LAPORAN PRAKTIKUM ANALISA INSTRUMENTSPEKTROFOTOMETER ULTRAVIOLET-VISIBLE

Disusun oleh :kelompok 4 kelas A:Anas11101020000Yeyet Durotul Yatimah1110102000013Myra Kharisma11101020000Yanti Puspitaningrum1110102000043RM. Rendy H1110102000045Jaga Paramudita1110102000063Melia Puspitasari1110102000065Raden Atras S11101020000Sri Wahyuni11101020000

PROGRAM STUDI FARMASIFAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATANUNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA2013I. Tujuan Praktikum1. Memahami prinsip kerja alat spektrofotometer ultraviolet-visible2. Mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu senyawa obat (paracetamol & kofein)3. Membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva kalibrasi, akurasi, presisi, LOD, LOQ)4. Membuat parameter validasi (akurasi, presisi, uji perolehan kembali, LOD, LOQ)5. Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)

II. Dasar TeoriSpektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau yang di absorpsi. Spektrofotometri juga merupakan suatu metode analisis yang berdasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum phototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi.Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :a) Spektrofotometer ultravioletb) Spektrofotometer sinar tampakc) Spektrofotometer infra merahd) Spektrofotometer serapan atomSpektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul tersebut (Harjadi, 1990). Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-kromofor organik seperti karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas seperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas. Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer (sutopo, 2006). Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca (Sastrohamidjojo, 1992) Hasil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia, dapat dilihat berdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan.Akurasi menunjukkan kedekatan nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Untuk menentukan tingkat akurasi perlu diketahui nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat diketahui seberapa besar tingkat akurasinya. Presisi menunjukkan tingkat reliabilitas dari data yang diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran, presisi yang baik akan memberikan standar deviasi yang kecil dan bias yang rendah. Jika diinginkan hasil pengukuran yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan, misalnya dalam penentuan nilai konsentrasi suatu zat dalam larutan larutan dilakukan pengulangan sebanyak n kali. Ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi sedangkan spektrofotometri adalahpengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi elektromagnetik pada satu atau lebih panjanggelombang dengan suatu transduser (detektor). Spektrofotometri adalah analisis kuantitatif yang paling sering digunakan karena mempunyai sensitivitas yang baik yaitu 10-4 sampai 10-6. Analisis jenis ini juga relatif selektif dan spesifik, ketepatannya cukup tinggi, relatif sederhana, dan murah ( Mathias, 2005). Spektofotometri adalah metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi ( Sutopo, 2006 ).Interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi ( Eka, 2007).Spektrofotometer UV-VISSpektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR)) kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state. Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :a) Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan electron anti ikatanb) Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks.c) Penyerapan oleh perpindahan muatan.Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :A = log ( Io / It ) = a b cKeterangan : Io = Intensitas sinar datangIt = Intensitas sinar yang diteruskana = Absorptivitasb = Panjang sel/kuvetc = konsentrasi (g/l)A = AbsorbanSpektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :1.Daerah jangkauan spectrum Fotometer hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).2. Sumber sinarSesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.3. MonokromatorFilter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.4. Detektor- Filter fotometer menggunakan detektor fotosel- Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.Panjang gelombang pada alat spektrofotometer lazim disajikan dalam satuan nm di mana 1 m = 10-9 nm. B. Larutan standarLarutan baku/ larutan standar adalah larutan yang konsentrasinya sudah diketahui. Larutan baku biasanya berfungsi sebagai titran sehingga ditempatkan buret, yang sekaligus berfungsi sebagai alat ukur volume larutan baku. Larutan yang akan ditentukan konsentrasinya atau kadarnya, diukur volumenya dengan menggunakan pipet volumetri dan ditempatkan di erlenmeyer (Basset, 1994).Larutan baku primerLarutan yang mengandung zat padat murni yang konsentrasi larutannya diketahui secara tepat melalui metode gravimetri (perhitungan massa), dapat digunakan untuk menetapkan konsentrasi larutan lain yang belum diketahui. Nilai konsentrasi dihitung melalui perumusan sederhana, setelah dilakukan penimbangan teliti dari zat pereaksi tersebut dan dilarutkan dalam volume tertentu. Contoh: K2Cr2O7, As2O3, NaCl, asam oksalat, asam benzoat. Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku primer :

