kedelai

5%), suhu ruang dan pengocokan 125 rpm.

Sebagai saran, untuk penelitian terkait disarankan untuk dilakukan dalam skala

yang lebih besar sehingga dapat dilakukan suatu analisis ekonomi sebagai persiapan

aspek komersialisasi.

32

VII

DAFTAR PUSTAKA

Alexopoulus C.J. & Mims C.W. 1979.”Introductory Micology”. New York: John Wiley

& Son’s.

Alberts, A.W. 1989. Lovastatin. Cardiovascular Drug Reviews VII. Hal.89 – 109.

Chang, S.T., Buswell, J.A.,1996. Mushroom Nutriceuticals.World Journal of

Microbiology and Biotechnology 12:473

Cimerman, N., Cimerman, A., Fiedrich, J. 1973. Screening Fungi for the

Production of Mevinolin. FEMS Microbiology . Lett.111:203 -206.

Endo, A.,Kuroda, M. dan Tsujita, Y. 1976. New Inhibitors of Cholesterogenesis

Produced by Penicillum. Journal of Antibiotics. Tokyo

Griffin, D. H.1994. Fungal Physiology.2nd Edition. Wiley Liss Inc. San Fransisco,

AS

Gritter, R. J., Bobbit, J. M. 1985. Introduction to Chromatography. Holden Day

Inc. San Fransisco AS

Ingold, C.T.1975. The Biology Of Fungy. Hutchinson Co Publisher. London

Kyslika, R., Kren, V. 1993. Determination of lovastatin (mevinolin) and

mevalonic acid in fermentation liquids. J. Chromatography 630 : 415-417.

Lopez, J.L.Casas.S. 2002. Production of lovastatin by Aspergillus terreus. Elsevier Inc.

AS

Novak, N. Gerdin, S. Berovic, M. 1997. Increased lovastatin formation by Aspergillus

terreus . Biotechnology Lett. 19:947-949.

Omura, S. 1992. The Search for Bioactive Compounds from Microorganisms. Springer-

Verlag Inc. New York, AS

Saimee, S.M.2003. Screening of lovastatin production by filamentous fungi.

Biomed Journal 7(1):29-33.

Shindia, A. A. 1997. Mevinolin production by some fungi. Folia Microbiology

42:4777-480.

Widayanti, S. (2003). Keberadaan senyawa lovastatin dalam kultur bawah

permukaan Pleurotus ostreatus, Skripsi Sarjana Biologi, FMIPA-ITB.

Witzum, J. L. 1996. Drugs used in the treatment of hyperlipoproteinemias. McGraw

Hill. AS. hal . 885-887