Zat harus mudah diperoleh, dimurnikan, dikeringkan (jika mungkin pada suhu 110-120 derajat celcius) dan disimpan dalam keadaan murni. (Syarat ini biasanya tak dapat dipenuhi oleh zat- zat terhidrasi karena sukar untuk menghilangkan air-permukaan dengan lengkap tanpa menimbulkan pernguraian parsial.) Zat harus tidak berubah berat dalam penimbangan di udara; kondisi ini menunjukkan bahwa zat tak boleh higroskopik, tak pula dioksidasi oleh udara atau dipengaruhi karbondioksida. Zat tersebut dapat diuji kadar pengotornya dengan uji- uji kualitatif dan kepekaan tertentu. Zat tersebut sedapat mungkin mempunyai massa relatif dan massa ekuivalen yang besar. Zat tersebut harus mudah larut dalam pelarut yang dipilih. Reaksi yang berlangsung dengan pereaksi harus bersifat stoikiometrik dan langsung.Larutan baku sekunderLarutan suatu zat yang konsentrasinya tidak dapat diketahui dengan tepat karena berasal dari zat yang tidak pernah murni. Konsentrasi larutan ini ditentukan dengan pembakuan menggunakan larutan baku primer, biasanya melalui metode titrimetri. Contoh: AgNO3, KmnO4, Fe(SO4)2. Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku sekunder : Derajat kemurnian lebih rendah daripada larutan baku primer Mempunyai berat ekivalen yang tinggi untuk memperkecil kesalahan penimbangan Larutannya relatif stabil dalam penyimpanan.Syarat larutan yang dapat digunakan untuk analisis campuran dua komponen adalah Komponen-komponen dalam larutan tidak boleh saling bereaksi Penyerapan komponen-komponen tersebut tiak sama Komponen harus menyerap pada panjang gelombang tertentuSenyawa-senyawa yang diukur dengan metoda spektrofotometri harus memenuhi hukum Lambert-Beer, yaitu Bila suatu sinar monokromatis dilewatkan pada medium pengabsorbsi,maka berkurangnya intensitas cahaya per unit tebal medium sebanding dengan intensitas cahaya tersebut Berkurangnya intensitas cahaya per unit konsentrasi akan berbanding lurus dengan intensitas cahayaDari hukum Lambert Beer didapat rumus sebagai berikutA = a.b.c A = -log TRumus yang digunakan untuk analisis dua komponen adalah :A1 = ax1. b. cx + ay1 . b . cy A2 = ax2 . b. cx + ay2 . b . cy Dimana : A1 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum pertamaA2 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum keduaC = konsentrasi larutan

Keabsahan Hukum BeerKondisi berikut adalah keabsahan hukum Beer. Cahaya yang digunakan harus monokromatis, bila tidak demikian maka akan diperoleh dua nilai absorbansi pada dua panjang gelombang. Hukum tersebut tidak diikuti oleh larutan yang pekat. Konsentrasi lebih tinggi untuk beberapa garam tidak berwarna justru mempunyai efek absorbsi yang berlawanan. Larutan yang bersifat memancarkan pendar-fluor atau suspensi tidak selalu mengikuti hukum Beer. Jika selama pengukuran pada larutan encer terjadi reaksi kimia seperti polimerisasi, hidrolisis, asosiasi atau disosiasi, maka hukum Beer tidak berlaku.Cara Kerja SpektrofotometerCara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan pembanding, misalnya blanko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih fotosel yang cocok 200-650 nm ( 650-1100 nm ) agar daerah yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang fotosel dalam keadaan tertutup nol galvanometer dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan, buk fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blanko dan nol galvanometer didapat dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakn tombol transmitansi, kemudian atur besarnya pada 100 %. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.ParasetamolParasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesic dan antipiretik yang populer dan digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam. Digunakandalam sebagian besar resep obat analgesic salesma dan flu. Ia aman dalam dosis standar, tetapikarena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak sengaja sering terjadi.Parasetamol (Asetaminofen) merupakan salah satu obat yang paling banyak digunakan sehari-hari. Obat ini berfungsi sebagai pereda nyeri dan penurun panas. Setelah berpuluh tahundigunakan, parasetamol terbukti sebagai obat yang aman dan efektif. Tetapi, jika diminum dalamdosis berlebihan (overdosis), parasetamol dapat menimbulkan kematian

Kafein Kafein dikenal sebagai trimethylxantine dengan rumus kimia C8H10N4O2 dan termasuk jenis alkaloida. Bentuk alami kafein adalah Kristal putih, prisma heksagonaldan dan berbobot molekul 194,19 dalton. Kafein memiliki titik leleh 238C dan mengalami sublimasi pada suhu 178C. Kafein terdapat secara alami pada biji kopi, bijicoklat, daun teh serta cula nuts.Rumus Molekul kafeinKafein sebagai zat stimulant sering dituding sebagai penyebab kecanduan. Haltersebut tidak sepenuhnya benar. Kafein hanya dapat menimbulkan kecanduan jika dikonsumsi dalam jumlah yang sangat banyak dan rutin.

III. Alat dan BahanAlat1. Spektrofotometer ultraviolet-visible2. Timbangan Analitik3. Pipet Mikro4. Gelas Ukur5. Baker Glass6. Labu UkurBahan1. Bahan Baku Standar (Parasetamol, Coffein)2. Sampel Parasetamol Generik 500 mg3. Aquadest

IV. Prosedur KerjaI. Pencarian panjang gelombang optimuma. Siapkan alat dan bahanb. Buat larutan induk Kafein dengan konsentrasi 100 ppm dengan menimbang 10 mg parasetamol kemudian ad aquadest 100 mlc. Buat larutan parasetamol 10 ppm sebanyak 25 ml dengan mengambil 2.5 ml dari larutan induk 100 ppm.d. Ukur dengan spektrofotometer UV-Vis, hingga di dapat panjang gelombang optimume. Hitung konsentrasi minimum dan maksimum dari hasil absorbansi yang didapat.

II. Kaliberasi Kafein pada panjang gelombang optimum a. Buat larutan dengan variasi konsentrasi antara konsentrasi maksimum dan minimum : 6,8,10,12,14 ppm.b. Buat larutan konsentrasi 6 ppm dengan memipet 1,5 ml larutan 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.c. Buat larutan konsentrasi 8 ppm dengan memipet 2 ml larutan 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.d. Buat larutan konsentrasi 10 ppm dengan memipet 2,5 ml larutan 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.e. Buat larutan konsentrasi 12 ppm dengan memipet 3 ml larutan 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.f. Buat larutan konsentrasi 14 ppm dengan memipet 3,5 ml larutan 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.g. Ukur serapan masing-masing konsentrasi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 243 nm ( optimum PCT) dan 273 nm ( optimum koffein).h. Hitunglah nilai a,b dan r masing-masing menggunakan regresi linier.

III. Validasi Metode (presisi dan akurasi)a. Ambil 2 konsentrasi (misal 6 dan 8 ppm ) yang digunakan dalam kalibrasi Koffein di awal praktikum.b. Konsentrasi 8 ppm untuk uji akurasi dan 6 ppm untuk uji presisi.c. Buat larutan Koffein 100 ppm dengan menimbang 10 mg Kofein dan kemudian ad aquadest 100 ml.d. Pipet 1,5 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan Koffein 6 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.e. Pipet 2 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan Koffein 8 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.f. Ukur serapan masing-masing larutan dan hitung presisi dan akurasinya.

IV. Uji sampel Parasetamol dan Koffeina. Timbang 20 tablet parasetamol generik lalu gerus dan timbang setara 500mg.b. Buat larutan induk parasetamol 5000 ppm dengan melarutkan parasetamol setara 500 mg yang di ad aquadest 100 ml.c. Buat larutan parasetamol 100 ppm dengan memipet 2 ml larutan induk dan ad aquadest 100 ml.d. Kemudian buatlah larutan parasetamol-koffein 10 ppm dengan memipet 2,5 ml larutan parasetamol 100 ppm dan 2,5 ml larutan koffein 100 ppm kemudian ad aquadest 25 ml.e. Ukur serapan masing-masing parasetamol dan koffein dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

V. Analisa Data1. Absorbansi coffein dalam coffein pada serapan 273 nm.xy

0,00000,0000

6,00000,3000

8,00000,3990

10,00000,5030

12,00000,5870

14,00000,7000

2. Absorbansi coffein dalam paracetamol pada serapan 243 nm.xy

0,00000,0000

6,00000,0850

8,00000,1070

10,00000,1370

12,00000,1630

14,00000,1910

3. Menghitung daya resap coffein dalam coffein.A = a.b.cA= absorbansia = serapanb = tebal kuvetc = konsentrasi

AAbC

0,30000,050016,0000

0,39900,049918,0000

0,50300,0503110,0000

0,58700,0489112,0000

0,70000,0500114,0000

Nilai a rata-rata = 0,04982

4. Menghitung daya resap coffein dalam paracetamol.A = a.b.cA= absorbansia = serapanb = tebal kuvetc = konsentrasi

AAbc

0,0850,014216,0000

0,10700,013418,0000

0,13700,0137110,0000

0,16300,0136112,0000

0,19100,0136114,0000

Nilai a rata-rata = 0,0137

5. Mencari panjang gelombang optimum pada kurva gabungan.PCT dalam PCT = 0,0737PCT dalam coffein = 0,02259

A total = A coffein + A pct A coff 1 = ax b cx + ay b cy

6. Mencari konsentrasi LOQ coffein.3,48097. Membuat absorbansi menggunakan konsentrasi LOQ.xy

4,00000,2270

6,00000,3000

8,00000,3990

10,00000,5030

12,00000,5870

14,00000,7000

8. Menentukan nilai akurasi.% recovery = Cf/Ca x 100%Cf = konsentrasi yang diperolehCa = konsentrasi yang ditambahkanCfCa% recovery

8,1098101,36%

7,837897,96%

8,0448100,55%

7,877898,46%

7,622895,28%

98,72%

9. Menentukan nilai presisi.Conc. (x yang dibuat)Abs (y)Conc (x)(x-x)2

60,3356,7260,0640

60,3797,6211,3179

60,2855,7200,5670

60,3547,1000.627

60,2595,1981,6256

Rata-rata x= 6,4734,2015

Presisi :SD = = 1,0249RSD = x 100% = = 15,8335%10. Menentukan kadar dalam sampel.Atot= A1+ A2Ket: A1= kofein A2= PCTA1=ax 1. b. cx+ ay 1. b. cy0,602 =0.04982 cx + 0.02259 cy(1)

A2=ax 2. b. cx+ ay 2. b. cy0,797 =0.0137 cx+ 0.0737 cy(2)Eliminasi persamaan 1 dan 20,797 =0.0137 cx+ 0.0737 cyx0.049820,602 =0.04982 cx + 0.02259 cyx0.0137

0,0397065 = 0,00068253 Cx + 0,00367173 Cy0,0082474 = 0,00068253 Cx + 0,00030948 Cy

0,0314591 = 0,0033623 CyCy = 9,3564227 ppm

0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 Cy0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 x 9,35642270,797 = 0,0137 Cx + 0,68956835Cx = 7,8417 ppm

Persentase KadarParacetamol = Coffein =

VI. PembahasanPada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi, akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah paracetamol dan kofein dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali pertemuan.VII. A = a.b.cA = resapanb = daya serapc = konsentrasi (g/L)Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Dibawah ini adalah persamaan Lamber beer:

Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk. Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh konsentrasi 10 um/mL . setelah itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dispektrofotometer didapatkan panjang gelombang maksimum pada kofein 273 nm dan untuk paracetamol 243 nm. Berdasarkan iteratur panjang gelombang kofein adalah 272 nm dan panjang gelombang paracetamol 242 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Lalu gabungkan kedua spektrum paracetamol dan kofein untuk menentukan panjang gelombang optimum. Setelah itu membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi larutan dari larutan induk dengan menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan sebelumnya kami menentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan rumus A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat adalah 4,167 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 16,667 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri konsentrasi larutan yaitu 6,8,10,12,14 ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada panjang gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0497x + 0,001. sehingga diperoleh nilai resapan 0,04982 . Setelah itu kami mencari nilai LOD dan LOQ. Nilai LOD didapat yaitu 1,213 dan nilai LOQ yaitu 3,4809 nilai LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.Selanjutnya kami menghitung parameter validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter adalah untuk menjamin metode analisi yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian sistem. Padapraktikumuntuk menentukan metode validasipenetapan kadarkafein denganmenggunakan spektrofotometer Uv-Vis, yang dilakukan hanya menentukan akurasi dan presisi. Padapercobaan inisampel yangdiperoleh adalahkafein yangberkhasiat sebagai stimulansaraf otak dankardiotonikum. Parameter akurasi merupakan parameter yang digunakan untuk melihat kedekatan hasil uji dengan nilai yang sebenarnya. Syarat nilai akurasi antara 80%-110%. Untuk menentukan nilai akurasi kami membuat lima buah larutan dengan konsentrasi yang sama yaitu 8 ppm. Setelah itu di spektrofotometer uv-vis, dan nilai akurasi yang didapat adalah 98,72 % sehingga dapat dikatakan bahwa nilai perolehan kembali ini memenuhi persyaratan dan hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein dengan spektrofotometri memiliki akurasi yang cukup baik, karena berada pada rentang persyaratan. Sedangkan untuk menentukan nilai presisi, kamu juga membuat lima buah larutan dengan konsentrasi yang sama yaitu 6 ppm. Setelah itu di spektrofotometer Uv Vis. Nilai presisi yang didapat adalah 15,8335 %. Berdasarkan literatur syarat nilai presisi atau RSD adalah < 2 %. Sedangkan pada kelompok kami nilai presisi yang didapt jauh dari syarat yang ditentukan. Sehingga hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein secara spektrofotometri memiliki presisi yang tidak baik atau derajat kesesuaiannya rendah. Ketidaksesuaian ini bisa disebabkan karena kurang teliti dan kurang hati-hati dalam pembuatan larutan konsentrasi, seperti pada saat memipet atau mngambil larutan kurang teliti atau kurang tepat serta peralatan yang digunakan kurang higienis sehingga dikhawatirkan adanya pengotor dalam larutan. Selain itu kami juga melakukan penetapan kadar kofein dan paracetamol. Untuk menenetapkan kadar kofein dan paracetamol kami membuat larutan dengan masing-masing konsentrasi 10 ppm. Setelah itu, ukur serapan pada panjang gelombang optimum dengan spektrofotometer. Untuk menghitung kadar sampel menggunakan nilai regresi linear. Kadar sampel paracetamol adalah 93.564 % sedangkan kadar kofein adalah 78.417 %. Dari hasil perhitungan tersebut kadar paracetamol sangat baik karena mendekati 100%, namun kadar kofein yang didapat cukup baik walaupun tidak terlalu mendekati 100%, kemungkinan hal ini dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam melakukan setiap tahap demi tahap dalam praktikum.

VIII. Kesimpulan dan Saran1. Kesimpulan Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu senyawa obat (paracetamol & kofein) Parameter validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Parameter validasi yang diuji yaitu LOD, LOQ, akurasi dan presisi dengan hasil sebagai berikut:LOD= 1,213 ppmLOQ= 3,4809 ppmAkurasi (%recovery)= 98,72%Presisi (Koefisien Variant)= 15,8335% Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)Kadar PCT yang diperoleh: 93,56%Kadar Coffein yang diperoleh: 78,42%2. Saran Ketelitian dan ketepatan dalam pengerjaan harus diperhatikan benar agar mengurangi faktor kesalahan.